共聚焦激光扫描荧光显微镜 简介以及原理

• 1.点照明（为作图方便已将光线发散角放大）
假设是场照明（非共聚焦），会导致： 一.发生衍射，使像模糊； 二.散射光干扰（即除了成像点外，其余 点处有散射光进入探测针孔）； 而点照明则不会有这些问题。
消除衍射影响
消除背景杂光
• 2.焦平面点成像
• 焦平面上的像是最清晰的，从上面的图可 以看出，非焦平面点所成 的像的光像被探 测针孔挡住，不会进入光探头，所以焦平 面点成像使像更清晰。
• 一、基本组成 • （一）激光器:多线氩离子(458 nm, 488 nm, 514 nm) 、 氦氖绿(543nm)、氦氖红(633 nm) • （二）扫描器(内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单 色器及检测器) • （三）光学装置：根据样品中荧光信号的强弱、大小及 分布，调节激光能量、检测孔光栏、光电倍增管（PMT） 的检测范围、物镜和电子放大倍数（zoom），以利于采 集各种荧光信号。 • （四）计算机图像存储与处理及控制系统：实现了图像 的优化、三维重建，实现了全自动程序化控制采集（检 测）样品荧光图像的时间和空间，并和同时采集样品中 多重荧光信号的分解及合成图像，对其进行定量测定。
所以共聚焦成像方式可以很大的 提高分辨率和成像质量。
• 一. X—Y轴扫描 • 二. Z轴扫描
• （1）单光束扫描模式
• 其中最常见的扫描安排结合了两个独立的 扫描镜，具有中继光学系统。移动的垂直 轴的反射镜即在试样上产生X—Y平面的扫 描。但中间需要增加高级别的像差校正光 学系统，导致发光效率降低。
共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置
Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置 Computer
计算机
Microscope荧 光显微镜
Laser and electronic Control Unit
激光光源及 控制装置
Anti-vibration table 防震台
• （2）多光束扫描
• 奥林巴斯Fluo View300 激光共聚焦扫描系统
强度调整密度塔
激发发 射和射 柱准直 仪
光电倍增器 电源 双色镜 X-Y检流计镜扫描 控制器
激发和 发射滤 波滑动 器
பைடு நூலகம்
出入口透 镜系统
同样可以实现 X—Z轴，Y—Z轴扫描
• 通常的方法是通过计算机控制的马达以预 先设定的步距移动显微镜的镜台然后采集 图像。 • （当然也有通过改变焦平面位置的方法）
488nm 520nm
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。 阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
450nm 490nm
FITC
荧光显微镜的不足:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多 重荧光的同时采集及共定位。 2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。 5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧光强度不够。 6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度 重叠 7.只能在二维环境下观察。 8.样品不能太厚。 9.荧光的串绕无法回避。 10.放大倍率小。
488nm 520nm
荧光显微镜
二、荧光显微镜术的基本原理
高 压 汞 灯
滤镜 分光
被荧光 紫外 激发 探针染 蓝 色的生 绿 物样本
光学 成像
被标记 结构的 荧光光 学图像
激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。
带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490 长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490
• • • •
一.分辨率（0.1 8μm） 二.可重构样品的三维结构 三.无损伤、连续光学切片 四.光谱扫描
（分辨由光源波长，物镜参数和针孔直径等 决定，如60X，NA1.4的物镜水平分辨率约为 0.2 μm，垂直分辨率约为0.5μm。） （细菌细胞1-2 μm，原核生物细胞1-10 μm）
• 利用照明针孔和探测针孔实现点照明和探 测，并且被探测点位于焦平面。照明针孔 与探测针孔对被照射点或被探测点来说是 共轭的，因此被探测点即共焦点。
共聚焦激光扫描荧光显微镜
什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？
共聚焦激光扫描荧光显微镜 （LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ） 以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技
术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显 微镜系统
共聚焦系统 细胞CT
• 通过精细平面光切，形成生物样品不同平 面的精细图象，将一个连续的光切图象Z轴 重叠就可形成一个完整的三维图象
• 切片的厚度受物镜的数值孔径和针孔直径 影响，比如60X，NA1.4的镜头当针孔设定 为1mm时，光学切片厚度为0.4微米。
光电倍增管 扫瞄装置
共焦针孔
空气冷却氩激光器
屏障滤光片(
• （1）单光束扫描模式
• （2）多光束扫描（尼普可夫圆盘扫描） • 多光束扫描技术提供了一个替代的单光束扫描 配置照明效率低，而且扫描速度更快。其中旋 转盘扫描仪有数百个孔，其功能作为照明和探 测的针孔。由于磁盘扫描显微镜形成的实像， 可以直接位于CCD照相机的图像平面中。尽管 这方面的优势，它允许实时聚焦和成像的动态 过程，有几个缺点限制了磁盘扫描共聚焦系统 的实际效用。其中最严重的是典型的依赖于传 统的广谱光源，和在磁盘发生极端的光损失。
Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System
• Nikon的 Eclipse C1 Plus
• 1.性能卓越的平场复消色差TIRF物镜（ 60x ， 100x）， NA = 1.49.。这是当前数值孔径最 高的油浸物镜 • 2.四孔位针孔转盘：用电脑控制针孔的大小， 可在分辨率和光切厚度之间取得最佳平衡。 • 3.时间间隔可变的Time Lapse: 可以在拍摄过 程中不同的时间段采用不同的时间间隔。
激发光滤器 检流计
物镜
谢谢！
荧光和荧光显微镜
一、荧光的基础术语
荧光物质： 某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出 波长比照射光长的光线 — 荧光。受激发后能产生 荧光的物质称荧光物质或荧光素 激发光(EXCITATION)： 能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的 光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸 收波峰(最大吸收波长) 发射光(EMISSION): 异硫氰酸荧光素(FITC) 发射光谱；发射波峰(最大发射波长) 荧光探针： 能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体） 自发荧光(AUTOFLUORESCENCE): 组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。 漂白(BLEACH)： 荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 — 漂白。