(完整word版)宏基因组测序讲解
完整版)宏基因组测序讲解
完整版)宏基因组测序讲解宏基因组测序的目的是研究藻类物种的分类、与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部、微生物与环境以及与宿主的关系。
宏基因组，也称为微生物环境基因组或元基因组，是由Handelsman等于1998年提出的新名词。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的微生物研究方法。
它通过功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系为研究目的。
一般XXX包括从环境样品中提取基因组DNA，进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组文库是一种重要的研究工具，可以利用转入大肠杆菌中的宏基因组DNA载体，使以前无法研究的不可培养微生物的DNA得到复制、表达，从而进行研究。
所有带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。
对于宏基因组文库的DNA进行分析，有很多分析方法，主要分为表型功能筛选和序列基因型分析两类。
表型功能筛选是利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因，例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。
而序列基因型分析则是对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究，例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。
一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，并尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。
XXX是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的新的微生物研究方法。
它主要通过功能基因筛选和测序分析来研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。
在宏基因组学研究中，样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集是非常关键的步骤。
提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。
宏基因组学
广义的宏基因组：特定环境下所有生物遗传物质的总和 狭义的宏基因组：特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和
宏基因组测序（Metagenomics Next Generation Sequencing,mNGS)
NGS:也称高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。 mNGS:m指宏基因组。mNGS指宏基因组二代测序，以特定环境中整个微生物群落作为研究对象，利 用高通量测序平台进行基因组DNA测序，DNA不需要进行PCR扩增，测序结果具有较好的无偏性， 不仅可以提示微生物群落的物种组成，更能获需段序列分析不依赖 于任何已知序列信息进行筛选。其中以功能筛选法最为常用。
能够直接发现全新的活性物质和功能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子 缺陷：
工作量大,效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
谢谢！请大家批评指正
其前端关键性技术是环境DNA(e DNA)的提取A的提取
直接提取法（原位提取法） 不经过样品中微生物的培养和分离，通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释 放，并对DNA进行纯化。 操作简便、省时、成本低，所获得DNA具有较好的完整性，并能够代表某一生境的微生物群落多样性。 但常会出现细胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题，所以一般需要进一步的 DNA纯化处理，同时所提取获得的DNA片段较用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来，再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物 细胞提取DNA。 该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较少，纯度较高、DNA完整性好(20kb~大、DNA得率较低，其产率只是直接裂解法的1%~10%,且获得的DNA往 往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。
