PCR技术(包含引物设计)
PCR引物设计详细步骤
PCR引物设计详细步骤引言PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中常用的技术，用于放大DNA片段。
在PCR过程中，引物的选择非常重要，因为引物的设计质量直接影响到PCR反应的效率和准确性。
本文将详细介绍PCR引物设计的步骤。
步骤1. 确定目标序列首先，需要确定所要放大的目标序列。
这可以是任何你感兴趣的DNA片段，如某个基因的编码区域，特定的DNA序列等。
2. 提取目标序列从已有的DNA样本中提取目标序列。
可以通过DNA提取试剂盒等方法进行提取，确保获得纯净的DNA。
3. 序列比对使用BLAST等工具将目标序列与已知的序列数据库进行比对，以确认目标序列的唯一性和可能存在的变异。
4. 引物设计原则根据目标序列，设计符合以下原则的引物：•引物长度通常在18-25个碱基对之间。
•碱基组成均匀，避免引物中存在大量的G或C碱基，以及连续多个重复的碱基。
•引物之间的互补性尽量避免，以防止二聚体的形成。
•避免引物末端存在碱基的互补序列，以防止非特异性扩增。
5. 引物设计工具使用引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST等，在目标序列中选择合适的引物。
这些工具可以根据给定的参数，自动设计合适的引物。
6. 引物评估对设计的引物进行评估，包括检查引物的反向互补性、引物的Tm值（熔解温度）、引物的二聚体和自身结构等。
确保引物的质量达到实验要求。
7. 引物合成将设计好的引物发送给合成公司进行合成。
确保引物的纯度和浓度符合要求。
8. PCR反应使用合成的引物进行PCR反应，按照标准的PCR反应体系和条件进行。
根据实验需求调整PCR反应的温度、时间等参数。
9. PCR产物验证通过凝胶电泳等方法验证PCR反应产物的大小和纯度。
确保PCR反应成功，并且没有非特异扩增的产物。
结论PCR引物设计是PCR反应成功的关键。
通过遵循引物设计的原则，结合引物设计工具的辅助，可以设计出合适的引物，弥补PCR技术在DNA放大中的巨大优势，为实验研究提供有效的工具。
PCR技术和引物设计
PCR技术和引物设计PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
引物设计是PCR技术中的重要步骤，它决定了PCR反应的特异性和效率。
下面将对PCR技术和引物设计进行详细介绍。
PCR技术是由美国科学家凯瑟琳·穆利斯（Kary Mullis）于1983年发明的，他因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR技术利用了DNA的特性：DNA可以通过热变性（denaturation）使双链分离，然后通过低温环境下的适当引物进行互补连接，再通过DNA聚合酶进行扩增。
整个扩增过程可以重复进行多次，从而大幅度增加了DNA的数量。
PCR技术已经在许多领域得到了广泛应用，比如医学诊断、基因工程、遗传疾病研究等。
PCR技术主要包括三个步骤：变性、退火和扩增。
首先，将反应体系温度升至94-95摄氏度，使DNA双链变性并分离成两个单链（denaturation）；然后，降低温度至50-60摄氏度，引物与模板DNA互相结合（annealing）；最后，将温度升至72摄氏度，DNA聚合酶在适当条件下扩增DNA片段（extension）。
一次PCR循环一般需要30秒至2分钟，整个PCR过程需要重复数十次至数百次。
在PCR反应中，引物设计至关重要，它决定了PCR反应的特异性和效率。
引物通常是由20-30个核苷酸组成的DNA或RNA片段，其中的序列要与待扩增的DNA靶标序列互补。
引物的设计需要考虑以下因素：1.引物长度：引物长度一般为18-30个碱基，较短的引物具有更好的扩增效率，但其特异性可能降低；较长的引物特异性较好，但扩增效率可能降低。
2.引物的GC含量：引物的GC含量越高，PCR反应的特异性越好。
一般来说，引物的GC含量应在40-60%之间。
3.引物的Tm值：Tm值是指引物与DNA靶标序列之间的解离温度，一般在55-65摄氏度之间。
Tm值的高低决定了引物的特异性，过低的Tm值可能导致引物与非特异DNA片段结合，影响扩增效率和特异性。
PCR引物设计
PCR引物设计PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR引物的设计对PCR反应的成功与否至关重要。
下面将详细介绍PCR引物的设计过程。
第一步，选择目标序列。
在设计PCR引物之前，首先需要确定要扩增的目标序列。
目标序列可以来自已知基因的特定片段，也可以通过测序等方法获得。
第二步，引物长度和温度。
PCR引物通常为单链DNA片段，一般长度在18-30个碱基对之间。
引物长度过短容易引起非特异性扩增，引物长度过长则会导致特异性降低。
此外，引物的长度还会影响PCR反应的温度。
一般情况下，引物的长度越长，PCR反应的温度就需要越高。
通常，引物的长度最好在20-24个碱基对之间。
第三步，引物序列的选择。
