动物细胞培养产酶概述
酶的生物合成
生产酪氨酸脱羧酶、链激酶、链道酶、双链酶等(有溶解血栓、血 块，加速伤口愈合等作用)
产生葡萄糖异构酶
.
8
2、 放线菌
菌种
(1) 链霉菌属
(Streptomyces)
委内瑞拉链霉菌 (S. venezulae)
灰色链霉菌 (S. griseus) 白色链霉菌 (S. albus)
不产色素链霉菌 (S. achromogenes)
(4) 透明质酸酶
治疗关节损伤、关节周围炎症及膝外伤，传染性肝炎及肝硬 化等
用做药物扩散剂
.
22
四、 产酶微生物的来源
1、土壤中的产酶微生物 2、水体中的产酶微生物 3、空气中的产酶微生物 4、极端环境中的产酶土壤是微生物生活的大本营，为微生物生长繁 殖及生命活动提供了各种条件
用于分析组成和杂质浓度的分析方法的细节
酶或微生物的毒理数据
微生物必须是非致病性的 微生物一定不能产生真菌素或其他毒性化合物 微生物一定不能产生抗生素
.
33
二、 微生物酶的发酵生产
1、酶的发酵生产方法 2、培养基的配制 3、种子培养 4、微生物发酵产酶的一般工艺
.
34
1、 酶的发酵生产方法
(1) 固体培养法 (2) 液体培养法
酶)
.
13
4、 霉菌
菌种 (4) 青霉(Penicillium)
酶及功能
点青霉 (P. notatum) 产紫青霉 (P. ururogenum)
产黄青霉 (P. chrysogenum)
橘青霉 (P. citrinum)
(5) 犁头霉(Absidia)
葡萄糖氧化酶
葡萄糖氧化酶，中性、碱性蛋白酶和青霉素V酰化酶 5’-磷酸二脂酶(水解RNA，生产4种5’-单核苷酸，肌苷酸和鸟苷
动植物细胞培养产酶
理化性质
• 英文名：Paclitaxel, Taxol® or
Ph3
O C6H5
Ph2
C6H5 O N H
3' 2' 1'
18 12
AcO
11
10 9 17 2 16
O19
8 3
OH
6 5 20 O
O C6H5
OH
二、动物细胞培养产酶
动物细胞的特性 动物细胞培养特点与培养方式
动物细胞培养的工艺条件控制
动物细胞培养产酶的工艺过程
典型动物细胞培养产酶的工艺过程
2.1 动物细胞的特性
动物细胞的形态
A、贴壁依赖型
1、成纤维细胞（fibroblast 或mechanocyte type)
2、上皮细胞（epithilium cell)
缺点：1、合成过程烦琐复杂，几十步
2、费用高，化学试剂昂贵 3、总收率太低（2%）
• 半合成
以10-DABⅢ和Baccatin Ⅲ作为半合成原料获得 紫杉醇 新方法用10-DAT
优点：1、原料枝叶含量丰富、 提取相
对容易，充分利用再生资源 2、产率较高； 3、可以规模化制备； 4、获取紫杉醇构效关系信息，进 行结构改造; 缺点：合成过程相对复杂 （11步化学转化和7步分离）
3、游走细胞（wondering cell）
4、多形性细胞（polymorphic cell)
B、悬浮型或非贴壁依赖型
1、动物细胞的特性
动物细胞的特性
动物细胞没有细胞壁，适应环境能力差； 动物细胞的体积大，稍小于植物细胞； 大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制 性；
酶工程习题(答案全)
第一章绪论一、名词解释1、酶：是具有生物催化功能的生物大分子2、酶工程：酶的生产与应用的技术过程称为酶工程。
它是利用酶的催化作用进行物质转化的技术，是将酶学理论与化工技术、微生物技术结合而形成的新技术,是借助工程学手段利用酶或细胞、细胞器的特定功能提供产品的一门科学3、核酸类酶:为一类具有生物催化功能的核糖核酸分子.它可以催化本身RNA剪切或剪接作用，还可以催化其他RNA,DNA多糖，酯类等分子进行反应4、蛋白类酶：为一类具有生物催化功能的蛋白质分子，它只能催化其他分子进行反应。
5、酶的生产:是指通过人工操作获得所需酶的技术过程。
主要包括微生物发酵产酶，动植物培养产酶，酶提取和分离纯化等6、酶的改性是通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程,主要包括酶分子的修饰，酶固定化，酶非水相催化等7、酶的应用：是通过酶的催化作用获得人们所需要的物质或者不良物质的技术过程，主要包括酶反应器的选择和设计以及酶在各领域的应用等。
8、酶的专一性：又称为特异性,是指酶在催化生化反应时对底物的选择性，即在一定条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。
亦即酶只能催化某一类或某一种化学反应。
9、酶的转换数：酶的转换数Kp。
又称为摩尔催化活性,是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数二、填空题1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_________和____________两大类.2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是__________，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是________________。
3、进行分子内催化作用的核酸类酶可以分为________________，_________________。