(完整版)宏基因组测序讲解
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组测序
宏基因组测序环境中超过99%的微生物是不可培养的，很多致力于研究微生物多样性的努力由于培养方法的限制而受到制约，为了克服由培养技术所带来的困难和限制，多种以DNA为基础的分子生物学的方法已经被开发。
目前16s rDNA测序可以提供大量关于环境微生物的群落及种类信息，但是在种群中不同微生物的作用以及其携带的基因组信息基本不能体现出来。
相比之下，宏基因组是一种新的，可用于快速分析微生物复杂基因组的方法，它提取环境中的全基因组DNA，构建DNA文库并进行高通量测序。
对数据进行分析，不仅能够获得环境中微生物的组成及丰度信息，还可以通过相关功能及代谢通路注释，获得这些微生物全面的微生物基因组信息，以及在环境中可能的功能。
技术参数样品准备测序策略推荐数据周期3ug DNA 300bp DNA文库HiSeq PE150测序一般测序数据量：5Gb clean data大测序数据量：10Gb clean data40个工作日建库方法技术流程技术特点（1）无需分离培养，直接提取样本DNA测序；（2）群落多样性、种群结构、进化关系、功能组成、相互协作关系等多种分析；（3）高效、高通量，一次性获取样本中所有微生物组成等信息。
部分结果展示进化树分析OTU维恩图抗生素类型统计图案例解析排泄物微生物宏基因组可作为结直肠癌标志物为了评估利用排泄物诊断结直肠癌的可行性，作者对来自于中国的74个结直肠癌患者和54个健康人的粪便样本进行宏基因组测序，发现除了已经证实的与结直肠癌相关的具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）和消化链球菌（Peptostreptococcus stomatis）之外，微小微单胞菌（Parvimonas micra）和口臭致病菌（Solobacterium moorei）也与结直肠癌具有显著相关性。
作者随后选择了20个微生物基因标志物，通过q-PCR发现，来自于具核梭杆菌的丁酰coA脱氢酶和来自于微小微单胞菌的RNA聚合酶亚基β在患者的粪便微生物的基因组中高度表达；利用这两个基因可以准确区分患有结直肠癌的患者和健康人群。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16sDNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
宏基因组三代测序原理
宏基因组三代测序原理
宏基因组三代测序技术是指单分子测序技术，对于DNA 样本不需要经过PCR 扩增，实现了对每一条DNA 分子的单独测序。
其基本原理为：当DNA 模板被聚合酶捕获后，4 种不同荧光标记的dNTP 通过布朗运动随机进入检测区域并与聚合酶结合，与模板匹配的碱基生成化学键的时间远远长于其他碱基停留的时间。
因此统计荧光信号存在时间的长短，可区分匹配的碱基与游离碱基。
通过统计4 种荧光信号与时间的关系，即可测定DNA 模板序列。
宏基因组三代测序技术在针对二代测序范围外的复杂基因突变类型进行测序方面具有独特优势，可用于肠道微生物研究等领域。
宏基因组测序原理
宏基因组测序原理宏基因组测序是一种用于分析微生物群落中所有微生物的基因组信息的技术。
在过去的几十年里，宏基因组测序技术已经取得了长足的进步，成为了研究微生物生态系统的重要工具。
它可以帮助科学家们更好地理解微生物在自然环境中的分布、功能和相互作用，对环境保护、医学和工业等领域具有重要意义。
宏基因组测序的原理主要包括样品采集、DNA提取、DNA文库构建、高通量测序和生物信息学分析等几个步骤。
首先，样品采集是宏基因组测序的第一步。
在采集样品时，需要考虑到样品的来源、保存条件和采集方法等因素，以确保获得的样品能够准确地反映微生物群落的真实情况。
其次，DNA提取是宏基因组测序的关键步骤之一。
通过DNA提取，可以从样品中提取出微生物的总DNA，为后续的文库构建和测序分析奠定基础。
接下来，DNA文库构建是宏基因组测序的重要环节。
在文库构建过程中，需要将提取得到的DNA样品进行裂解、末端修复、连接适配体、文库扩增等多个步骤，最终构建成适合高通量测序的文库。
然后，高通量测序是宏基因组测序的核心技术之一。
通过高通量测序，可以对文库中的DNA进行大规模、高效率的测序，获得大量的序列数据。
最后，生物信息学分析是宏基因组测序的最后一步。
通过生物信息学分析，可以对测序获得的数据进行序列拼接、物种注释、功能预测等多方面的分析，从而获得微生物群落的组成结构、功能特征等信息。
总的来说，宏基因组测序是一种综合性的技术，需要多个步骤的有机配合才能完成。