为了确保PCR反应的特异性，引物的选择至关重要。
引物应具有与目标序列完全互补的碱基序列，以确保引物能够精确结合到目标序列上。
此外，引物的序列还应避免序列内部的反向重复和结合位点之间的重复序列。
第四步，引物的熔解温度（Tm）的确定。
引物的熔解温度是引物与模板DNA结合的温度。
引物的熔解温度应该尽量接近反应的最低温度，以确保引物能够与目标序列特异性结合。
引物的Tm可以通过以下公式计算：Tm = 69.3 + 0.41 * (G+C%) - 650/length其中G+C%表示引物中鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的百分含量，length表示引物的长度。
第五步，特异性分析。
在设计引物之前，可以通过生物信息学工具对引物进行特异性分析。
特异性分析可以通过引物序列与目标序列的比对来进行。
引物在目标序列上应有唯一的结合位点，并且不应该与其他非目标序列有任何重复的位点。
第六步，引物的杂交性能。
为了确保引物的杂交性能，引物应具有适当的糖尖端修饰和杂交性能。
糖尖端修饰可以增强引物的杂交性能，并减少非特异性结合。
此外，引物的GC含量应该适中，过高或过低都可能导致非特异性结合的问题。
第七步，引物的交叉反应。
pcr引物设计序列例题
PCR引物设计序列例题简介P C R（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，通过扩增DN A 分子可用于基因克隆、检测等多个领域。
而P CR引物则是PCR反应中的关键组成部分，它们的设计直接影响P CR反应的成功与否。
本文为您提供一些关于P CR引物设计序列的例题，希望对您在实验和研究中的引物设计有所帮助。
例题一：引物序列设计为了扩增目标基因的特定片段，我们需要设计一对引物，以下是目标基因的序列，请根据该序列设计两个引物，使其具有以下要求：-引物长度在18-25个碱基对之间-引物的3'端碱基G或C-引物的理论Tm在55-65℃之间目标基因序列：A G TC GA TC GA TT AG CGA T CG AG TC GA TC GA TCG G CT AC GA TC GA解答：根据目标基因的序列，我们可以设计如下两对引物：引物1：5'-A GT CG AT CG AT TAG C GA TC-3'引物1满足引物长度在18-25个碱基对之间的要求，同时3'端碱基为C，符合要求。
接下来我们计算一下该引物的理论T m。
根据以下两个规则计算引物的理论Tm：-A与T之间的配对带来的热能释放为-2.2k J/mo l-C与G之间的配对带来的热能释放为-3.8k J/mo l根据以上规则，我们可以计算每个碱基的贡献：-A-T配对:-2.2k J/m o l-C-G配对:-3.8k J/m o l-G-C配对:-3.8k J/m o l-T-A配对:-2.2k J/m o l引物1的理论T m计算如下：(-3.8×4)+(-2.2×10)=-15.2+-22=-37.2k J/mo l该引物的理论Tm为37.2℃，低于所需的要求。
引物2：5'-C GA TC GA TC GA TCG G CT AC G-3'引物2满足引物长度在18-25个碱基对之间的要求，同时3'端碱基为G，符合要求。
PCR引物设计原理
PCR引物设计原理PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增特定DNA序列。
PCR引物设计是PCR实验的关键步骤，合理的引物设计能够确保PCR反应的特异性和高效性。
1.引物长度：通常，PCR引物的长度在18-25个碱基对之间，较短的引物能够提高PCR扩增的特异性，但也会减弱引物与模板DNA的互补性。
较长的引物能够提高PCR扩增的选择性，但也会增加二次结构的可能性。
2. 引物温度：引物通常被设计成具有相似的熔解温度（Tm），即引物与模板DNA解离的温度。
Tm计算可根据引物序列中的碱基组成和长度来进行，通常采用Wallace规则或Marmur规则。
相似的Tm可以确保引物在PCR反应中一起工作，提高特异性和扩增效率。
3.引物特异性：为了确保PCR扩增的特异性，引物应在模板DNA中有唯一的互补区域。
这可以通过NCBI的BLAST或其他引物设计软件进行引物序列比对来验证。
特异性也可以通过引物的3'端碱基匹配限制来提高。
此外，避免引物之间的重叠或互补也可以减少非特异性扩增的风险。
4.引物GC含量：GC含量是影响PCR引物的熔解温度和特异性的重要因素。
高GC含量的引物比低GC含量的引物具有更高的熔解温度，因此在高GC含量的引物中，引物长度应适当缩短，以保持相似的Tm。
此外，高GC含量的引物在互补区域中与模板DNA结合更牢固，有利于特异性扩增。
5.引物末端修饰：末端修饰可以改变引物的特性，如增加引物的亲合性、稳定性和特异性。
一般采用引物末端加入磷酸基团或胺基基团的修饰，用于提高引物的稳定性和抗核酸酶降解的能力。
6.引物序列的配对：在PCR反应中，两个引物需要配对以形成DNA双链，在DNA扩增过程中选择性地与模板DNA结合。