4、酶活力是_______________的量度指标,酶的比活力是_______________的量度指标，酶的转换数的主要组分是________________的度量指标。
酶工程重点
酶活力：指在一定条件下，酶所催化的反应初速度，在外界条件相同的情况下，反应速度越大，意味的酶活力越大。
酶工程：酶的生产与运用的技术过程，其主要任务是通过人工操作，获得人们所需要的酶，并通过各种方法使酶发挥其催化功能。
酶的生物合成：主要指细胞内RNA和蛋白质的合成过程。
分解代谢物阻遏作用：指某些物质（主要是葡萄糖和其他容易利用的碳源）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。
发酵动力学：是研究发酵过程中细胞生长速率，产物生成速率，基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响规律的科学。
溶氧速率：指单位体积的发酵液在单位时间内溶解的氧的量。
耗氧速率：指单位体积培养液中的细胞在单位时间内的耗氧量。
动植物细胞培养产酶：指通过特定技术获得优良的动物和植物细胞，然后在人工控制条件的反应器中进行细胞培养，以获得所需酶的技术过程。
酶的提取与分离纯化：指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的技术过程。
沉淀分离：通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其他溶质分离的技术过程。
离心分离：借助于离心机旋转所产生的离心力，使大小不同，不同密度的物质分离的技术过程。
层析分离：利用混合液中各组分的性质（分子的大小和形状，分子极性，吸附力，分子亲和力，分配系数等）的不同，使各组分以不同比例分布在两相中。
点泳：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程。
酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程。
分子内交联修饰：采用双功能基团化合物（又称双功能试剂）与在酶分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法。
固定化酶：固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。
交联法：指借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。
固定化细胞：固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长繁殖，新陈代谢）的细胞。
第三章酶的生产
2023年5月15日星期一
第三章 酶的生产制备
酶的生产方式
1.提取法: 植物、动物、微生物
2.化学合成法
生物合成法： 利用植物、动物、微生物细胞合成。 上个世纪50年代起利用微生物生产酶
。 1949年细菌发酵生产淀粉酶
上个世纪70年代以来利用植物细胞和 动物细胞培养技术生产酶。
木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜 凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生 产血纤维蛋白溶酶原激活剂
34
2.生长偶联型中的特殊形式——中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生 长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。
所对应的mRNA是不稳定的。
枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 35
3.部分生长偶联型（又称延续合成型）
酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入 平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。
所对应的mRNA相当稳定。
黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线 36
4. 非生长偶联型（又称滞后合成型）
只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并 大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。
所对应的mRNA稳定性高。
黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 37
总结：影响酶生物合成模式的主要因素
②发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除 反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳 氮源的使用，补料发酵）。
③降低产酶温度。
二、细胞生长动力学
微生物细胞生长的动力学方程：
Monod方程：
S－限制性基质浓度； μm—最大比生长速率； Ks —Monod常数
南京林业大学酶工程-3 动、植物细胞发酵产酶讲解
