枸杞多糖的生化和降血糖活性讲解

枸杞多糖的生化分析和降血糖活性

摘要：本实验研究了枸杞多糖的纯化，表性特征和降血糖活性。通过超滤膜分离获得水溶性多糖（LBP），并通过DEAE纤维素柱和Sephadex的色谱法进一步纯化G-150得到LBP3a和LBP3b。分析表明LBP3b的平均分子量（Mw）为4.92kDa。单糖组成分析显示，LBP3b由摩尔比为5.52：5.11：28.06：1.00：1.70的甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，半乳糖和木糖组成。并通过UV，FTIR，NMR和SEM研究了LBP3b的初步结构特征。体外细胞实验显示，LBP3b以剂量依赖的方式显著抑制葡萄糖的吸收。研究表明LBP3b具有作为抗糖尿病药物的潜在用途。

1.引言

糖尿病（DM）是指具有异常高水平的血糖的慢性代谢病，已经成为世界上主要的健康问题。它是由胰岛素分泌缺乏或器官对胰岛素的反应减弱引起的。包括1型和2型在内的DM在全球发病率急剧增加，到2030年估计超过4亿。许多口服降糖药，如双胍类和磺酰脲类可用于治疗糖尿病，但这些药物是化学合成的，缺乏多剂量方案，且高成本，具有不良副作用和毒性。因此，研究和发现新型更安全和更有效的替代品是至关重要的，其中传统的食用和药用资源已成为研究低血糖活性的焦点]。

枸杞，属于茄科，是中国著名的草药，已使用了2300多年。目前，枸杞受欢迎的功能食品已被广泛使用，其具有很大功效，如减少血糖和血清脂质，滋养眼睛，肾脏和肝脏，抗辐射，提高免疫力，抗衰老，抗癌，抗疲劳，增强血细胞生成，改善男性不育。据报道，枸杞果干中有胡萝卜素，氨基酸，微量矿物质，维生素，脂肪酸，多糖和甜菜碱与健康相关的生物活性成分。

在枸杞的这些化学成分中，最好研究的组分是水溶性的多糖（LBP）估计占干果的5-8％。许多关于药理学和光化学的研究已经证明LBP是以上的生物活性的主要成分之一[15-17]。然而，由于LBP的结构复杂性，不同的提取和纯化方法得到的LBP具有不同组分，结构和功能。而每种LBP的结构和功能从未进行过全面和深入的讨论。

本研究通过超滤膜分离方法从枸杞果实中提取粗LBP，通过DEAE离子交换纤维素和Sephadex凝胶过滤的方法纯化粗LBP，使用前柱衍生高效液相色谱法鉴定单糖组成，然后确定LBP亚基的结构。此外，进行体外细胞实验以评价LBP3b 的降低血糖的效应。部分（LBP3b）通过UV，FT-IR，NMR和SEM测定表型特征。

2.材料和方法

2.1. 材料和化学物质

枸杞果实在宁夏回族自治区市场购买。将植物材料干燥并在使用前储存在干燥的地方。DEAE-纤维素，Sephadex G-150，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖，甘露糖，木糖和三氟乙酸（TFA）购自Sigma。所有其他化学品和溶剂均为分析等级。

2.2. 粗多糖的制备

多糖通过Yin和Dang的方法制备。将枸杞果实的干果用搅拌器粉末化，并将研磨的样品浸入给定体积的60℃的热水中。在一定条件下，混合的提取物通过有机膜进行超滤，其分离分子量从300至50kDa（从Suntar Membrane Technology Co.，Ltd.，Xiamen，China获得）。超滤后用氯仿：甲醇（2:1）（v / v）的过滤液回流三次，以除去脂质。过滤后，将残余物风干，然后再次用80％乙醇回流。混合的滤液依次用95％乙醇，100％乙醇和丙酮沉淀。过滤和离心后，收集沉淀物并真空干燥，得到粗LBP（CLBP）的粗多糖（糖缀合物）。

2.3. CLBP的分离和纯化

CLBP用Sevag试剂脱蛋白3次，然后将所得多糖溶液冻干以得到粗产物。将粗产物溶解并经受DEAE纤维素柱（OH - ，2.6cm×90cm），并用蒸馏水和0.05-0.5mol / l NaCl以30ml / h的流速洗脱。通过自动级分收集器收集洗脱液并测定280nm处UV吸收和490nm的苯酚硫酸量。并且获得称为LBP1，LBP2，LBP3和LBP4的四个均匀子级分。其中含量最高的亚级分LBP3，使用Sephadex G-150柱（2.5cm×60cm）进一步纯化。经离心，浓缩和冷冻干燥后，LBP3b用于后续实验。通过苯酚 - 硫酸法[22]，使用d-葡萄糖作为标准样品，测得LBP3b 的总糖含量为96.53％。

2.4 . 单糖组成和分子量测定的分析

LBP3b样品用三氟乙酸（TFA）水解，并由1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生。LBP3b的单糖组成在ZORBAX Eclipse XDBC 18柱（250mm×4.6mm，Agilent，USA）上通过反相液相色谱（Agilent 1260，VWD检测器，美国）进行，流动相0.1mol / l PBS （pH6.7）：乙腈为83:17，流速1ml / min，温度30℃，进样体积为10μl。检测在250℃ nm d-甘露糖，l-鼠李糖，d-葡萄糖，d-半乳糖，d-木糖，d-阿拉伯糖用作参考。

通过高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定LBP3b的平均分子量，将样品溶液置于装有Shodex OHpak SB-802HQ和Shodex OHpak SB-805HQ柱（8.0mm×300mm，ShowaDenko，Japan）的Agilent高效液相色谱（HPLC），用含有0.2mol / l NaCl 的0.1mol / l磷酸盐缓冲液（pH 5.5）洗脱，其流速为0.8ml / min，并通过Agilent 1260折射率检测器检测。并用用已知分子量的葡聚糖P-82系列作为标准品（805000,339000,210000,48800,2700，10000，6000，180Da），制作标准曲线。参照上述制作的标准曲线，估算LBP3b的分子量。

2.5. 紫外和FT-IR分析

将均匀的LBP3b溶解稀释至适当的浓度，并用UV分光光度计（CARY

50UV-vis，Agilent，USA）对其测定。测定范围从200至500nm 。同时用配备有OMNIC软件的傅里叶变换红外分光光度计（NEXUS 870，USA）测定LBP3b的FT-IR。将LBP3b样品分别用KBr粉末研磨，然后压制为用于在4000-400cm -1的频率范围内进行变换红外光谱测量的粒料。

2.6. NMR分析

通过冻干将多糖与DMSO中的氘交换三次。并在NMR波谱仪（Brucker AVANCE III）上于600MHz记录1 H和13 C NMR光谱。

2.7. 扫描电子显微镜

将多糖用金箔涂覆，并在高真空条件下，于5kV的加速电压下，用扫描电子显微镜系统（Hitachi S-3400N，Japan）检测，并将图像放大500至10000倍。

2.8. LBP3b对Caco-2细胞培养模型中葡萄糖吸收的影响

细胞培养：从中国科学院（上海，中国）生物化学与细胞生物学研究所的细胞库得到了Caco-2细胞，细胞在含有10％胎牛血清DMEM培养基的25cm 塑料