引物配对需要满足碱基之间的互补关系。
因此，引物序列的选择应考虑到碱基之间的配对能力。
总结起来，PCR引物设计的原理主要涉及引物长度、温度、特异性、GC含量、末端修饰和序列配对。
简述PCR技术的原理与应用
简述PCR技术的原理与应用1. PCR技术的原理PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种通过复制DNA序列的方法，可以从微量DNA样本中扩增出足够量的DNA片段。
PCR技术主要包括以下几个步骤：1.1. 反应体系的组成•DNA模板：待扩增的DNA片段；•引物：设计特异性引物，用于选择性扩增目标DNA片段；•dNTPs：四种单核苷酸，作为DNA合成的基础单元；•DNA聚合酶：具有DNA合成酶活性，能在适宜温度下催化DNA片段的合成；•缓冲液：提供适宜的pH值和离子浓度；•镁离子：DNA聚合酶的活性所需；•辅酶：某些PCR反应需要添加特定的辅助酶。
1.2. 扩增步骤1.反应体系在高温条件下发生变性，使DNA双链解开，形成两条单链DNA。
2.体系降温，引物结合到目标DNA上，为DNA合成提供起始位置。
3.酶依据引物的模板特异性，在适宜温度下合成DNA链，从而扩增出目标DNA片段。
4.扩增片段在每个循环中成倍增加，经过多个循环后，得到大量目标DNA。
1.3. PCR的循环PCR技术通过多次循环反应来扩增目标DNA。
PCR循环通常包含以下几个阶段：1.变性：将反应体系加热至95°C，使DNA双链变性，分离为两条单链DNA。
2.引物结合：通过降温至较低温度，使引物与目标DNA片段互补结合。
3.DNA合成：在适宜温度下，DNA聚合酶合成新的DNA链，以引物为起始点。
4.循环：重复以上步骤，使目标DNA不断扩增。
2. PCR技术的应用PCR技术在生物医学研究、医学诊断、法医学、农业和环保等领域有广泛的应用。
2.1. 生物医学研究PCR技术在生物医学研究中起到关键作用，主要应用于以下方面：- 基因克隆：通过PCR技术扩增目标基因，再进行重组、克隆等操作。
- 基因分型：PCR技术可以用来检测个体的基因型，研究基因与疾病的关联。
- 基因表达定量：可以通过PCR测定特定基因在不同组织或条件下的表达水平。
pcr引物设计原理
pcr引物设计原理PCR引物设计原理。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，它可以在体外迅速扩增DNA片段，是分子生物学实验中常用的技术手段之一。
而PCR引物设计是PCR技术成功实施的关键，合理的引物设计可以保证PCR反应的准确性和高效性。
本文将介绍PCR引物设计的原理和关键要点。
1. 引物的选择。
在PCR反应中，引物是起到扩增目的DNA片段的作用，因此引物的选择非常重要。
引物通常是由20-30个碱基组成的寡核苷酸，它们分别位于目的DNA片段的两端。
在选择引物时，需要注意以下几点：引物的长度，引物的长度通常在18-25个碱基之间，过长的引物可能会导致非特异性扩增，而过短的引物可能会导致特异性不足。
引物的碱基组成，引物的碱基组成需要符合一定的比例，其中GC含量在40%-60%之间为宜，这样可以保证引物在反应温度下的稳定性和特异性。
引物的特异性，引物需要与目的DNA片段的序列完全匹配，以确保扩增的特异性。
2. 引物的设计。
引物的设计通常是通过计算机软件进行，常用的软件有Primer3、Oligo等。
在设计引物时，需要输入目的DNA片段的序列，软件会根据一定的算法和规则自动生成合适的引物。
在引物设计过程中，需要注意以下几点：引物之间的配对，引物对之间的碱基配对需要避免形成二聚体或者内聚体，这样可以避免引物之间的相互作用影响PCR反应的效果。
引物的位置，引物需要位于目的DNA片段的两端，同时需要避开重复序列或者其他干扰因素，以确保扩增的特异性和准确性。
3. 引物的验证。
设计好引物之后，需要进行一定的验证工作，以确保引物的质量和特异性。
常用的验证方法包括：电泳分析，通过电泳分析引物扩增产物的大小和特异性，可以初步判断引物的质量和特异性。
序列分析，对引物扩增产物进行测序分析，可以确保引物扩增的是目的DNA 片段，而不是其他非特异性产物。
4. 引物的优化。
在实际应用中，有时候设计的引物可能并不能满足要求，需要进行一定的优化工作。
PCR实验室操作流程
PCR实验室操作流程PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种可以通过体外合成DNA的方法，也是现代生物技术中一项重要的分子生物学技术。
PCR技术的应用广泛，包括基因测序、基因突变检测、表达定量等。
下面是PCR实验室操作的一般流程。
1.设计引物：PCR实验的第一步是设计引物。
引物是用于扩增目标DNA片段的短链DNA序列。
两个引物分别对应目标序列的两端，其长度通常在18-24个碱基对之间。
引物的碱基序列必须与目标序列互补，以确保引物的结合和扩增特异性。
2. 制备PCR反应液：将PCR反应所需的试剂制备成PCR反应液。
PCR 反应液包括模板DNA、引物、聚合酶、反应缓冲液、dNTPs和Mg2+等。