一般为无机氮源。 一般以蔗糖为碳源。
植物细胞培养的工艺条件及其控制（续）
（三）温度的控制 室温（25℃）、 （四）pH值的控制 微酸性（pH5～6） （五）溶解氧的调节控制 代谢慢，耗氧少，对剪切力敏感，搅拌不宜强烈。 （六）光照的控制 （七）前体的添加 提高次级代谢物的产量。 （八）刺激剂(electior)的应用 强化次级代谢产物的生物合成。常用微生物细胞 壁碎片和胞外酶。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
紫草宁及其结构
植物细胞培养的特点（续）
ห้องสมุดไป่ตู้
（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。 （3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影响。 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中各种有 害物质污染和侵蚀。 （5）其它 生物反应器的设计工艺条件注意的问题。
主要产物
醇类，有机酸， 色素，香精， 激素，疫苗， 氨基酸，抗生素， 药物，酶 单克隆抗体， 酶，核苷酸 酶
二、植物细胞培养的特点
（1）提高产率
例如,紫草宁(shikonin) 生产，发酵细胞中的紫 草宁比 紫菜根 (Lithospermum erythrorhizon)中高10 倍，比产率达到种植紫 草的830倍。
动物细胞培养产酶概述
动物细胞培养产酶概述（07生物科学李田07124053）摘要：动物细胞培养开始于本世纪初，1962 年其规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要分。
本文将对动物细胞培养产酶的一般工艺作一综述。
关键词：动物细胞培养小牛血清生物反应器分离纯化酶修饰固定化酶利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50% 。
动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。
目前，动物细胞有悬浮培养和贴壁培养，技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。
药用蛋白质的合成复杂,要有精确折叠的空间结构,要有糖基化,才能使药物发挥真正的功能.细菌和酵母等产品要么是包涵体,要么难以糖基化功能修饰.动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋白质,大规模动物细胞特别是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要.一、.动物细胞培养的特点动物细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养, 但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：①动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；②倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；③培养过程需氧量少（氧传质系数kLa 大于10 h - 1即可满足每毫升107 个细胞的生长）；④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；⑤原代培养细胞一般繁殖50 代即退化死亡；⑥代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。
二、动物细胞培养基特点（一）动物细胞的培养条件⒈器材的清洗和消毒⑴器材的清洗浸泡,刷洗,泡酸,冲洗⑵器材的消毒灭菌物理消毒化学消毒⒉水质 :电阻值大于18MΩ,去热原.⒊ pH:7.2～7.4⒋渗透压:290～300mOsm/kg⒌温度:37±0.5 C⒍空气:氧的饱和质60%,氧分压4～0.7kPa（二）动物细胞的培养基的种类和组成分3类:⒈天然培养基血清,羊水,腹水等,成分复杂,成分不稳定⒉合成培养基⑴氨基酸⑵维生素⑶糖类⑷无机盐⑸其它成分如:添加小牛血清⑴提供生长因子和激素⑵提供贴附因子和伸展因子⑶提供结合蛋白⑷提供必需脂肪酸和微量元素⒊无血清培养基①提高重复性；②减少微生物污染；③供应充足稳定；④产品易纯化；⑤避免血清因素对细胞的毒性；⑥减少血清中蛋白对生物测定的干扰。
动植物细胞培养产酶
合成其所对应的酶；mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入
平衡期而停止酶的生物合成； 不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长 而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞 生长一段时间甚至在平衡期后， 酶才开始合成并大量积累。
第三节 酶生物合成的模式
理想的酶合成模式