它的原理简单清晰，但在实际操作中需要科学家们高度的技术功底和丰富的实践经验。
随着技术的不断进步，相信宏基因组测序技术将会在微生物生态学、环境科学、医学和工业等领域发挥越来越重要的作用。
微生物检测之16S与宏基因组测序mNGS
微生物检测之16S与宏基因组测序mNGS微生物检测16S与宏基因组测序mNGS2022年3月1日目录CONTENTS1微生物基本概念2微生物常见检测方法316S测序4宏基因组测序第一节微生物基本概念微生物基本概念微生物（Microbe/micro-organism）微生物(microorganism,microbe)是一些肉眼看不见的微小生物的总称。
包括属于原核类的细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体和蓝细菌(过去称蓝藻或蓝绿藻)，属于真核类的真菌(酵母菌和霉菌)、原生动物和显微藻类，以及属于非细胞类的病毒、类病毒和肮病毒等。
种群（Population）种群(population)指同一时间生活在一定自然区域内，同种生物的所有个体共位群（Guild）共位群(guild):在代谢关系上相关的种群群落（Community）微生物群落(community):是指在一定区域里或一定生境里，各种微生物种群相互松散结合，或有组织紧凑结合的种群结构单位。
多组共位群相互.作用形成的群体。
生态系统（Ecosystem）微生物生态系统是各种环境因子如物理、化学及生物因子对微生物区系（及自然群体）的作用，以及微生物区系对外界环境的反作用微生物组与元基因组微生物组（Microbiome）微生物组指的是包括微生物（细菌、古细菌、低等或高等真核生物和病毒）的基因组（基因），以及其周围环境在内的全部元基因组(Metagenome):某个环境中所有微生物的遗传物质。
微生物组学微生物组(Microbiome)的特点是结合了宏基因组学、代谢组学、宏转录组学、以及宏蛋白组学等和临床/环境数据的集合Metabolomics代谢组学用来确定给定菌株或单个组织代谢物特征的分析方法。
给定菌株和单个组织内存在的所有代谢物统称为代谢组（metabolome）。
大多数用来描述代谢组的平台包括核磁共振（NMR）、质谱(MS)与液相色谱(liquidchromatography)联合分离系统Metatranscriptomics宏转录组学通过对微生物群落中的表达的RNAs(meta-RNAs)，采用进行高通量测序分析相应的meta-cDNA。
宏基因组测序
宏基因组测序1宏基因组研究概况宏基因组学（Metagenomics，又称元基因组学）这一概念最早在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出，随后伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter将宏基因组定义为：应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株的科学。
鉴于环境中99%的微生物不可培养，宏基因组无需进行微生物分离操作的技术特点打破了传统微生物学基于纯培养研究的限制，为充分认识全球和人体范围内微生物和开发利用未培养微生物，并从完整的群落水平上研究微生物的活动和发掘潜在功能提供了可能。
传统的宏基因组学研究通过直接从环境样本中提取DNA，构建DNA克隆载体的宏基因组文库，并利用基于核酸序列差异分析、克隆子的特殊代谢活性、底物诱导基因的表达和（或）稳定同位素和荧光原位杂交等技术对宏基因组文库进行筛选和分析，从而有效地利用环境中丰富的微生物资源和挖掘新的特殊功能代谢物。
在宏基因组学研究的发展前沿中，核酸测序技术测序速度和通量的增长引人注目。
在下一代测序技术（NGS，又称第二代高通量测序技术）出现之前，基于宏基因组测序的核酸序列差异分析通常使用Sanger测序（主要基于双脱氧核苷酸链终止反应）方法，对宏基因组克隆文库或功能扩增子进行测序，来研究环境中微生物群落多样性及功能特征。
但Sanger测序方法通量较小、测序周期较长且价格昂贵。
随着新一代测序技术的迅猛发展以及广泛应用，宏基因组测序的方法也发生了翻天覆地的变化，目前科学家们可以对环境中的微生物全部基因组进行测序，在获得海量的数据后，全面地分析微生物群落结构以及基因功能组成，了解微生物如何耐受极端环境，发觉新的生物资源并探索微生物与环境间的相互作用。
下一代测序方法使用了几种不同的高通量平台，最先使用的是基于焦磷酸聚合酶乳液的RocheGS20 454测序仪（又称焦磷酸测序仪）。
宏基因组测序讲解
或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组研究将使人们摆脱物种界限，揭示更高更复杂层次上的生命运动
在目前的基因结构功能认识和基因操作技术背景下，细菌宏基因组细菌多样性。如宏基因组
