海岸带沉积物中氮循环功能微生物多样性

生物多样性 2013, 21 (4): 433–444 Doi: 10.3724/SP.J.1003.2013.12027 Biodiversity Science http: //
——————————————————
收稿日期: 2013-01-30; 接受日期: 2013-05-06
基金项目: 中科院重要方向性项目(No. KZCX2-YW-JC203; KSCX2-EW-G-12B)、国家自然科学基金项目(No. 41206155)和山东省自然科学杰出青年基金(JQ201210) ∗
通讯作者 Author for correspondence. E-mail: jgong@
海岸带沉积物中氮循环功能微生物多样性
龚 骏1* 宋延静1,2 张晓黎1
1 (中国科学院烟台海岸带研究所微生物生态与物质循环实验室, 山东烟台 264003)
2 (中国科学院大学, 北京 100049)
摘要: 海岸带生境类型多样, 环境梯度明显, 是研究微生物多样性、群落结构与功能关系及调控机制的天然实验场。

沉积物是海岸带环境中营养盐再生与转化发生的重要场所, 其中多种微生物类群在氮素循环过程中扮演重要角色。

本文重点介绍海岸带沉积物中固氮菌、氨氧化菌、厌氧氨氧化菌、反硝化与硝酸盐铵化微生物的基于16S rRNA 基因的物种多样性和基于关键酶基因nifH 、amoA 、narG 、nirS 、nirK 、nosZ 、nrfA 、hzo 、hzs 等的功能多样性; 总结了在海岸带特有生境(如河口、潮间带、海草藻床、红树林、盐沼、珊瑚礁、浅海等)及污染胁迫、生物扰动等条件下各功能类群的群落组成特征及时空变化规律, 并提出今后需要重点关注新的培养技术和方法的开发, 以进一步提高微生物的可培养性, 将单细胞基因组测序与分析技术、DNA 和RNA 结合起来研究, 以全面了解氮循环微生物多样性、参与介导硝酸盐铵化过程的微生物多样性等方面。

关键词: 分子生态, 功能基因多样性, 海洋底栖生物, 群落组成, 物种多样性, 系统分类
Phylogenetic and functional diversity of nitrogen cycling microbes in coastal sediments
Jun Gong 1*, Yanjing Song 1,2, Xiaoli Zhang 1
1 Laboratory of Microbial Ecology and Matter Cycles, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai, Shandong 264003
2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049
Abstract: The coastal zone contains diverse habitats which are usually characterized by strong environ-mental gradients (e.g. salinity, nutrients and pollutants). This makes the coastal zone an ideal experimental laboratory for describing microbial diversity and testing hypotheses on community structure, function and control. Coastal sediment is of significance in nutrient regeneration and transformation involving different assemblages of microbes in the nitrogen cycle. This review focuses on 16S rRNA gene-based phylogenetic diversity and the key enzyme encoding gene-based (e.g. nifH , amoA , narG , nirS , nirK , nosZ , nrfA , hzo and hzs ) functional diversity of nitrogen fixing, ammonia oxidizing and anaerobic ammonia oxidation (Anam-mox) bacteria as well as bacteria and fungi involved in denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA). Characteristics of community composition and diversity of nitrogen cycling microbes in different habitats (e.g. estuarine, intertidal flats, seagrass or seaweed beds, mangroves, salt marsh, coral reefs, and shallow seas), and their spatiotemporal patterns under benthic pollution or bioturbation are re-viewed. Future directions for a better understanding diversity of nitrogen cycling microbes are suggested, such as culture methods and technologies, and single-cell sequencing, etc.
Key words: community composition, functional genes, functional diversity, marine benthos, molecular ecology, phylogenetic diversity, phylogenetic classification
生物多样性对生态系统功能与服务至关重要(Cardinale, 2011; Midgley, 2012), 物种共存机制在
多样性与生态系统功能关系的形成中扮演着重要角色(张全国和张大勇, 2003)。

微生物在全球生物地
434 生物多样性 Biodiversity Science第21卷
球化学循环中发挥着重要功能, 其中微生物介导的氮循环过程可影响全球变化并对其作出响应(沈菊培和贺纪正, 2011; 杜建国等, 2012)。

但目前大部分微生物都不能在实验室中获得培养, 因此微生物生态学研究多将微生物群落当作“黑箱”来看待。

基于分子标记(如16S rRNA基因、关键酶基因等)的一系列分子方法克服了环境中大多数微生物不能成功培养的难题, 如今已成为微生物群落结构与多样性研究的常用工具(郭良栋, 2012)。

