细胞生物学实验②荧光显微镜——生物样品的荧光观察

生物样品的荧光观察

生物122 祝洪晨1202040220

目的：①初步掌握荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜的结构、原理使用方法及其在细胞生物学研究中的应用。②掌握生物材料的荧光染色和活体荧光蛋白的观察方法。

原理：本实验中微丝的荧光观察采用荧光素标记的鬼笔环肽(phalloidin)，鬼笔环肽专一的结合聚合状态的肌动蛋白丝上，起到稳定微丝的作用。花粉细胞核的观察采用DAPI染色。DAPI(4，6—联眯—2—苯基吲哚)是一种荧光染料，它与DNA双螺旋的凹槽部分相互作用，从而与DNA双链紧密结合，结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm。植物细胞的花粉管、筛板、和胞间连丝含有胼胝体成分，其经过苯胺蓝染色后，用紫外线激发，可发出黄绿色荧光。

实验内容及结果

（一）荧光标记观察烟草花粉管内微丝骨架的分布

1）烟花新鲜花粉萌发液已由教师完成。

2）固定：取200ul萌发液放入离心管中，静置沉降，3000rpm离心30秒，吸出培养基，加入200ul 3.6%多聚甲醛（50 mmol/L Pipes配制）固定20分钟。再吸出固定液，用Pipes 缓冲液清洗三次，每次5分钟。

3）染色:3000rpm离心1分钟，吸净缓冲液，加入100nm Alexa Fluo 488 phalloidin 50ul，37度染色20分钟，洗去染液，加入50ul缓冲液，吸取10ul直接进行封片。

4）荧光显微镜观察（激发光波长：蓝光激发，检测的发射光波长:510-530nm）

5）观察结果如下表所示：

花粉管微丝呈荧光绿

（二）DAPI染色观察花粉细胞核

1）DAPI 染色液的配置：

2）制作装片：用镊子夹住拟南芥的花，将花粉粘在载玻片上，加入20ul DAPI染色液染液，3-5分钟后，临时封片。

3）激发光：紫外光,发射光461nm。

花粉(白色箭头所指)内有2个生殖核(1)和1个营养核(2)

（三）苯胺蓝染色观察豌豆下表皮胞间连丝

撕取蚕豆叶片表皮，放在载玻片上，加入20ul 0.1% 苯胺蓝染色3-5分钟，紫外激发光下镜检。

胞间连丝(黑色箭头所指，略呈绿色)

总结：一、

二、使用荧光显微镜观察装片时，注意在视野中找到清晰的物象，再移动装片进行观察取像，避免装片提前曝光而发生荧光淬灭。

荧光显微镜观察类型

原理

自发荧光 在生物的某些组织中，经紫外线照射后会有荧光发出，如叶绿素

经紫外线照射后即可发出红色荧光。 次生荧光

生物组织经紫外线照射后，并不立即发光，它可吸收某些荧光颜

料并与之结合后产生荧光，如鬼笔环肽、DAPI 等。 免疫荧光

利用抗原—抗体反应的原理，将荧光染料与抗体结合，之后再与相应抗原结合形成抗原—抗体复合物，经一定波长的光激发后即

可发出荧光。