实验十 叶绿素a和b含量的测定

实验十叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）

一、目的

学会Chla、b含量的测定方法，了解叶片中Chla、b的含量。

二、原理

根据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，某有色溶液的吸光度A值与其中溶质浓度C以及光径L成正比，即A＝aCL（a为该物质的吸光系数）。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下的吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。

乙醇溶液中叶绿素a、b在长波光方面的最大吸收峰位于665nm和649nm，同时在该波长时叶绿素a、b的比吸收系数K（溶液厚度是1cm,溶液浓度为1g/L的吸光度）为已知，我们即可以根据Lambert Beer定律，它们的浓度C与吸光度A之间有如下的关系：

A665 = 83.31 Ca + 18.60 C b (1)

A649 = 24.54 Ca + 44.24 C b (2)

(1)(2)式中的A665、A649为叶绿素溶液在波长665nm和649nm时的光密度。

C a、C b为叶绿素a、b的浓度、单位为每升克数。

83.31、18.60为叶绿素a、b在、在波长665nm时的比吸收系数。

24.54、44.24为叶绿素a、b在、在波长649nm时的比吸收系数。

解方程式(1)(2)，则得：

C A = 13.7 A665 - 5.76 A649 (3)

C B = 25.8 A649 - 7.6 A665 (4)

G = C A + C B = 6.10 A665 + 20.04 A649 (5)

此时，G为总叶绿素浓度，C A、C B为叶绿素a、b浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a、b及总叶绿素的总含量。

三、材料用具及仪器药品

菠菜叶片、分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）

四、方法步骤

1．称取0.2克新鲜去叶脉叶片，剪碎，放在研钵中，加少许CaCO3,加入乙醇10ml共研磨成匀浆，再加5ml乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml。

2．取一光径为1cm的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在分光光度计下分别以665nm和649nm波长测出该色素液的光密度。

计算结果：

五、实验报告

计算所测植物材料的叶绿素含量。

叶绿素a和b在红光区和蓝光区都有最大吸收峰，能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿素a和b的定量分析，为什么？