越来越多的研究证明, 微生物的群落结构、多样性与其功能具有紧密联系, 在海洋微生物多样性与氮循环研究中也不例外(Zehr & Kudela, 2011)。

新发现的氮循环参与者如氨氧化古菌、厌氧氨氧化菌, 引发了对它们在不同生态系统中多样性、功能与贡献的进一步研究, 从而使整个微生物氮循环途径不断被改写, 使全球氮收支被更新(Beman et al., 2007; Groβkopf et al., 2012)。

近年来, 有关海陆交汇带区域的氮循环微生物分子生态学研究方兴未艾, 这与海岸带生态系统在全球碳氮循环中的重要地位及其面临的若干重大生态环境问题有一定的关系。

地球上约1/3的海洋初级生产力来自大陆架及海岸带环境; 由于海岸带区域(河口、潮滩、湿地、浅海等)水位较浅, 浮游植物产生的有机质约50%沉到海底, 并且大部分被沉积物中的微生物所分解, 因此海岸带沉积物在全球物质循环中起着重要的作用(Jørgensen, 1996)。

沉积物中微生物的活动在很大程度上控制着海洋生物可利用氮的输入和输出, 进而对初级生产发挥着重要的调节作用(Driscoll, 2003)。

海岸带生境虽各有特色, 但在空间上呈网络式联系, 微生物转化氮的步骤虽较多但也常紧密耦合, 因此, 需要全景式地展示海岸带系统中氮循环微生物的多样性、功能与贡献。

最近, 我们综述了近海沉积物中微生物氮转化过程的速率、通量、丰度及调控机制(龚骏和张晓黎, 2013), 本文则重点介绍以分子标记为主要手段的研究成果, 总结海岸带沉积物中固氮、氨氧化、反硝化、硝酸盐铵化和厌氧氨氧化功能类群的物种与功能多样性、群落组成特征及时空变化规律。

1固氮菌
30年前, 一般认为海洋环境中底栖微生物固定的氮贡献了大部分的“新”氮(15 Tg N/yr), 而水体中浮游细菌固定的氮只占一小部分(4.8 Tg N/yr)(Capone & Carperter, 1982)。

此后浮游固氮微生物的研究对其固氮贡献的估计提高了约20–40倍(Karl et al., 2002)。

近来, 利用改进同位素示踪法(Mohr et al., 2010)测定固氮速率的结果显示, 海洋微生物的固氮贡献被大大低估。

新老方法在结果上的差异与微生物群落组成相关(Groβkopf et al., 2012), 因此底栖固氮微生物的多样性及其贡献有待重估。

海洋环境中固氮微生物种类众多, 根据16S rRNA基因的分析, 蓝细菌/蓝藻(Cyanobacteria)、α-, β-, γ-, δ-变形菌纲(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)的多个类群是近岸底栖环境中常见的固氮菌。

除细菌之外, 某些甲烷氧化古菌(ANME-2)同样具有固氮作用(Miyazaki et al., 2009)。

由于固氮菌各类群间亲缘关系较远, 基于16S rRNA基因的分析不能反映它们的功能, 而固氮酶铁蛋白基因(如nifH)较为保守, 且已知的nifH基因序列非常丰富, 因此nifH成为研究环境样品中固氮菌多样性最常用的分子标记。

根据nifH的系统发育可将固氮微生物分为5个主要的类群(Clusters I–V), 每一类群又分成若干子类, 与固氮菌16S rRNA基因具有较好的类群对应关系(Zehr et al., 2003; Raymond et al., 2004)。

海洋沉积物中的固氮菌主要隶属于Cluster I 与III两个类群: 其中Cluster I包括所有的蓝细菌、大部分的变形菌、放线菌(Actinobacteria)和部分厚壁菌; Cluster III则主要包括厌氧细菌和古菌, 如螺旋体(Spirochetes)、产甲烷菌(Methanogens)、产乙酸菌(Acetogens)、硫酸盐还原菌(Sulfate-reducing bacte-ria)、绿硫菌(Chloracea)、梭菌(Clostridia)等(Zehr et al., 2003; Gaby & Buckley, 2011)。

对不同环境中nifH基因序列的系统分析发现: 海洋环境中nifH基因的多样性低于土壤环境(Gaby & Buckley, 2011)。

大洋水体中的固氮菌主要由丝状的束毛藻(Trichodesmium)及单细胞蓝细菌组成(Zehr, 2001; Davis & McGillicuddy, 2006), 而海洋近岸沉积环境中的固氮菌群落与多样性则具有明显的生境特异性(表1)。