聚合酶可以是常见的Taq聚合酶，也可以是其他高保真度的热稳定聚合酶。
反应缓冲液包含缓冲盐、pH调节剂和聚乙二醇等成分。
3.加热变性：PCR反应开始前，需要对DNA模板进行热变性，将其双链DNA解开成单链DNA，以供引物结合。
一般在95℃左右进行加热变性步骤，持续1-5分钟。
4.循环扩增：PCR实验主要包括循环扩增的步骤。
循环扩增主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
变性温度一般设置在94-98℃，可以使DNA双链变为单链；退火温度根据引物序列的特性来设计，一般设置在50-70℃之间，可以使引物与DNA模板序列结合；延伸温度一般为72℃，此温度下聚合酶能够合成新的DNA链。
5.PCR循环反复：PCR反应通常进行30-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸的三个步骤。
这样可以进行指数级扩增，生成大量目标DNA片段。
6. PCR产物检测：PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳等方法对PCR产物进行检测。
将PCR产物与DNA分子量标记物一起电泳，可以通过与标准品比较得知扩增片段的大小。
也可以通过染色剂如SYBR Green等进行荧光定量，或者使用定量PCR方法定量扩增产物的数量。
7.结果分析和数据处理：根据PCR产物的结果进行数据分析和处理。
pcr设计方案
PCR设计方案引言PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学研究和临床诊断的技术。
它能在体外复制DNA序列，并通过放大检测目标DNA的数量。
本文档旨在提供一种PCR设计方案，确保PCR实验的准确性和可靠性。
实验设计此PCR设计方案包括以下步骤：1.靶标选择：选择适合的DNA序列作为PCR反应的靶标。
确保靶标在目标样品中存在且具有生物学意义。
2.引物设计：设计合适的引物，以扩增目标DNA序列。
引物应满足以下要求：–引物长度：一般为18-30个碱基对。
–Tm值：引物的Tm值应接近或略高于PCR反应的最佳温度。
–引物间相互作用：引物对之间不应有明显的互相杂交，以避免产生非特异性扩增产物。
3.杂交温度优化：根据引物的Tm值确定PCR反应的最佳杂交温度。
通常，杂交温度设置为引物Tm值的5°C-10°C。
4.建立PCR反应体系：准备PCR反应体系，包括以下组分：–DNA模板：目标DNA的少量纯化物或DNA提取物。
–引物：前述设计的引物。
–DNA聚合酶：选择具有高稳定性和高扩增效率的DNA聚合酶。
–反应缓冲液：含有适当浓度的Mg^2+离子和其他辅助成分的缓冲液。
–dNTPs：四种单核苷酸。
–模板DNA稀释缓冲液：用于稀释目标DNA的高浓度溶液。
5.PCR扩增条件优化：对PCR扩增条件进行优化，包括：–初始变性步骤：将PCR反应体系加热至94°C-95°C，以解开DNA的双链结构。
–变性步骤：保持高温（94°C-95°C）以保持DNA变性状态。
–环式扩增步骤：设置合适的温度和时间，以使引物与目标DNA杂交并DNA 聚合酶在此温度下进行链延伸。
–末端延伸步骤：进行降温，以使DNA聚合酶完成末端延伸。
6.实验验证：进行PCR扩增并验证扩增产物的特异性。
可通过以下方法进行验证：–凝胶电泳：将PCR反应产物与DNA标准品一同进行凝胶电泳，以确定产物的大小和纯度。
PCR技术克隆目的基因全过程
PCR技术克隆目的基因全过程PCR（聚合酶链式反应）是一种体外的DNA合成技术，可以通过放大目的基因序列来克隆和检测DNA。
以下是PCR技术克隆目的基因全过程的详细解释。
1.设计引物：引物是用于扩增目的基因的短DNA片段。
引物分为前向引物和反向引物，其序列分别与目的基因的5’和3’末端相互匹配。
引物的设计应该尽量避免互相形成二聚体或发生引物间杂交。
一般情况下，前向引物和反向引物的长度约为18-30个碱基。
2.DNA模板的准备：DNA模板是PCR反应中的起始材料，可以是从细胞中提取的基因组DNA、cDNA或合成的DNA片段等。
DNA模板需要经过特定的处理步骤，如酶切或热变性，以解开DNA双链结构，使得引物能够与目的基因序列起始材料结合。
3.PCR反应体系的制备：PCR反应体系通常包含DNA模板、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、聚合酶、缓冲液和稀释的镁离子。
这些成分需要以特定的量和浓度配制在一起。
在反应体系中加入适量的聚合酶，可以保证PCR反应能够进行。
4.PCR扩增条件设定：PCR反应需要经历一系列的温度变化，这些温度的设定旨在创造一个适宜扩增引物的环境。
PCR反应通常包含三个主要的步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤中，DNA模板的双链结构被加热到95°C，使其变性为两条单链DNA。
退火步骤中，反应体系温度降至碱基互补序列的温度，使引物能够与DNA模板结合。
