HPLC同时测定复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱含量

HPLC同时测定复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱含量

目的建立高效液相色谱法（HPLC）同时测定复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱含量的方法。方法色谱柱为Agilent XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A为乙腈-四氢呋喃（25∶8），B为0.1 mol/L醋酸铵溶液（每1000 mL 加冰醋酸0.5 mL），梯度洗脱；流速：1 mL/min；检测波长：235 nm；柱温：25 ℃。结果乌头碱在0.072～0.648 μg具有良好的线性关系（r=0.999 5），平均回收率为99.29%，RSD=1.25%；新乌头碱在0.062～0.648 μg具有良好的线性关系（r=0.999 5），平均回收率为99.12%，RSD=0.85%；次乌头碱在0.064～0.384 μg 具有良好的线性关系（r=0.999 8），平均回收率为99.57%，RSD=1.07%；苯甲酰乌头原碱在0.056～0.672 μg具有良好的线性关系（r=0.999 2），平均回收率为98.11%，RSD=0.61%；苯甲酰新乌头原碱在0.055～0.993 μg具有良好的线性关系（r=0.999 9），平均回收率为99.27%，RSD=1.10%；苯甲酰次乌头原碱在0.078～0.702 μg具有良好的线性关系（r=0.999 8），平均回收率为99.08%，RSD=1.38%。结论本方法操作简便、灵敏度高、重复性好，结果准确，可作为复方藤乌软膏中乌头类生物碱的含量测定方法。

Abstract：Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of the 6 aconitum alkaloids in compound Tengwu Ointment. Methods Chromatographic column was Aglient XDB-C18 column （4.6 mm × 250 mm，5 μm），with the mobile phase A of acetonitrile- tetrahydrofuran （25∶8），phase B was 0.1 mol/L ammonium acetate solution （0.5 mL acetic acid added to the 1000 mL）with gradient elution；the flow rate was 1 mL/min；the detection wavelength was set at 235 nm；the column temperature was 25 ℃. Results Aconitine was in the good linear range of 0.072-0.648 μg （r=0.999 5），with the average recovery of 99.29%，RSD=1.25%. Mesaconitine was in the good linear range of 0.062-0.648 μg （r=0.999 5），with the average recovery of 99.12%，RSD=0.85%. Hypaconitine was in the good linear range of 0.064-0.384 μg （r=0.999 8），with the average recovery of 99.57%，RSD=1.07%. Benzoylaconine was in the good linear range of 0.056-0.672 μg （r=0.999 2），with the average recovery of 98.11%，RSD=0.61%. Benzoylmesaconine was in the good linear range of 0.055-0.993 μg （r=0.999 9），with the average recovery of 99.27%，RSD=1.10%. Benzoylhypaconine was in the good linear range of 0.078-0.702 μg （r=0.999 8），with the average recovery of 99.08%，RSD=1.38%. Conclusion This method is simple，sensitive，repeatable and accurate，which can be used for determination of aconitum alkaloids in compound Tengwu Ointment.Key words：compound Tengwu Ointment；aconitine；mesaconition；hypaconitine；benzoylaconine；benzoylmesaconine；benzoylhypaconine；HPLC

復方藤乌软膏是山东大学附属省立医院骨伤科专家与药学人员遵循中医药理论共同研制的传统中药制剂，由鸡血藤、生川乌、生草乌、自然铜等组成，具有消肿止痛、续筋接骨等功效，主要用于治疗运动劳损、急性扭伤、挫伤、闪伤及轻度骨折引起的疼痛，临床应用30余年疗效较好。

复方藤乌软膏中的生川乌、生草乌含有乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱等乌头类生物碱，既是毒性成分又是有效成分[1]。我们前期对其制备工艺及皮肤安全性进行了研究[2]。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）建立复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱的含量测定方法，为更好地控制其质量、进一步推广和扩大应用奠定基础。

1 仪器与试药

Waters 600F高效液相色谱仪（Waters2996紫外检测器，Empowers色谱工作站），Agilent XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；CP2250型电子分析天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；BSA223S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ-600DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

复方藤乌软膏样品（批号分别为20140508、20140711、20140829），山东大学附属省立医院制剂室制备；乌头碱对照品（批号110720-200410，纯度≥98%）、新乌头碱对照品（批号0799-9403，纯度≥98.3%）、次乌头碱对照品（批号0798-9403，纯度≥98.6%）均购自中国食品药品检定研究院，苯甲酰乌头原碱对照品（批号RFS-B-110305，纯度≥98%）、苯甲酰新乌头原碱对照品（批号RFS-B-100713，纯度≥98%）、苯甲酰次乌头原碱对照品（批号RFS-B-110328，纯度≥98%）均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈、四氢呋喃为色谱纯，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为乙腈-四氢呋喃（25∶8），流动相B为0.1 mol/L醋酸铵溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL），梯度洗脱（0→35 min，17%→25%A；35→60 min，25%A）；检测波长：235 nm；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于3000。在此色谱条件下，6种乌头类生物碱均与其他组分能达到较好分离。色谱图见图1。

3.苯甲酰次乌头原碱；

4.新乌头碱；

5.次乌头碱；

6.乌头碱

图1 复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，分别置于10 mL容量瓶中，加入0.05%盐酸-甲醇溶液定容至刻度，制成每毫升含乌头碱0.180 mg、新乌头碱0.180 mg、次乌头碱0.180 mg、苯甲酰乌头原碱0.560 mg、苯甲酰新乌头原碱0.460 mg和苯