我们分别将潮间带、河口、盐沼、红树林、海草藻床、珊瑚礁等生境中固氮微生物类群特点总结如下。

第4期龚骏等: 海岸带沉积物中氮循环功能微生物多样性 435 表1海岸带不同生境固氮微生物代表类群(基于16S rRNA基因的系统地位和基于nifH基因的分类)
Table 1 Representatives of nitrogen-fixing microbes in different costal zone habitats (major phylogenetic groups based on 16S
rRNA gene and subclusters based on nifH gene are shown)
生境Habitat
nifH分类(子类)
nifH-based cluster
(subcluster)
16S rRNA系统地位
Classification based on
16S rRNA gene
代表属
Representative genus
参考文献
Reference
潮间带微生物席/蓝细菌席
Intertidal micro-
bial/cyanobacterial mats I (E)
I (J)
III (E)
III (E)
γ-Proteobacteria
α-Proteobacteria
δ-Proteobacteria
Fimicutes
Lyngbya
Azotobacter
Rhizobium
Desulfovibrio
Clostridium
Steppe & Paerl, 2005
河口沉积物Estuarine sediment I (E)
I (I)
III (E)
III (A)
γ-Proteobacteria
γ-Proteobacteria
δ-Proteobacteria
Firmicutes
Azotobacter
Klebsiella
Desulfovibrio
Clostridium
Burns et al., 2002
Herbert, 1999
Jones, 1982
盐沼植物根际Rhizosphere in salt marsh I (I)
I (H)
I (J)
I (E)
I (H)
I (J)
I (U)
γ-Proteobacteria
γ-Proteobacteria
α-Proteobacteria
γ-Proteobacteria
γ-Proteobacteria
α-Proteobacteria
γ-Proteobacteria
Enterobacter
Spirilla
Rhizobium
Azotobacter
Vibrio
Azospirillum
Psuedomonas
Bergholz et al., 2001
Lovell et al., 2001
海草(藻)根际Rhizosphere of seagrass and seaweed I (I)
I (E)
III (A)
III (E)
γ-Proteobacteria
γ-Proteobacteria
Firmicutes
δ-Proteobacteria
Rhizobium
Azotobacter
Clostridium
Desulfomicrobium
Desulfovibrio
Kirshtein et al., 1991
Smith et al., 2004
Achá et al., 2005
红树林根际Rhizosphere of mangrove plants I (I)
I (E)
III (A)
I (J)
I (I)
γ-Proteobacteria
γ-Proteobacteria
Firmicutes
α-Proteobacteria
γ-Proteobacteria
Rhizobium
Azotobacter
Clostridium
Azospirillum
Klebsiella
Thatoi et al., 2013
珊瑚礁区沉积物/珊瑚虫体Sediment in coral reef envi-ronments/coral endosymbiot I
I (H)
I (J)
III (A)
Cyanobacteria
γ-Proteobacteria
α-Proteobacteria
Firmicutes
Coccoid
Vibrio
Rhodobacter
Clostridium
Olson et al., 2009
Rohwer et al., 2002
(1)潮间带。

在光照充足的潮间带及无海草生长的浅海沉积物中, 蓝细菌丰富的微生物席固氮效率极高, 因此是近岸固氮微生物多样性研究的热点之一(龚骏和张晓黎, 2013)。

微生物席中的固氮菌呈现明显的昼夜变化特征: 白天蓝细菌类群固氮活性较高, 而夜晚γ-变形菌或变形菌类的固氮活性达到峰值(Severin et al., 2010; Beltrán et al., 2012)。

不同盐度梯度环境的微生物席中的微生物组成及多样性区别明显, 而季节性差别则较小(Bolhuis & Stal, 2011)。

(2)河口区。

河口区固氮菌群落组成类似于微生物席和盐沼(Zehr et al., 2003)。

在河口沉积物中, γ-变形菌中的Azotobacter(Cluster IE)较为常见(Burns et al., 2002; Ravikumar et al., 2004; Alikunhi et al., 2010)。

另外, 在美国切萨皮克湾和纽斯河口的研究中发现大量的Cluster IJ与Cluster IK α-变形菌, 以及Cluster IP与Cluster IU β-, γ-变形菌; 两个河口的沉积物中都有Cluster III的固氮微生物, 且都未发现具有固氮活性的古菌存在, 但其微生物组成仍有一定差异(Affourtit et al., 2001; Burns et al., 2002)。

Short 和Zehr(2007)的研究还表明, 尽管切萨皮克湾固氮菌nifH基因多样性较高, 但只检测到2个蓝细菌的基因型, 即柱胞鱼腥藻(Anabaena cylindrica)与单细胞蓝细菌Group A。