延伸步骤中，反应体系温度升至适合聚合酶的工作温度，引物被复制形成两条新的双链DNA。
这三个步骤的温度和时间根据目的基因的特性和引物的设计来设定。
5.PCR扩增循环：PCR反应通常包含20-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸三个步骤。
每个循环都会使目的DNA序列扩增一倍。
PCR反应的循环数取决于目的基因的起始材料的丰度和所需扩增的DNA数量。
6.PCR产物检测：PCR扩增产物可以通过凝胶电泳等方法进行检测。
凝胶电泳可以将PCR扩增产物按照大小分离。
PCR引物设计方法
PCR引物设计方法引言PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它能够在体外扩增DNA序列，从而使之得到大量复制。
而PCR引物是PCR反应中起到引导DNA扩增的关键组分。
本文将介绍PCR引物的设计方法，帮助读者更好地设计适用于特定DNA序列的引物。
引物的基本要求PCR引物应满足一定的要求才能确保PCR反应的成功。
以下是PCR引物的基本要求：1.引物长度通常为18-25个碱基对，过长或过短的引物均会影响PCR效率和特异性。
2.引物的GC含量通常在40%-60%之间，过高或过低的GC含量会影响引物的稳定性。
3.引物的3’末端应尽量避免G或C碱基，以减少引物之间的互补性。
4.引物之间的Tm（退半温度）差异最好在2℃以内，以确保引物能够同时结合在目标DNA序列上。
5.引物之间不应有明显的互补性，以免引起非特异扩增。
6.引物与非目标DNA序列的互补性应尽量避免，以确保特异性扩增。
PCR引物设计方法以下是一种常用的PCR引物设计方法：1.根据目标DNA序列，选择PCR引物的起始位置。
一般选择在目标序列两侧约200-300个碱基对的位置。
确保引物区域内无重复序列，避免非特异扩增。
例：目标DNA序列为ACGTAGCTAGCTAGC欲设计的引物起始位置为第5个碱基对，选取引物区域为AGCTAGCTAGC2.对引物区域进行BLAST查询，确保引物区域在目标DNA序列中没有互补序列。
例：通过BLAST查询，确认引物区域无互补序列3.根据引物区域设计引物的前向引物和反向引物。
引物长度通常为18-25个碱基对，GC含量应在40%-60%之间，3’末端避免使用G或C碱基。
例：前向引物为AGCTAGCTAGCGACGCGC反向引物为GCGCGTCGCTAGCTAGCT4.使用引物设计软件或在线工具（如NCBI Primer-BLAST）进行引物性能评估。
输入引物序列，并检查引物间的Tm差异是否在2℃以内，检查引物之间以及与非目标序列的互补性。
pcr引物设计原理
pcr引物设计原理
PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于复制和扩增特定的DNA序列。
PCR引物是在PCR反应中使
用的两个短的单链DNA分子，它们与目标DNA序列的两端
相互互补。
引物的设计是PCR的关键步骤之一。
引物设计的原理考虑了目标DNA序列的多个因素，包括长度、GC含量、互补性和特异性等。
以下是PCR引物设计的一般原理：
1. 引物长度：引物通常由18-30个碱基对组成，这个长度范围
有助于在PCR反应中实现高效的扩增。
过短的引物可能无法
准确地与目标DNA序列的特定区域结合，而过长的引物可能
导致PCR反应较低的产物产量。
2. GC含量：为了确保引物的稳定性和特异性结合，引物的
GC含量应在40-60%之间。
这是因为GC碱基对比AT碱基对
具有更高的结合能力，能够增加引物与目标DNA序列的互补性。
3. 互补性：PCR引物的两个引物应该互补，并形成稳定的引
物-模板DNA复合物。
引物之间的相互互补性可以通过计算引物序列之间的互补碱基数来评估，以确保引物之间没有太多的自身互补性或与其他引物的互补性。
4. 特异性：引物设计还需要确保引物与目标DNA序列具有高
度特异性的互补性。
这意味着引物与目标DNA序列的其他非
目标区域不应该有太多的互补性，以避免非特异性扩增。
引物设计可以使用基因组和引物设计软件来辅助完成。
这些软件基于目标DNA序列的输入，在计算上述因素的基础上，为PCR反应提供最佳的引物设计。
一旦引物设计完毕，它们可以被合成和纯化，并用于PCR扩增特定的DNA序列。
PCR技术的反应体系和程序包括哪些环节
PCR技术的反应体系和程序包括哪些环节PCR（聚合酶链反应）是一种在基因组学、分子生物学和医学诊断中广泛应用的技术。
它能够通过扩增DNA片段，从而在短时间内产生大量目标DNA。
PCR技术的反应体系和程序包括以下几个关键环节：1. PCR反应体系的成分PCR反应体系通常包括引物（primers）、DNA模板、聚合酶、缓冲液、四个脱氧核苷酸（dNTPs）和镁离子（Mg2+）。
引物引物是PCR反应中的两个短DNA片段，它们与目标DNA序列的两端互补。
引物的设计非常重要，因为它决定了PCR扩增的特异性和产物大小。
引物的选择要考虑目标DNA序列的保守性和长度。
DNA模板DNA模板是要扩增的目标DNA序列。