并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。一般
DNA 的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆[17]equence based screening)两种方法。
宏基因组学的研究步骤
一般包括从环境样品中提取基因组DNA，克隆DNA 到
蛋白等的试剂盒，在食品工业、NA构建
模式微生物并不能把所
DNA表达出来，降低了表型筛选的效率。宏基因组表型筛选的效率
从上万个克隆中一般只能筛选到几个有用的克隆。这表明宏基因组学的提
但受限于技术瓶颈，还未在实际工作中产生理论
DNA提取方法的改进[68]。
(细胞提取法)。直接裂解法是将
继而抽提纯化，包括物理法(如冻融法、
)和化学法、酶法等。不同直接裂解法的
此法操作容易、成本低、DNA提取率高、
但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(1-50kb)，难以
DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，
DNA。此法可获得大片段
4个步骤。特别要指出的是，在基
其研究目标通常是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因
(community)的混合基因组序
这种差别的关键就பைடு நூலகம்，绝大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材
分离特定环境生物DNA
DNA的做法，而是首先直接收集能
然后利用各种理化方法破碎微生物，使
DNA，再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。
宏转录组测序流程-概述说明以及解释
宏转录组测序流程-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述宏转录组测序是一种高通量的技术，可以同时检测样本中的所有转录本，从而了解基因表达的全貌。
它在生物学研究、疾病诊断和药物开发等领域具有重要的应用价值。
随着测序技术的不断发展和成本的降低，宏转录组测序已经成为研究基因表达的重要方法之一。
相比传统的基因表达分析方法，宏转录组测序具有高通量、高灵敏度、高准确性的特点，可以同时分析成千上万个基因的表达情况。
通过宏转录组测序，我们可以全面了解一个生物样本中的转录组信息，包括哪些基因被表达、不同基因的表达水平以及表达的调控网络等。
通过对不同样本的转录组数据进行比较分析，我们可以发现与某种生理状态或疾病相关的基因，找出潜在的治疗靶点或疾病生物标志物。
宏转录组测序的流程包括样本准备、RNA提取、cDNA合成、文库构建、测序和数据分析等多个步骤。
其中，样本准备和RNA提取是关键的步骤，不同的样本来源和实验目的需要不同的处理方法。
cDNA合成和文库构建是将RNA转录本转化为测序可读的DNA片段的关键步骤，文库的质量将直接影响后续测序的准确性和可靠性。
测序和数据分析是宏转录组测序的关键环节，选择适当的测序平台和对测序数据进行准确的比对和差异表达分析是确保数据质量和研究结果可靠性的重要步骤。
通过宏转录组测序，我们可以更全面地了解基因的表达调控网络，在生物学研究和医学诊断中具有广阔的应用前景。
然而，宏转录组测序仍然面临着一些挑战，如数据分析的复杂性、样本的准备和RNA提取的高标准要求等。
随着技术的进一步发展和改进，相信宏转录组测序将会在基因表达研究中发挥越来越重要的作用。
1.2 文章结构文章结构是指文章的组织架构和章节安排。
一个良好的文章结构可以帮助读者更好地理解文章的内容，并使文章逻辑清晰、条理分明。
本文将围绕宏转录组测序流程展开，分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分主要包括概述、文章结构和目的三个方面。
在概述中，我们将简要介绍什么是宏转录组测序以及其在生物科研领域中的重要性。
宏基因组测序及分析
宏基因组测序及分析宏基因组测序及分析是一种用于研究多种微生物群落中的所有基因的方法。
与传统的小基因组测序方法不同，宏基因组测序涉及到从环境样品中提取DNA并进行测序，以获得整个微生物群落的基因信息。
宏基因组测序的目的是了解不同微生物在特定环境中的功能、结构和相互关系，为我们进一步研究微生物的生态系统功能和微生物群落的组成提供重要的信息。
16SrRNA基因测序是一种广泛应用的技术，用于研究微生物群落的组成和结构。
16SrRNA基因是细菌和古菌中高度保守的基因，它具有多个高度保守的区域和变异的区域。
通过测序这些特征区域，我们可以识别细菌和古菌的分类和亲缘关系。
通过分析16SrRNA基因序列的方法，我们可以了解微生物群落的多样性和物种组成。
这种方法使我们能够在环境中准确鉴定微生物，并研究它们在不同环境中的生态功能。
元转录组测序是一种用于研究微生物群落在特定环境条件下的功能和活动的方法。