(3)盐沼、海草海藻床、红树林。

在这类环境中,植物残体及根分泌的有机碳为固氮菌提供了碳源, 因此固氮菌种类丰富(表1), 反过来又为植物生长提供了氮源。

盐沼是陆海交互带的一种重要湿地类型, 有大量耐盐植物生长, 这种环境下的固氮微生物群落组成基本稳定, 但可能因不同的植被覆盖而表现出差异(Bergholz et al., 2001; Lovell et al., 2001)。

利用DGGE技术对盐沼植物互花米草(Spartina alterniflora)根际的nifH基因分析表明, 其固氮微生物群落结构受季节变化的影响, 这主要是因为季节变化导致植物根系释放碳和离子的差异, 进而引起土壤理化条件的改变, 从而影响沉积物中
436 生物多样性 Biodiversity Science第21卷
微生物的群落结构(Gamble et al., 2010)。

另外, 短期扰动(如营养盐添加、遮荫等)对盐沼植物根际固氮活性及固氮菌群落组成的影响并不明显, 而长期施肥虽然对固氮菌群落结构的影响显著, 但对物种组成改变不明显, 这显示了根际固氮类群的稳定性和对生境的适应(Bagwell & Lovell, 2000)。

此外, 外来物种的入侵及地域的差异对湿地固氮微生物组成及其固氮活性也有着不同的影响(Moseman et al., 2008)。

红树林固氮菌的群落组成和丰度受地域、营养盐状况、季节和红树树种的影响(Thatoi et al., 2013)。

Ravikumar等(2004)研究发现, 固氮菌Azotobacter属是皮恰瓦兰红树林沉积物中最常见且丰度最高的固氮类群。

澳大利亚红树林沉积物中固氮菌的活性在强降雨量季节比弱降雨量季节高(Adame et al., 2010)。

在海草根际, 根瘤菌、梭菌及硫酸盐还原菌均具有明显的固氮活性(Kirshtein et al., 1991; Smith et al., 2004), 其中硫酸盐还原菌的固氮贡献尤为突出。

(4)珊瑚礁。

Hewson和Fuhrman(2006)利用T-RFLP技术对珊瑚礁区沉积物中固氮菌类群进行的群落指纹图谱分析显示, nifH基因多样性在不同站点间相似性较低, 这可能是由于受浪涛及沉积物深度的影响。

Hewson等(2007)在大堡礁的实验发现, nifH基因序列大多与沉积物、微生物席、表层水来源的序列相似性较高, 只有少量序列与典型的开阔海域类群相似; 而nifH的转录本则全部来自蓝细菌, 且包含来自开阔海域的基因型。

因此他们推断, 珊瑚礁区浮游细菌中的固氮菌类群可能来自沉积物、珊瑚自身或岩石表面, 开阔海域的蓝细菌类群在珊瑚礁区氮循环中扮演重要角色。

Olson等(2009)在夏威夷的研究表明, 珊瑚虫体内共生的固氮菌包括α-, β-, γ-, δ-变形菌与蓝细菌(Cluster I), 以γ-变形菌纲中的弧菌属(Vibrio)为主。

近海沉积物中的固氮菌多样性也表现出明显的空间异质性。

Moisander等(2007)利用nifH基因芯片分析美国切萨皮克湾沉积物的固氮菌群落发现: nifH基因的丰富度、Simpson及Shannon指数在河头(低盐度)最高, 呈现由河头(低盐度)至河口(较高盐度)渐变的趋势; 并与溶解无机氮、盐度、溶解有机碳、溶解有机磷等环境因子显著相关。

在欧洲的很多河口环境中, 蓝细菌的优势类群主要为浮游生的节球藻属(Nodularia)、束丝藻属(Aphanizomenon)、微囊藻属(Microcystis)与鱼腥藻属(Lopes & Vascon-celos, 2011); 而Brito等(2012)在葡萄牙西南海岸潮间带沉积物中却发现, 在蓝细菌的4个目(色球藻目、宽球藻目、颤藻目与念珠藻目)中, 颤藻目的种类占主导(50%左右)。

此外, 近海漏油区的固氮微生物多样性也非常值得关注。

石油的有氧降解通常受到严重的氮源限制, 因此微生物固氮可能在海底漏油区发挥重要作用。

Musat等(2006)室内模拟了石油污染后海底沉积物中固氮菌群落结构变化, 发现异养固氮菌在含油沉积物中出现的频率更高; 而在光照条件下, 主要是产生异形胞的蓝细菌具有固氮活性, 而异养固氮菌并不活跃。