它可以是从基因组DNA中提取的DNA，也可以是经过酶切或PCR前处理的片段。
聚合酶聚合酶是PCR反应的关键酶类。
最常用的聚合酶是Taq聚合酶，它能够耐受高温，适用于PCR反应中的高温变性（denaturation）和延伸（extension）步骤。
缓冲液缓冲液提供适宜的酸碱度和离子强度，维持PCR反应体系的稳定性。
常用的PCR缓冲液包含甘氨酸（Glycine）、Tris和硼酸（Boric acid）等成分。
四个dNTPs和镁离子四个脱氧核苷酸（dNTPs）提供PCR反应中DNA链的碱基单元。
镁离子（Mg2+）是聚合酶工作所需的辅酶，它在PCR反应中起到碱基配对和DNA链延伸的催化作用。
2. PCR反应程序的步骤PCR反应程序通常包括以下三个步骤：变性（denaturation）、退火（annealing）和延伸（extension）。
变性（denaturation）变性步骤将双链DNA样本加热至高温，导致DNA双链分离为两条单链。
通常，这一步骤在94-98摄氏度下进行，以确保目标DNA完全解旋。
退火（annealing）退火步骤是为了将引物与目标DNA序列的互补部分结合。
在此步骤中，反应温度降低至通常为50-65摄氏度，以使引物与目标序列发生特异性的碱基配对。
PCR中如何设计引物
PCR中如何设计引物引言PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它能够在体外扩增DNA片段。
设计合适的引物是PCR反应成功的关键。
本文将介绍PCR中如何设计引物的一般原则和方法。
引物设计的原则引物设计应遵循以下原则：1.引物长度：引物长度通常在18到30个碱基对之间，较短的引物可能导致非特异性扩增，而较长的引物则可能增加非特异性结合的风险。
2.Tm值：引物的熔解温度（Tm值）应该相似，通常要在50°C到65°C之间。
这样能够确保引物在PCR反应的温度范围内稳定结合到DNA模板上。
3.特异性：引物应与目标DNA序列保持高度特异性的碱基互补配对，以避免非特异性扩增。
可以使用序列比对软件来确保引物的特异性。
4.无自身互补和剩余互补：引物自身及与它们自身或其他引物的互补序列不应该存在，避免引物形成二聚体或非特异性扩增的可能性。
5.区段选择：引物的选择应基于目标DNA序列上的特定区段，通常位于基因的保守区域或功能位点上。
引物设计的步骤以下是PCR引物设计的一般步骤：步骤一：目标序列分析对于需要扩增的目标DNA序列，首先进行详细的分析。
包括确定目标DNA序列的起始和终止位置，以及预测目标DNA序列的理论大小。
步骤二：引物设计软件的选择选择一种引物设计软件，常见的有Primer3、Primer-BLAST等。
这些软件可以根据一些参数，如Tm值、引物长度等，自动生成一组可能的引物序列。
步骤三：引物选择与比对使用引物设计软件生成的引物序列，根据上述引物设计的原则，选择一组最佳的引物。
然后，使用引物设计软件进行序列比对，确保引物的特异性。
步骤四：引物合成购买选定的引物序列，并选择可靠的引物合成商进行合成。
结论合理设计的引物对PCR反应的成功非常重要。
在PCR中设计引物时，需要考虑引物长度、Tm值、特异性、互补性等原则，并通过引物设计软件进行分析和比对，最终选择最佳的引物序列。
这样可以确保PCR反应的特异性和可靠性。
PCR技术
PCR技术PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于复制和扩增DNA片段。
PCR技术已广泛应用于基因分型、疾病诊断、基因工程等领域。
其中，引物设计是PCR技术的关键一步，决定了PCR扩增的特异性和效率。
引物是PCR反应中的两段短DNA序列，它们与待扩增的DNA片段的两端相互互补。
PCR反应中的引物设计需要考虑以下几个因素：1.引物长度：引物一般为15-30个碱基对长，过短会导致非特异性扩增，过长则会影响反应的效率。
2.引物的GC含量：引物的GC含量应该在40%-60%之间，过高或过低的GC含量会影响PCR反应的特异性和效率。
3. 引物的熔解温度（Tm）：引物的Tm是指引物与待扩增DNA片段结合时的温度，通常设计时要求引物的Tm相近，一般在55-65摄氏度之间。
引物的熔解温度可以通过计算公式进行估算，如Wallace等提出的公式：Tm = 4(G+C) + 2(A+T)。
4.引物序列的特异性：引物的序列应该特异性地与待扩增的DNA片段相互配对，避免与其他非目标DNA片段发生非特异性扩增。
在引物设计中，可以使用生物信息学工具进行引物的特异性分析，如比对引物序列与基因组数据库，检查是否存在交叉重复序列。
5.引物之间的相互作用：在PCR反应中，引物之间的相互作用可能导致非特异性扩增或二聚体的形成。
因此，在引物设计中，要避免引物之间的互补或相似性，尤其是在引物的3'末端。
在实际引物设计中，可以使用计算机辅助设计工具来进行引物序列的设计和分析，如Primer3、OligoAnalyzer等。
这些工具根据上述引物设计的原则，通过计算引物的物理化学性质和与待扩增DNA片段的匹配情况，辅助用户选择合适的引物序列。
需要注意的是，引物设计是PCR技术成功的前提，但并不是唯一影响PCR扩增效果的因素。