元转录组测序可以提供有关微生物在特定环境条件下活跃的基因和产生的蛋白质信息。
通过测序环境样品中的RNA转录产物，我们可以测定微生物在特定环境条件下的基因表达情况。
这种方法可以帮助我们了解微生物在不同环境中的功能和适应策略，以及它们如何参与环境过程和生态系统功能。
宏基因组测序及其分析可以应用于多个领域，包括环境微生物学、人类肠道微生物组学、食品安全和重要农作物的微生物组学等。
通过研究不同环境中微生物群落的组成和功能，我们可以了解微生物的生态学角色，并且可以应用这些知识来改善环境管理、人类健康和生态系统保护。
总之，宏基因组测序及分析是一种强大的工具，可以帮助我们揭示微生物群落的多样性、结构和功能。
这项技术在许多领域有着广泛的应用，为我们了解微生物的生态学角色和环境生态系统功能提供了重要的信息。
随着技术的不断发展和成熟，宏基因组测序及分析将在未来得到更加广泛的应用和重要性。
宏基因组测序技术检测方法
简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = ， 260/230 = ，电泳检测DNA 应是完整的一条带。
宏基因组二代测序报告、标本类型、送检保存要求、标本运输、内容解释及微生物致病概率分级
送检mNGS宏基因组二代测序报告情况、标本类型、送检保存要求、标本运输要求、测序情况、内容解释、微生物致病概率分级及解读宏基因组二代测序(mNGS) 是基于核酸检测的微生物鉴定技术其非预设性、高通量等优点而得到广泛应用。
下呼吸道感染主要包括社区获得性肺炎、医院获得性肺炎、免疫抑制宿主肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管扩张症合并感染等类型，临床表现多样，感染微生物种类复杂，感染和定植鉴别困难，加之mNGS 技术本身存在的局限性，mNGS 诊断效力的发挥有赖于选择恰当患者、采用适宜标本以及进行合理解读。
需送检mNGS情况(1) 免疫抑制宿主疑似发生LRTI 且临床表现提示非CAP 常见病原微生物所致者；(2) LRTI 患者发病初期即出现需要使用血管活性药物的感染性休克、需要有创机械通气的呼吸衰竭、多脏器功能不全等危及生命的状况时；LRTI 经规范经验性抗感染治疗48—72 h 后，感染症状仍持续加重或影像学快速进展者；(3) 聚集性发病疑似具有传染性、但无法明确病原体的LRTI；有特殊病史且经验性治疗无效，病情较为严重的LRTI；临床考虑特殊病原体(感染且病势迅疾或迁延者，常规培养困难或所在医疗机构无法提供可靠的传统检测方案时；(4) 患者有LRTI 症状或影像表现，经规范抗感染治疗后病灶吸收延迟、病程迁延，需鉴别是否由非感染性疾病所致，可以在常规病原微生物检测、感染生物标志物、病理等相关检查同时送检mNGS 以帮助鉴别诊断。
不建议送检 mNGS情况(1) 免疫功能健全宿主罹患LRTI（包括重症肺炎)，经过规范的经验性抗感染治疗病情已好转；(2) LRTI 已通过其他方法获得病原学结果，与临床特点相符，或针对性治疗有效；(3) 无法获取优质标本。
mNGS 标本类型在LRTI 的病原微生物诊断中，可用于mNGS 检测的标本包括痰(含诱导痰)、气管吸引物、支气管肺泡灌洗液（BALF）、经支气管肺活检（TBLB）标本、经支气管内超声（EBUS）活检标本、经皮肺穿刺活检标本、血液等。
宏基因组测序及分析
研究思路
瘘管奶牛牛
将柳枝稷样品置于牛牛的瘤胃中培 养72小小时，然后对附着在柳枝稷 样品上的所有微生生物进行行基因组 分析。
Illumina GAIIx ＋Illumina HiSeq2000 测序建库：200,300,3k,5k 双端测序：2*125、2*200、2*75
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研究结果
总共识别了27,755 与碳水水化合水水物绑定模块或具有催化功能的候选基因
物种组成16s18sits10代谢通路分析物信息分析三基因功能分析11cog注释cazyme注释物信息分析三基因功能分析12物信息分析四个性化分析基于筛选因对样品进聚类分析13什么是宏基因组研究宏基因组研究的分析流程宏基因组研究的相关应用14研究案例science
迪康金金诺NGS应用用交流会
宏基因组研究在肠道微生生物中的最新研究应用用
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研究案例（三）
Gut：运动可能增加肠道菌群多样性 背景：研究表明，肠道菌群多样 性的减少与肥胖及其他健康问题 相关，而而肠道菌群多样性的增加 则有利于新陈代谢和免疫。
运动可能对肠道菌群的多样性产 生生有益影响。
Clarke, S.F., et al., Exercise and associated dietary extremes impact on gut microbial diversity. Gut, 2014.