因此推测, 在氮限制与光照条件下, 蓝细菌是石油污染区及未污染区沉积物中固氮的主要贡献者, 尽管在污染区其固氮能力并无提高, 但具有石油降解功能的微生物仍有可能从蓝细菌固氮中获得氮源。

2氨氧化细菌(AOB)与氨氧化古菌(AOA)
氨被氧化形成亚硝酸盐与硝酸盐的过程主要由化能自养型微生物完成。

所有的氨氧化菌都含有编码催化氨氧化第一步反应的氨单加氧酶基因(amo)。

在2004年之前, 变形菌纲中具有amo基因的类群一直被认为是该过程的主要催化者, 但随后在海洋等多个环境宏基因组中发现奇古菌(Thaum- archaeota)(旧称泉古菌, 张丽梅和贺纪正, 2012)也具有amo基因(Venter et al., 2004)。

海洋中氨氧化古菌(AOA)普遍存在且通常占优势, 因此奇古菌是海洋氨氧化过程的重要参与者(Francis et al., 2005; Könneke et al., 2005)。

利用氨单加氧酶α亚基基因(amoA)作为分子标记可研究氨氧化菌(AOB)及AOA在环境中的多样性、群落组成及数量。

根据系统发育分支, AOB主要包括β-变形菌纲的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)与亚硝化螺菌属(Nitrosospira)以及γ-变形菌纲的亚硝化球菌属(Nitrosococcus), 其中β-AOB在海洋、土壤、淡水环境中广泛分布, 已培养的种类包括Nitrosomonas europaea, N. marina, N. aestuarii, N. cryotolerans, N. oligotropha, N. ureae等; 而γ-AOB的两个种(Nitrosococcus oceani与N. halo-philus)仅在海洋与盐湖有个别报道, 在河口与盐沼中很少见到, 在淡水环境则几乎没有(Ward et al.,
第4期龚骏等: 海岸带沉积物中氮循环功能微生物多样性 437
2007)。

这可能与引物特异性有关, 也可能说明亚硝化球菌属在环境中确实较少存在。

AOA的多样性具有明显的环境来源特异性, 可大致分为海洋环境、土壤环境及嗜高温氨氧化古菌三大类(Prosser & Nicol, 2008)。

其中海洋环境的AOA序列主要属于Group I.1a, 代表物种有Nitrosopumilus maritimus, Cenarchaeum symbiosum, Nitrososphaera gargensis; 而土壤来源的序列大多聚类于Group I.1b(Schleper et al., 2005)。

对所有环境来源的AOA-amoA及AOB-amoA基因序列的系统研究显示: AOA系统发育丰富度(phylogenetic richness)高于AOB, 淡水环境高于海洋环境; AOA类群在沉积物、土壤、浮游环境间的分异明显, 而AOB则不明显(Fernàndez- Guerra & Casamayor, 2012)。

以下我们总结了海岸带不同生境氨氧化菌的多样性及分布情况。

2.1环境梯度变化强烈的河口区
一般地, 河口区沉积物与水体样品中共有的基因型很少(Francis et al., 2005)。

(1)AOB群落。

盐度被认为是控制河口区AOB 丰度与多样性最主要的因素, 在高盐度环境中AOB 大部分属于亚硝化螺菌属; 低盐度和中盐度站点的AOB则主要隶属于亚硝化螺菌属相关类群以及亚硝化单胞菌属(Bernhard et al., 2005)。

Sahan和Muyzer(2008)发现在韦斯特谢尔德河口, 低盐站点AOB的多样性较高盐站点高。

其次, 温度也是影响AOB的重要因素。

同样是在韦斯特谢尔德河口, 亚硝化单胞菌属在高温样品中占优势, 而亚硝化螺菌属则主要出现在低温样品中(Sahan & Muyzer, 2008)。

第三, 硝化速率可能与河口区AOB的群落构成显著相关。

Wankel等(2011)对加利福尼亚河口沉积物的研究发现: 硝化速率高的站点AOB主要由亚硝化螺菌属相关的基因型组成, 而在硝化速率低的站点则主要与亚硝化单胞菌属相关。