在实验中，还需进行反应条件的优化，如PCR反应体系的设计、反应温度和时间的调节等，以确保PCR反应能够高效、特异地扩增目标DNA片段。
PCR、引物设计及逆转录PCR解析
模板：1 μL 上游引物：0.2 μL 下游引物：0.2 μL Easy Taq 酶：0.1 μL Easy Taq Buffer：1 μL dNTP：0.8 μL ddH2O：6.7 μL
94℃ 94℃ 56.2℃ 72℃ 72℃ 4℃
5min 30s 30s 30s 7min ∞
30个循环
PCR的R仪
实时荧光定量PCR仪
引物设计的目的
为了找到一对合适的核苷酸片段， 使其能有效地扩增模板DNA序列。
引物是PCR特异性反应的关键，同 时也与PCR扩增的效率密切相关。 引物设计的最重要的原则：最大限度 地提高扩增效率和特异性；同时尽可 能减少非特异性扩增。
引物设计的基本原则
• PCR（Polymerase Chain Reaction) 技术即聚合酶链式反应，又称DNA体外 扩增技术。
• 1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis 等人发明，荣获1993年度诺贝尔化学 奖。
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外DNA分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
PCR扩增体系
➢模板（Template）：基因组、质粒DNA、
cDNA，也可以使细菌、组织样品等。
➢引物（Primer）：确定扩增目的序列的
特异性；确定扩增产物长度。
➢DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动
PCR反应进行的机器。扩增效率和保真性。
➢缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离
因此仅mRNA可被逆转录。
逆转录引物：
（3）特异性引物 能与目标RNA碱基序列互补的寡
核苷酸引物，仅产生待分析基因的 cDNA。
3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以 引物为起始点的DNA链延伸反应（ 72℃， 30 ～ 60s ）。
pcr技术的原理和步骤
pcr技术的原理和步骤PCR技术的原理和步骤PCR技术是一种基于DNA复制的技术，可以在短时间内扩增DNA 序列，从而使得微量的DNA样本也能够被检测到。
PCR技术的原理和步骤如下：一、PCR技术的原理PCR技术的原理是利用DNA聚合酶（DNA polymerase）在一定条件下，对DNA进行连续的复制，从而扩增DNA序列。
PCR技术的核心是DNA的复制，而DNA的复制需要三个基本元素：DNA模板、DNA聚合酶和引物（primers）。
DNA模板是PCR反应中的原始DNA序列，DNA聚合酶是一种酶类，能够在一定条件下将DNA模板复制成新的DNA序列，引物是一种短的DNA序列，能够在DNA模板上定位并启动DNA聚合酶的复制作用。
PCR技术的步骤二、PCR技术的步骤PCR技术的步骤主要包括：DNA模板的制备、引物的设计、PCR 反应体系的构建、PCR反应的条件和PCR产物的检测等。
1. DNA模板的制备DNA模板的制备是PCR反应的第一步，DNA模板可以来源于各种生物样本，如血液、组织、唾液等。
DNA模板的制备需要先将生物样本进行裂解，使得DNA能够被释放出来，然后通过离心等方法将DNA分离出来。
2. 引物的设计引物是PCR反应中的关键因素之一，引物的设计需要根据所需扩增的DNA序列进行设计。
引物的长度一般在20-30个碱基对之间，引物的GC含量应该在40%-60%之间，引物的两端应该含有一定的碱基序列，以便于引物与DNA模板的结合。
3. PCR反应体系的构建PCR反应体系的构建需要将DNA模板、引物、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs等反应物混合在一起，构建出PCR反应的体系。
PCR 反应体系的构建需要注意反应物的浓度、pH值、离子强度等因素，以保证PCR反应的稳定性和可靠性。
4. PCR反应的条件PCR反应的条件包括PCR反应的温度、时间和循环次数等。
PCR 反应的温度一般分为三个阶段：变性、退火和延伸。
pcr技术的原理和步骤
pcr技术的原理和步骤一、前言PCR技术（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种在分子生物学领域中广泛应用的技术，它可以在短时间内扩增DNA片段，从而使其数量呈指数级增长。
PCR技术的原理和步骤对于分子生物学研究者来说非常重要。
二、PCR技术的原理PCR技术的原理是利用DNA聚合酶，在高温条件下将DNA模板复制成多个同样的DNA片段。
PCR反应需要三个主要组分：模板DNA、引物和聚合酶。
1. 引物引物是一小段单链DNA序列，它与待扩增的目标序列互补配对，可以作为起始点启动扩增反应。