发酵产酶， 为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合 成模式应是延续合成型：在发酵过程中没有生长期和产酶期的 明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平 衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。 对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先 进技术,选育得到优良的菌株, 并通过工艺条件的优化控制, 使他 们的生物合成模式更加接近于延续合成型。
and
Monod的工作：
第三节 酶生物合成调节
第三节 酶生物合成调节
3、分解代谢物阻遏：
分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直 接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程 中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。
第三节 酶生物合成的模式
细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历调整 期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段 。 把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续 合成型，中期合成型和滞后合成型。
。 机与速度。
4.结构基因：决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关 系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。
第三节 酶生物合成调节
2、原核生物酶合成调节的操纵子类型： （1）诱导 Induction 组成酶(constitutive enzymes)：细胞固有的酶类。 诱导酶(inducible enzymes：细胞为适应外来底物或其结构类似 物临时合成的一类酶。 。
酶工程
滞后合成型：设法降低培养基中阻遏物的浓度 ，尽量减少甚 至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶 的生物合成提早开始；
中期合成型：在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下 功夫，使其生物合成的开始时间提前， 并尽量 延迟其生物合成停止的时间。
生长因子：细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。
二、微生物培养基
碳源：淀粉或其水解产物 氮源：混合氮源
三、植物细胞培养基
特点：需要大量的无机盐；需要多种维生素和植物生长激素； 一般要求无机氮源；一般以蔗糖为碳源。
常用的培养基：MS培养基、B5培养基、White培养基、KM-8P培养基等。
配制方法：先配制母液； 大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、微生素 母液、植物激素母液。
第三节 产酶工艺条件及其调节控制
保藏细胞
原生质体
细胞活化 细胞扩大培养
固定化细胞
固定化原生质体
培养基
产酶
分离纯化
预培养
无菌空气
酶
图3-1 酶生产的工艺流程
一、细胞活化与扩大培养
将保藏的细胞接种于新鲜的培养基上，在一定的条件下进行 培养，使细胞的生命活性得以恢复的过程。
条件：适合细胞生长、繁殖的最适条件
四、固定化微生物细胞发酵产酶
固定化细胞：采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范 围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。
（一）固定化细胞发酵产酶的特点
提高产酶率 可以反复使用或连续使用较长时间 稳定性好 缩短发酵周期，提高设备利用率 产品容易分离纯化 适用于胞外酶等胞外产物的生产
（二）固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制
同，进行光照的调节控制； 前体的添加：目的代谢物代谢途径上游的物质。 刺激剂的应用：常用的刺激剂有微生物细胞的碎片和果胶酶、
酶工程：动植物细胞培养产酶
四、植物细胞培养产酶的工艺过程
以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例
SOD是生物体内清除超氧化物阴 离子自由基(O 2—)的重要金属酶 类。它和过氧化氢酶、过氧化物 酶一起构成了生物体内重要的酶 促反应防御体系，从而维护生物 体内细胞正常的生理代谢和生化 反应。衰老自由基学说认为衰老 源于机体正常代谢过程中产生过 量的自由基对机体损害的结果。 超氧化物歧化酶(SOD)作为能催化 超氧阴离子发生歧化反应的自由 基清除剂，具有延缓衰老的作用。