第四, 富营养化也会对河口沉积物AOB的群落组成产生影响。

例如墨西哥富营养化的Bahía del Tóbari河口以亚硝化单胞菌相关类群为主(Beman & Francis, 2006), 且站点间变化不大。

在富营养化的胶州湾, AOB群落组成与亚硝氮及沉积物粒径显著相关(Dang et al., 2010)。

(2) AOA群落。

盐度是影响河口沉积物AOA群落的重要因素。

Mosier和Francis(2008)在对旧金山湾沉积物AOA的统计分析中发现, 来自低盐河口区的AOA聚到一起, 形成了独特的低盐群。

在澳大利亚热带菲茨罗伊河口, AOA主要来源于沉积物与土壤环境的奇古菌, 且其群落结构与站点的盐度、碳、氮含量密切相关, 季节变化不明显。

总之, 在环境条件复杂的河口环境中, 影响AOA与AOB的多样性与群落结构的主要因素随地理区域的不同而有所不同, 但一般认为盐度、温度、营养盐、污染物等均是重要的影响因子。

2.2有大型植物生长的盐沼与红树林区
盐沼沉积物中的AOB通常主要由亚硝化螺菌属的相关类群组成, 如新英格兰盐沼互花米草与狐米草(Spartina patens)区(Moin et al., 2009)和缅因州盐沼区(Lage et al., 2010); 而AOA则隶属于水样/沉积物或土壤/沉积物来源的类群, 可能与奇古菌Group I.1b类群紧密相关(Moin et al., 2009)。

红树林对沉积物中AOA和AOB的影响可能是不同的。

香港红树林沉积物中, AOA主要分为表层和底层两大类; 而AOB却分为近红树林和远红树林群。

而且, AOB比AOA具有更高的丰度, 可能暗示AOB在红树林硝化作用过程中扮演重要角色(Li et al., 2011b)。

沉积物盐度、氨浓度、金属及pH都会对红树林AOB和AOA群落组成和多样性产生影响(Li et al., 2011b; Cao et al., 2011)。

2.3 珊瑚礁区
Beman等(2007)研究发现, 巴拿马9种珊瑚礁中的AOA多样性较高, 且多与海岸/河口沉积物、大洋水体中的AOA序列亲缘关系较近, 而AOB的amoA 基因则低于检测限。

另外, 大型底栖动物能显著影响沉积物–水界面的氧分布, 导致微生物群落改变, 多样性增高(Laverock et al., 2010), 但AOB与AOA 的总丰度不变, 只是AOB与AOA的比率有所增高(Gilbertson et al., 2012)。

3反硝化微生物
反硝化是NO3–在低氧情况下被还原为NO2–、NO后进一步还原为N2O与N2的过程, 参与的微生物包括细菌、古菌和真核生物。

反硝化过程可去除人类活动给海岸带环境带来的多余的氮, 从而减少水体富营养化现象, 因此在海岸带环境中起重要作用。

另外, 反硝化产生的温室气体N2O也是当今研究的热点问题之一(龚骏和张晓黎, 2013)。

从分类上来看, 反硝化功能微生物多为异养兼
438 生物多样性 Biodiversity Science第21卷
性厌氧细菌, 包括变形菌门、产水菌门(Aquificae)、异常球菌–栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、厚壁菌门、放线菌、拟杆菌(Bacteroides)中的一些种类, 其中假单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢菌属(Bacillus)普遍存在于海洋生态系统中。

某些海洋真菌与古菌也具有反硝化功能(Shoun et al., 1992; Philippot, 2002)。

一般认为反硝化细菌分布最为广泛且在大多数环境中为优势类群, 因此对反硝化功能微生物的研究大多聚焦于反硝化细菌。

与其他氮循环功能类群一样, 一般通过功能基因来研究反硝化菌在环境中的多样性与分布。

反硝化过程涉及的重要酶有60多种, 但其中常用的分子标记主要为: 硝酸还原酶的编码基因narG与napA, 亚硝酸还原酶的编码基因nirS与nirK, 一氧化氮还原酶的编码基因norB, 以及氧化亚氮还原酶的编码基因nosZ (Zumft, 1997)。

盐度、pH、NO3–与NO2–浓度及有机物可利用度被认为是影响反硝化菌群落组成与多样性的主要环境因子, 其中以盐度和pH的影响最为显著(Prieme et al., 2002; Enwall et al., 2005; Santoro et al., 2006; Mosier & Francis, 2010)。

nirK与nirS编码的亚硝酸还原酶虽然结构不同但功能一致, 环境条件如何影响nirS型与nirK型反硝化群落的结构与多样性是研究的热点之一。

Jones和Hallin(2010)对全球分布的nirS型与nirK型反硝化菌的数据分析显示, 尽管nirS型与nirK型的反硝化菌在不同的环境中可共存, 但它们的群落形成机制并不一样。