22
研究思路
平均身身体质量指数（BMI），用用于衡量体重指标，运动员组被试的平均身身体质 量指数（BMI）是29.1
样本收集：
40名专业橄榄球运动员；此外还有23名是正常BMI组（BMI≤25），23名 则属于高高BMI组（BMI≥28）46个样本作为对照组。(肠道样本和血血液样本)
宏基因组测序及分析
宏基因组测序及分析在样品收集和处理阶段，我们需要根据研究目的选择合适的样品类型，并进行必要的处理，如过滤、离心等，以去除样品中的杂质。
DNA提取是宏基因组测序的关键步骤之一，它是将微生物样品中的DNA提取出来。
有许多不同的DNA提取方法，包括机械破碎法、化学溶解法等。
选择合适的提取方法能够最大限度地提取到目标微生物的DNA，并减少宿主DNA的污染。
测序样本库制备是为了将DNA样品转化为高通量测序所需的文库，并对其进行放大、纯化等步骤。
根据实验要求，我们可以选择不同的文库构建方法，如16SrRNA基因文库、全基因组文库等。
DNA测序是宏基因组测序中的关键一步，它使用高通量测序平台（如Illumina MiSeq、Ion Torrent等）对文库进行测序。
这些平台能够同时测序多个样品，从而减少了测序时间和成本。
数据分析是宏基因组测序的核心步骤，它包括对测序数据进行质量控制、数据过滤、序列比对、OTU聚类（操作税的单元，Operational Taxonomic Unit）等分析。
通过这些分析，我们可以了解样品中微生物的群体结构、物种多样性及其功能。
宏基因组测序及分析在许多领域都有广泛的应用。
例如，在环境科学中，它可以用于研究土壤中微生物的功能，揭示微生物对土壤质量和养分循环的贡献；在医学领域，它可以研究肠道微生物群落与人类健康之间的关系，为疾病的诊断和治疗提供新的思路。
总之，宏基因组测序及分析为我们认识微生物世界提供了全新的视角，通过揭示微生物群体的组成和功能，帮助我们更好地理解生态系统的结构和功能。
随着测序技术的不断发展，相信它将在更多的领域中发挥重要作用。
宏基因组测序简介(发布版)
普及程度较低：认知和接受程度不足，检测结果的科学判读证据与逻辑尚待证实。 耐药和突变的鉴定：病原序列在总测序序列中含量极低，难以进行基因水平的鉴定。 流程标准化：缺少统一标准。 检测准确性：报告中含多种病原信息，夹杂背景病原，需更准确的病原鉴定算法和更快的鉴定速度。 结果数据复杂。 污染：宿主核酸、污染物核酸。 耗时：测序流程耗时过长。
用分布。
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最早的宏基因组应用——环境宏基因组[14-15]
11
2008年——死后查因[16]
临床宏基因组应用先锋
2014年——首例临床，免死诊断[17]
2019年——病前预测[18]
3个病人在同一天接受同一个捐献者 的器官移植。在移植后4~6周均出现 发热后去世。
培养、PCR、血清学筛查、芯片检测 均为发现有用信息。
核酸提取方法
没有充分破壁可能会使一些细菌的检测变得困难（DNA没有充分释放）。样本量小会降不包括片段化的病原体基因组；仅靠DNA测序不能检测到RNA病毒。
测序方法
深度不足难以检测低丰度物种。同一测序过程中的样本之间可能会发生污染。与单端barcode相比，双端barcode可降低污 染。
• 中枢神经系统； • 呼吸系统； • 消化系统； • 骨骼肌系统； • 视觉系统； • 血液循环系统； • 肝胆系统； • 泌尿系统； • 皮肤； • 其他。
B. 临床宏基因组研究的增长情况： C. mNGS研究在不同国家的分布情况； D. mNGS使用的技术平台分布； E. mNGS在不同感染疾病诊断中的应
低（或无）致病性病原体（定植菌等）独立呈现。
土壤微生物宏基因组测序方法及原理
土壤微生物宏基因组测序方法及原理下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
特定生物种基因组研究使人们的认识单元实现了从单一基因到基因集合的转变，宏基因组研究将使人们摆脱物种界限，揭示更高更复杂层次上的生命运动规律。
在目前的基因结构功能认识和基因操作技术背景下，细菌宏基因组成为研究和开发的主要对象。
细菌宏基因组细菌人工染色体文库筛选和基因系统学分析使研究者能更有效地开发细菌基因资源，更深入地洞察细菌多样性。
如宏基因组成为生物催化剂的新来源。