(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈 伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D 和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS 培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃， 600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使 愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞 团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux， 12h/d光照条件下震荡培养18d。
二、动物细胞培养的特点
（1）主要用于生产各种功能蛋白质； （2）生长缓慢； （3）需加抗生素防污染； （4）细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感； （5）具锚地依赖性，宜贴壁培养；部分用悬浮培养； （6）培养基成分复杂，反应过程成本高，产品价格贵 ；
二、植物细胞培养的特点
（1）提高产率
例如：紫草宁的生产， 发酵细胞中的紫草宁比 紫草根中高10倍。
紫草宁的结构
（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。 （3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影 响。 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中 各种有害物质污染和侵蚀。 （5）其它 设计植物细胞生物反应器和控制工艺条件时应 注意一些问题。
第二章_酶的生物合成法生产
Section 4 固定化微生物细胞发酵产酶
一、固定化微生物细胞发酵产酶的特点： 二、固定化微生物细胞发酵产酶的工艺条件控制： 三、固定化微生物细胞生长和产酶动力学：
Section 5 固定化微生物原生质体发酵产酶
一、固定化微生物原生质体的特点： 二、固定化微生物原生质体发酵产酶的工艺条件控制：
三、发酵工艺条件及其控制 1、细胞活化与扩大培养
2、培养基的配制： ①碳源: ②氮源: ③无机盐: ④生长因子等。 3、pH值的调节控制： 4、温度的调节控制： 5、溶解氧的调节控制：
四、提高酶产量的措施： 1、添加诱导物： ①酶的作用底物 ②酶的反应产物 ③酶的底物类似物： 2、控制阻遏物的浓度： 3、添加表面活性剂： 如：吐温(Tween)、特里顿(Triton)等， 4、添加产酶活性剂：
Chapter Two 酶的生物合成法生产
Section 1 基本概述 一、酶的生物合成法生产概念 1、酶的生物合成 2、酶的发酵生产 3、酶的生物合成法生产 二、优良的产酶细胞应具备的条件 1、酶的产量高； 2、易培养和管理； 3、产酶稳定性好； 4、利于分离纯化； 5、安全可靠等。
开始，而在细胞进入平衡期后，酶的合成也随之停止。
④滞后合成型：只有当细胞生长进人平衡以后，酶才
开始合成并大量积累。
2、细胞生长动力学：
在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比：
式中: rX——细胞生长速率 X-----细胞浓度 μ——比生长速率
当培养物中只有一种限制性基质，而不 存在其它限制生长的因素时，μ为此限制性 基质浓度的函数，这就是Monod生长动力学 模型：
酶的生物合成与发酵生产
已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶； -半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。
实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞 内无上述三种酶合成；
（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有 上述三种酶合成；
（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。
A.有活性阻遏蛋白
调节基因
阻遏蛋白 (有活性) 启动基因 操纵基因
结构基因
阻遏蛋白阻挡操纵基因 结构基因不表达
B.有活性阻遏蛋白加诱导剂
mRNA 酶蛋白 诱导物 诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起 到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达
C.无活性阻遏蛋白
mRNA
阻遏蛋白(无活性)
酶蛋白 阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达
体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。
色氨酸操纵子——酶的阻遏
结构基因 调节基因 操纵基因 调节基因
操纵基因
结构基因
mRNA 酶蛋白
辅阻遏物
代谢产物与阻遏蛋白结 阻遏蛋白不能与操纵基因结合， 合，使之构象发生变化 与操纵基因结合，结构基 结构基因表达 因不能表达
酶 的 诱 导 和 阻 遏 操 纵 子 模 型
有两个位点： （1）RNA聚合酶的结合位点 （2）cAMP-CAP的结合位点。 CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。 只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA 聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才 能开始。 P S DNA O R