海洋环境中nirK的多样性最高, 高于土壤, 也高于nirS; 但nirS在环境梯度上的变化比nirK更为明显。

硝酸盐和溶氧水平与反硝化细菌的群落结构显著相关(Liu et al., 2003)。

Nogales等(2002)利用反转录PCR(RT-PCR)技术对英国科恩河口中游和上游沉积物的研究发现, 硝酸盐水平差异较大的两种沉积物中各基因类群(narG, napA, nirS, nirK, nosZ)均具有不同的群落结构。

我国珠江口nirS型反硝化细菌的空间分布则与溶解无机氮浓度显著相关(Huang et al., 2011)。

在富营养化的英国科恩河口, narG基因序列主要来源于δ-变形菌(Smith et al., 2007)。

浮游植物存量、金属离子及垂直方向上的氧化还原梯度也影响沉积物中反硝化菌的时空分布。

澳大利亚热带河口沉积物中nirS多样性及丰度均明显高于nirK, 且其群落结构随季节而发生变化, 并与盐度和叶绿素显著相关(Abell et al., 2009)。

葡萄牙杜罗河河口沉积物中, nirK, nirS和nosZ的多样性随着Cu含量的增加而降低(Magalhães et al., 2011)。

旧金山湾每个站点nirS的丰度都比nirK高, 盐度、有机碳、氮与金属离子是影响群落结构的主要因子(Mosier & Francis, 2010)。

Tiquia等(2006)研究发现, 在沉积物垂直方向上, 随着深度的增加, 沉积物中nirS多样性降低, 并且表层与深层沉积物中的群落结构差异显著。

最近的研究显示, 古菌基因组中包含有无机氮还原的相关功能基因, 例如奇古菌中nirK的同源基因(Lund et al., 2012)。

硝酸盐还原酶(Nar)、亚硝酸盐还原酶(Nir)在一些奇古菌与广古菌的基因组中已有发现, 但这些基因的功能仍有待确证。

沉积物中的某些真菌与原生生物类群(如底栖有孔虫)也被发现具有反硝化功能(Risgaard-Petersen et al., 2006; Cathrine & Raghukumar, 2009; Kim et al., 2009)。

但海洋沉积物环境中反硝化真核微生物多样性的研究还有待深入开展。

4硝酸盐铵化微生物
在厌氧状态下, 细菌、古菌、真菌的某些种类能将硝酸盐还原为铵, 即介导硝酸盐铵化过程(DNRA)。

细胞周质硝酸盐还原酶基因(nrfA)是硝酸盐铵化细菌多样性研究的一个分子标志物, 在变形菌门的多个纲、拟杆菌门(Bacteroidetes)、浮霉菌目(Planctomycetales)、厚壁菌门中均有检获(Mohan et al., 2004)。

据报道, 一些兼性厌氧的化能自养型硫细菌如贝扎托菌属(Beggiatoa)、辫硫菌属(Thioploca)能将NO3–聚集于胞内的空泡内并用于H2S的厌氧氧化, 从而发挥DNRA功能(Sayama, 2001)。

Takeuchi(2006)首次对环境样品中的nrfA基因进行克隆与分析后发现, 在河口区海水与淡水站点沉积物中DNRA功能菌的群落结构与半咸水站点明显不同。

沉积物深层的多样性较低, 种类多来自气单胞菌(Aeromonas)、希瓦氏菌(Shewanella)、脱硫弧菌(Desulfovibrio)、硫磺单胞菌属(Sulfurospillum)与拟杆菌属(Bacteroides)的相关类群。

在英国富营养化的科恩河口, DNRA类群主要隶属于δ-变形菌, 也有少量来自γ-变形菌, 如冷海希瓦氏菌(Shewanella frigidimarina)、褐杆状绿菌
第4期龚骏等: 海岸带沉积物中氮循环功能微生物多样性 439
(Chlorobium phaeobacteroides)以及厌氧氨氧化和硫酸盐还原泥浆反应器中的一些类群(Smith et al., 2007)。

另外, 一些厌氧氨氧化细菌(如Ca. Kuenenia stuttgartiensis)能在高NH4+浓度条件下(如10 mM)将NO3–还原成NH4+, 即介导DNRA过程(Kartal et al., 2007)。

总之, 虽然对不同海岸带环境中DNRA速率的研究较多(龚骏和张晓黎, 2013), 但相对其他氮循环功能类群而言, 对硝酸盐铵化细菌多样性的研究还较少。

有些真菌能在供氧充足的情况下行有氧呼吸, 而在无氧状态下可将NO3–还原为NH4+, 这个过程又被称为氨发酵(ammonia fermentation)(Zhou et al., 2002)。