宏基因组学研究的策略和基本过程研究策略“宏基因组学”是一种整体性的研究策略，它建立在微生物基因组学的迅速发展和聚合酶链式反应广泛应用的基础之上，是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术，涵盖了生物信息统计分析和基因组两方面的意义和技术，其策略是从特定环境中直接分离所有微生物DNA，将大片段的DNA克隆到受体菌中表达，然后根据某些生物活性筛选有应用价值的克隆。
包括两个方面[920]：①宏基因组文库的构建：宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。
一般包括样品总DNA 的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆[17]。
②宏基因组文库的筛选：根据其研究目的，宏基因组文库筛选通常有功能筛选(functional screening)和序列筛选(sequence based screening)两种方法。
2宏基因组学的研究步骤基因组学的研究过程，一般包括从环境样品中提取基因组DNA，克隆DNA 到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的克隆等4个步骤。
特别要指出的是，在基因组学研究领域中，其研究目标通常是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因组学中，则是要测定由多种微生物组成的复杂群体(community)的混合基因组序列。
这种差别的关键就是，绝大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材料。
2.1 分离特定环境生物DNA方法上不同于传统的先培养微生物再提取DNA的做法，而是首先直接收集能够代表特定生物环境生物多样性的样品；然后利用各种理化方法破碎微生物，使其释放DNA，再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。
2.2 纯化的大分子量DNA进行克隆在对DNA 酶切或者超声打断处理，并与合适的载体DNA 进行连接，构建重组体。
2.3 将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转入模式微生物建立各自的无性繁殖系例如转入大肠埃希菌中，使那些以前无法研究的不可培养微生物的DNA 在模式微生物中得到复制、表达，进而得到研究。
所有带有宏基因组DNA 载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。
2.4 对宏基因组文库的DNA 进行分析基于不同的研究目的，有很多分析方法，主要分为两类：一类为表型功能筛选，即利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因。
例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。
功能分析法根据重组克隆产生的新活性进行筛选，可用于检测编码新型酶的全部新基因或者获取新的生物活性物质。
另一类为序列基因型分析，即对文库中所有或部分的DNA 进行测序分析，以应用于生态学研究。
例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。
一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，及尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。
3 宏基因组学的技术方法宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组学的研究策略和方法大致相同，现按照宏基因组学研究的基本过程和策略对常用方法和技术予以简要介绍。
3.1 样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，尽可能代表自然状态下的微生物原貌，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。
要采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇[45]。
所以总的提取总是在最大提取量和最小剪切力之间折中。
应严格操作，谨防污染，并且保持DNA 片段的完整和纯度。
已有许多商品化宏基因组DNA提取试剂盒可用，同时很多实验室仍致力于宏基因组DNA提取方法的改进[68]。
常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法(细胞提取法)。