酶工程第三章 动植物细胞培养产酶
制备微载体的材料主要有：
葡聚糖（DEAE—Sephadex A50及A25 ） 塑料 明胶 玻璃 纤维素
四、动物细胞培养的工艺条件及其控制
种质细胞：体细胞、杂交瘤细胞； 工艺过程：
胰蛋白酶
种质 细胞
悬浮 细胞
悬浮培 养或贴 壁培养
收集培 养液、 分离纯 化
（一）动物细胞培养基组成成分
生产组织纤溶酶原活化剂的工艺过程
１、人黑色素瘤细胞培养基；
２、人黑色素瘤细胞培养；
３、组织纤溶酶原激活剂的分离纯化。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
1、氨基酸：各种必需氨基酸，谷氨酰胺等， 作为碳源和能源利用； 2、维生素：血清中，B族和维C； 3、无机盐：调节渗透压； 4、葡萄糖：作为碳源和能源； 5、激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松； 6、生长因子：如表皮生长因子、神经生长 因子、成纤维细胞生长因子。
（二）动物细胞培养基的配制
首先配制各类母液，使用前混合过滤除菌， 使用时稀释至所需浓度； 各种动物培养基已商品化。
（六）溶解氧的控制
溶解氧的供给对动物细胞培养至关重要； 采用调节混合气体的量与比例的方法。
动物细胞产酶的工艺流程
动物细胞产酶的工艺流程嘿，咱今儿就来唠唠动物细胞产酶的工艺流程，这可有意思啦！你想啊，动物细胞就像一个小小的神奇工厂，里面进行着各种奇妙的反应，最终生产出我们需要的酶。
那这过程就好比一场精彩的演出，每个环节都得配合得恰到好处。
首先呢，得有优质的动物细胞。
这就好比是盖房子得有好的砖头一样，细胞质量可太重要啦！得精心挑选、培养这些小家伙们，给它们提供合适的环境，让它们舒舒服服地成长。
然后呢，就是要让这些细胞开始工作啦！就像运动员要开始比赛一样，得给它们加把劲。
通过各种手段来诱导它们，让它们知道该发力啦，该生产酶啦！这可不是一件容易的事儿，得把握好火候，不能太急也不能太慢。
接着呀，这些细胞生产出酶之后，还得把酶从细胞里面弄出来。
这就像是从一堆宝藏里面找出我们想要的宝贝一样，得有技巧。
不能把细胞给弄坏了，还得把酶完整地拿出来。
有时候就感觉像是在解一道很难的谜题，得绞尽脑汁。
弄出来的酶还不能直接就用呢，还得进行纯化。
这就好比把刚挖出来的金子进行提炼，去掉杂质，让它变得更加纯粹、更加闪亮。
这纯化的过程可马虎不得，得仔细再仔细。
你说这动物细胞产酶的工艺流程是不是很神奇？就像变魔术一样，从小小的细胞变成了有用的酶。
这中间的过程充满了挑战和乐趣，每一步都需要我们用心去对待。
咱再想想，要是没有这个工艺流程，我们好多事情都没法干呀！那些需要酶来帮忙的反应怎么进行呢？那我们的生活不就少了很多便利和精彩嘛！所以说呀，这个工艺流程可太重要啦，就像我们生活中的阳光和水一样不可或缺。
总之呢，动物细胞产酶的工艺流程就是这么神奇又有趣，它让我们的生活变得更加丰富多彩。
我们可得好好感谢那些研究和掌握这个工艺流程的科学家们，是他们让这一切成为可能。
让我们一起为这个神奇的工艺流程点赞吧！。
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动物细胞培养产酶概述（07生物科学李田07124053）摘要：动物细胞培养开始于本世纪初，1962 年其规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要分。
本文将对动物细胞培养产酶的一般工艺作一综述。
关键词：动物细胞培养小牛血清生物反应器分离纯化酶修饰固定化酶利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50% 。
动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。
目前，动物细胞有悬浮培养和贴壁培养，技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。
药用蛋白质的合成复杂,要有精确折叠的空间结构,要有糖基化,才能使药物发挥真正的功能.细菌和酵母等产品要么是包涵体,要么难以糖基化功能修饰.动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋白质,大规模动物细胞特别是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要.一、.动物细胞培养的特点动物细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养, 但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：①动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；②倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；③培养过程需氧量少（氧传质系数kLa 大于10 h - 1即可满足每毫升107 个细胞的生长）；④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；⑤原代培养细胞一般繁殖50 代即退化死亡；⑥代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。