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是真菌中行DNRA功能的代表种类。

另外, 具有DNRA功能的真菌还包括很多子囊菌, 如篮状菌(Talaromyces rotundus)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、滴斑彼得壳菌(Petriella guttulata)、京都丽赤壳菌(Calonectria kyotensis)、黑木霉菌(Hypocrea nigri-cans)、菌寄生菌(Hypomyces trichothecoides)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、苔藓柱孢菌(Cylindr- ocarpon tonkinense)、腾仓赤霉(Gibberella fujikuroi)和林氏镰孢菌(Fusarium lini)等(Zhou et al., 2002)。

有关海洋环境中具有DNRA功能真菌的多样性及分布的研究尚较少见到。

5 厌氧氨氧化细菌
与古菌有氧氨氧化的发现相同, 厌氧氨氧化过程的发现彻底改变了人们对氮循环的认识。

现已知介导厌氧氨氧化过程的细菌在各类含水环境中广泛存在(Penton et al., 2006)。

按16S rRNA基因的系统发育分析, 厌氧氨氧化细菌主要隶属于浮霉菌门(Planctomycetes)中的Brocadiales目, 包括5个暂定属: Ca. Scalindua, Ca. Brocadia, Ca. Kuenenia, Ca. Jettenia与Ca. Anammoxoglobus, 目前还没有获得纯培养物(Kuenen, 2008)。

针对厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因的特异性引物与探针最早设计出来并不断优化, 已广泛用于该功能菌的检测、多样性与定量研究(Li et al., 2010); 此后, 针对厌氧氨氧化过程中关键酶基因(如联氨氧化还原酶基因hzo, 厌氧氨氧化细菌特有的亚硝酸还原酶基因nirS, 联胺合成酶基因hzsA, hzsB)的分子检测方法也陆续发展起来, 给环境中厌氧氨氧化细菌的多样性、生理生态研究带来诸多便利(Schmid et al., 2008; Li et al., 2011c; Harhangi et al., 2012; Wang et al., 2012)。

虽然厌氧氨氧化细菌在海洋厌氧环境(沉积物和水体)中广泛分布, 但其多样性较低, 通常只可检测到Ca. Sca-lindua属(Schmid et al., 2007)。

相比之下, 厌氧氨氧化速率及对脱氮的贡献随环境变化较大, 因而更受关注。

厌氧氨氧化菌多样性在河口区变化较大, 盐度是影响厌氧氨氧化菌分布的主要因子之一。

在高盐站点多检出Ca. Scalindua属, 低盐站点多检出Ca. Kuenenia和Ca. Brocadia属(Dale et al., 2009)。

在盐沼沉积物中也只检测到Ca. Scalindua属(Humbert et al., 2009)。

而在受潮汐影响较大的珠江河岸沉积物中, Ca. Kuenenia和Ca. Brocadia为优势类群(Wang et al., 2012)。

由于受季节性陆源输入的影响, 河口区厌氧氨氧化细菌群落也表现出明显的季节变化规律: 夏季时多样性较高(Li et al., 2011a)。

红树林沉积物中厌氧氨氧化菌群落结构受红树林的影响非常大, Li等(2011a, d)在珠江口红树林沉积物不同土层中检测到了厌氧氨氧化细菌的4个属(Ca. Scalindua、Ca. Kuenenia、Ca. Brocadia和Ca. Jet-tenia),推断氧化还原电位、氨氮与亚硝氮的摩尔比是主要的影响因子(Li et al., 2011a, d)。

污染物类型和污染状况也是影响海岸带厌氧氨氧化菌的重要因子。

在东海化学污染严重的胶江湾, 潮间带的厌氧氨氧化细菌主要为Ca. Kuenenia, 而潮下带则还包括Ca. Brocadia, Ca. Scalindua与Ca. Jettenia这3个属。

冗余分析表明厌氧氨氧化细菌的分布与多样性受硝基苯、有机物含量、NO3–及盐度的影响(Hu et al., 2012)。

在富营养化的胶州湾, 沉积物中只检测到Ca. Scalindua一个属, 但其属下水平的多样性较高, 群落结构受有机碳氮比、亚硝酸盐浓度和沉积物粒径的影响较大(Dang et al., 2010)。

值得一提的是, 虽然国内同行对我国海岸带环境中的厌氧氨氧化细菌多样性及分布虽已做了大量出色工作, 但有关速率与通量方面的研究还较缺乏。

6展望
综上所述, 参与海岸带沉积物中氮循环的微生物类群多样, 其中虽有少数已成功培养的代表种类, 但大多数种类仍属于未培养状态; 对氮循环功。