直接裂解法是将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，继而抽提纯化，包括物理法(如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法等)和化学法、酶法等。
不同直接裂解法的提取方法差别在于细胞破壁的方式不同。
此法操作容易、成本低、DNA提取率高、重复性好，但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(1-50kb)，难以完全去除酚类物质。
细胞提取法先采用物理方法将微生物细胞从环境中分离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。
此法可获得大片段DNA(20-500kb)且纯度高，但操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物DNA也不容易抽提出来。
为了更好地反映环境中的微生物种群并且提高阳性克隆的占有率，需要在克隆之前通过不同的方法对感兴趣的目的基因或基因组进行富集[911]，一个比较好的富集方法是稳定同位素示踪技术[12]。
抑制性消减杂交技术[13]是抑制性与消减杂交技术相结合的更简单、更快速的分离差异基因的方法。
该方法不仅利用了消减杂交技术的消减富集，同时也利用了抑制性技术进行了高效率的动力学富集，所以该技术是一项富集特定基因、证实微生物之间基因不同的非常有用的技术方法。
3.2 宏基因组文库的建立宏基因组文库的构建策略取决于研究的整体目标。
偏重于低拷贝、低丰度基因还是高拷贝、高丰度基因要取决于研究的目的是单个基因或基因产物还是整个操纵子及编码不同代谢途径的基因簇。
基因文库的建立过程中需要选择合适的克隆载体和宿主菌株。
传统的方法是直接利用表达载体构建宏基因文库，但是表达载体可插人的宏基因片段一般小于10kb。
克隆中宿主菌株的选择主要考虑到转化效率、宏基因的表达、重组载体在宿主细胞中的稳定性以及目标性状的筛选等。
目前大肠杆菌是最为常用的宿主[14]，此外，链霉菌和假单胞菌也可以作为构建文库的宿主，不同微生物种类所产生的活性物质有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。
3.3 宏基因组文库的筛选由于环境基因组的高度复杂性，需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的有用基因。
筛选技术大致可分为四类:①基于核酸序列差异分析；②基于目的克隆功能的特殊代谢活性；③基于底物诱导基因的表达；④基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其他技术。
.3.1 基于序列的筛选方法通常根据已知相关功能基因的保守序列设计探针或PCR引物，通过杂交或PCR扩增筛选阳性克隆。
用这种方法有可能筛选到某一类与已知序列相近的新基因，这一策略可以分离已知基因家族的新成员和含有高度保守区的酶基因[15 16]。
另一种方法是对含有16S rRNA等系统进化锚定基因的克隆进行测序或对文库随机测序[17]。
优点是不必依赖宿主菌株来表达克隆基因，缺点是必须对相关基因序列有一定的了解，文库中那些和现有基因序列完全不一样的基因无法被筛选，故难以发现全新的活性物质，对鉴定新的基因成员有一定的局限性，也很难获得全序列。
直接序列分析法(sequence driven screening method)是对所构建宏基因组文库的克隆进行随机测序分析，显然可以得到最多的信息[1820]。
也可用鸟枪法对宏基因组文库进行测序，但需要进行大量的测序和分析工作，需大量人力、物力及财力。
虽然DNA序列分析技术不断发展，但与个体微生物基因相比，宏基因组文库包含着巨大的序列片段，但对这些序列片段进行后续的分析则极为困难，结合其他的筛选方法可以得到更多的信息。
用微阵列技术(基因芯片)进行初步筛选，可以很大程度上减少测序量和后续的序列拼接等工作量。
但微阵列技术在用于宏基因组文库筛选时，除了其本身由于交互杂交等导致的特异性低、灵敏度较差等缺点外，同样不能用于对未知功能基因的筛选，且检测不到环境中存在的那些低丰度微生物的序列[2122]。
3.3.2 基于功能的筛选方法功能性筛选法是以活性测定为基础，通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆，然后通过序列和生化分析研究这些克隆。