二、动物细胞培养基特点（一）动物细胞的培养条件⒈器材的清洗和消毒⑴器材的清洗浸泡,刷洗,泡酸,冲洗⑵器材的消毒灭菌物理消毒化学消毒⒉水质 :电阻值大于18MΩ,去热原.⒊ pH:7.2～7.4⒋渗透压:290～300mOsm/kg⒌温度:37±0.5 C⒍空气:氧的饱和质60%,氧分压4～0.7kPa（二）动物细胞的培养基的种类和组成分3类:⒈天然培养基血清,羊水,腹水等,成分复杂,成分不稳定⒉合成培养基⑴氨基酸⑵维生素⑶糖类⑷无机盐⑸其它成分如:添加小牛血清⑴提供生长因子和激素⑵提供贴附因子和伸展因子⑶提供结合蛋白⑷提供必需脂肪酸和微量元素⒊无血清培养基①提高重复性；②减少微生物污染；③供应充足稳定；④产品易纯化；⑤避免血清因素对细胞的毒性；⑥减少血清中蛋白对生物测定的干扰。
无血清培养基加入添加剂：⑴生长因子和激素；⑵结合蛋白；⑶贴附因子和伸展因子；⑷有利细胞生长的因子和元素。
三、动物细胞培养方法动物细胞是一种无细胞壁的真核细胞，生长缓慢，对培养环境十分敏感。
采用传统的生物化工技术进行动物细胞大量培养，除了要满足培养过程必需的营养要求外，有必要建立合理的控制模型，进行pH和溶氧（DO）的最佳控制。
细胞生物反应器可通过微机有序地定量地控制加入动物细胞培养罐内的空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体的流量，使其保持最佳的比例来控制细胞培养液中的pH值和溶氧水平，使系统始终处于最佳状态，以满足动物细胞的生长对pH 值和溶解氧的需要。
如为提高或达到一定的溶氧水平可改变通入培养罐内气体中氧气和氮气的比例来实现控制DO值的目的。
采用二氧化碳/碳酸氢钠（CO2/NaHCO3）缓冲液系统来控制培养液的pH值是一种较好的方法。
现在，由于动物细胞培养技术在规模和可靠性方面都不断发展，且从中得到的蛋白质也被证明是安全有效的，因此人们对动物细胞培养的态度已经发生了改变。
许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些相对较大、较复杂或糖基化（glycosylated）的蛋白质来说，动物细胞培养是首选的生产方式。
60年代初，英国AVRI研究所在贴壁细胞系BHK21中将口蹄疫病毒培养成功后，从最初的200mL和800mL玻璃容器开始，很快就放大到30L和100L不锈钢罐的培养规模。
使用的是基于Eagles配方的培养基，补充5%成年牛血清和蛋白胨。
1967年以后，Wellcome（现为Cooper动物保健）集团分布于欧洲、非洲和南美洲8个国家的生产厂商，应用此项技术工业规模化生产口蹄疫疫苗和兽用狂犬疫苗，已掌握了5000L的细胞罐大规模培养技术。
大规模培养常用方法：根据动物细胞的类型，可采用贴壁培养、悬浮培养和固定化培养等三种培养方法进行大规模培养。
（一）动物细胞生长特性及培养温度1.细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素2.细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差3.需氧少，不耐受强力通风与搅拌4.群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）5.培养过程产品分布细胞内外，成本高6.原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡依据在体外培养时对生长基质依赖性差异，动物细胞可分为两类：贴壁依赖型细胞：需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长，大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。
非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表面即可生长，包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化细胞。
培养细胞的最适温度相当于各种细胞或组织取材机体的正常温度。
人和哺乳动物细胞培养的最适温度为35~37℃。
偏离这一温度，细胞正常的代谢和生长将会受到影响，甚至死亡。
总的来说，培养细胞对低温的耐力比高温高。
温度不超过39℃时，细胞代谢强度与温度成正比；细胞培养置于39~40℃环境中1h，即受到一定损伤，但仍能恢复；当温度达43℃以上时，许多细胞将死亡。
当温度下降到30~20℃时，细胞代谢降低，因而与培养基之间物质交换减少。
首先看到的是细胞形态学的改变以及细胞从基质上脱落下来。
当培养物恢复到初始的培养温度时，它们原有的形态和代谢也随之恢复到原有水平。
（二）贴壁培养（attachment culture）是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。
1.生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。
一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
2.贴壁培养的优点：容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。
容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。
当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。
同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。
适用于所有类型细胞。
3.贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长；4.细胞贴壁的表面：要求具有净阳电荷和高度表面活性。
对微载体而言还要求具一定电荷密度；若为有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。
5.贴壁培养系统：主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。
转瓶培养系统：培养贴壁依赖型细胞最初采用转瓶系统培养。
转瓶培养一般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段，或作为生物反应器接种细胞准备的一条途径。
细胞接种在旋转的圆筒形培养器-转瓶中，培养过程中转瓶不断旋转，使细胞交替接触培养液和空气，从而提供较好的传质和传热条件。
转瓶培养具有结构简单，投资少，技术成熟，重复性好，放大只需简单的增加转瓶数量等优点。
但也有其缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受到限制等。
现在使用的转瓶培养系统包括二氧化碳培养箱和转瓶机两类。
反应器贴壁培养此种培养方式中，细胞贴附于固定的表面生长，不因为搅拌而跟随培养液一起流动，因此比较容易更换培养液，不需要特殊的分离细胞和培养液的设备，可以采用灌流培养获得高细胞密度，能有效地获得一种产品；但扩大规模较难，不能直接监控细胞的生长情况，故多用于制备用量较小、价值高的生物药品。
CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器是常用的贴壁培养式生物反应器，用于细胞贴壁培养时可用篮式搅拌系统和圆盘状载体。
篮式搅拌系统和载体培养是目前贴壁细胞培养使用最多方式，用于杂交瘤细胞、Hela细胞、293细胞、CHO细胞及其它细胞培养。
此种方式培养细胞，细胞接种后贴壁快。
（三）悬浮培养（suspension culture）：是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。
主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等；是在微生物发酵的基础上发通起来的。
无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方向。
（四）固定化培养（immobilization culture）：是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养。
上述两大类细胞都适用，具有细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易于产物分开，有利于产物分离纯化。
制备方法很多，包括吸附法、共价贴附法、离子/共价交联法、包埋法、微囊法等。
1.吸附法2.共价贴附法3. 离子/共价交联法4.包埋法5.微囊法（microencapsulation）四、培养条件的影响与控制（1）温度：一般控制在36.5℃.（2）pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。
（3）渗透压: 应与细胞内渗透压相同。
（4）溶解氧：根据情况随时调节。
五、动物细胞产品的纯化方法和质量要求（一）动物细胞产品的常用纯化方法1. 离心2. 离子交换层析3. 凝胶过滤4. 亲和层析5. 盐析和有机溶剂沉淀6. 透析7. 高压液相层析（二）动物细胞产品的质量要求1. 对工程细胞的要求2. 对生产工艺的要求3. 对产品的质量要求动物细胞产品的制造实例：类淋巴细胞干扰素、组织型纤溶酶原激活剂、单链尿型纤溶酶原激活剂、促红细胞生成素、凝血因子Ⅷ等。
六、动物细胞制药的前景与展望商业用酶来源于动植物组织和某些微生物。
传统上由植物提供的酶有蛋白酶、淀粉酶、氧化酶和其他酶，由动物组织提供的酶主要有胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪生产的凝乳酶。
但是，从动物组织或植物组织大量提取的酶，经常要涉及技术上、经济上以及伦理上的问题，使得许多传统的酶源已远远不能适应当今世界对酶的需求。
动物细胞产酶的研究应用有待更进一步的优化和扩大。
参考文献：[1] 郭勇. 2004. 酶工程.北京：科学出版社[2] 杨淑慎.2009.细胞工程. 北京：科学出版社[3] 邹寿长李干祥等.大规模动物细胞培养技术研究进展[J].生命科学研究,2001,5(2):102-108.[4] 陈昭烈肖成祖.动物细胞无血清培养基及其应用[J].生物工程进展,:.。