通常需要设计两个引物，一个称为前向引物（Forward primer），另一个称为反向引物（Reverse primer）。
它们分别位于待扩增序列的两端，并且是互补配对的。
当这两个引物结合到待扩增序列上时，就形成了一个完整的PCR模板。
2. 聚合酶聚合酶是一种特殊类型的酶，在高温条件下能够读取DNA模板并将新核苷酸加入正在生长中的新链中。
聚合酶的最常用类型是Taq聚合酶，它来源于一种热喜好性细菌，可以在高温下保持稳定。
3. PCR反应步骤PCR反应分为三个步骤：变性、退火和延伸。
（1）变性PCR反应开始时，将PCR管中的混合物加热到95℃，使DNA双链分离成两条单链。
这个过程称为变性。
此时，模板DNA和引物都变成了单链状态。
（2）退火然后将温度降低到50-60℃，引物与模板DNA序列互补配对并结合在一起。
这个过程称为退火。
（3）延伸最后将温度升高到72℃，Taq聚合酶开始读取模板DNA，并在每个引物的末端加入新核苷酸以扩增新链。
这个过程称为延伸。
每次循环后，扩增产物数量都会呈指数级增长。
三、PCR技术的步骤PCR技术的步骤主要包括以下几个方面：1. 样品制备首先需要从样品中提取出目标DNA片段，并纯化获得高质量的DNA样品。
通常使用化学方法或机械方法进行DNA提取和纯化。
2. 引物设计根据待扩增的目标序列，设计出一对互补配对的引物。
融合pcr程序
融合pcr程序PCR（聚合酶链式反应）是一种用于放大特定 DNA 片段的分子生物学技术。
以下是一个简单的 PCR 程序示例，包含了基本的步骤：1. 设计引物：根据目标 DNA 序列，设计一对引物。
引物是短的 DNA 片段，与目标序列的两端互补。
2. 准备反应混合物：将以下成分加入到微量离心管中：- 模板 DNA：待扩增的 DNA 样本。
- 引物：适量的正向和反向引物。
- dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸）：包含四种核苷酸（A、T、C、G）的混合物。
- DNA 聚合酶：用于催化 DNA 合成的酶。
- 缓冲液：提供适宜的反应条件。
3. 设置 PCR 仪：根据所使用的 PCR 仪型号，设置适当的反应条件，如温度、时间和循环次数。
通常包括以下步骤：- 变性：将反应混合物加热至 95°C 左右，使模板 DNA 变性为单链。
- 退火：将温度降低至适宜的退火温度，使引物与模板 DNA 结合。
- 延伸：将温度升高至 72°C 左右，使 DNA 聚合酶开始合成新的 DNA 链。
4. 执行 PCR 反应：将离心管放入 PCR 仪中，开始循环反应。
PCR 仪会自动按照设定的条件进行变性、退火和延伸步骤，经过多个循环后，目标 DNA 片段会大量扩增。
5. 分析结果：PCR 反应结束后，可以通过凝胶电泳或其他适当的方法分析扩增产物。
凝胶电泳可将扩增的 DNA 片段分离并可视化，根据条带的大小和数量确定是否成功扩增了目标 DNA。
需要注意的是，PCR 程序的具体细节可能因实验目的、所使用的设备和试剂而有所不同。
在进行 PCR 实验之前，建议仔细阅读相关的实验手册和操作指南，并根据实际情况进行适当的调整。
如果你有特定的实验需求或问题，最好咨询专业的实验室技术人员或相关领域的专家。
pcr技术的能量来源
pcr技术的能量来源PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种在生物科学研究和医学诊断中广泛应用的分子生物学技术。
PCR技术利用DNA聚合酶酶作用以及酶的热稳定性，在体外通过一系列温度变化的反应步骤，迅速、高效地扩增DNA片段。
在PCR反应中，能量的来源主要包括引物、DNA聚合酶和核苷酸三个方面。
首先，PCR反应需要引物。
引物是设计用来选择性地与待扩增片段的DNA序列互补配对的短链寡核苷酸。
PCR反应中通常需要两个引物，一个称为前向引物，与待扩增片段的一条链的5'末端互补；另一个称为反向引物，与另一条链的5'末端互补。
引物的设计和合成需要耗费一定的能量，因此在PCR反应的能量来源中起到重要的作用。
其次，PCR反应还需要DNA聚合酶。
通常使用的DNA聚合酶是从具有高热稳定性的细菌（例如热泛菌属）中分离得到的。
这些特殊的DNA聚合酶能够在高温下保持活性，从而在PCR反应过程中起到关键的扩增作用。
DNA聚合酶的工作需要耗费一定的能量，并在PCR反应中提供能量支持。
此外，PCR反应中还需要核苷酸。
核苷酸是构建DNA分子的基本单位，包括脱氧腺嘌呤核苷酸（dATP）、脱氧胞嘧啶核苷酸（dCTP）、脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGTP）和脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTTP）。
在PCR 反应中，这些核苷酸通过与模板DNA的互补配对，由DNA聚合酶催化连接成新的DNA链。
核苷酸的供应需要消耗一定的能量。
总结起来，PCR技术的能量来源主要包括引物、DNA聚合酶和核苷酸三个方面。
引物的设计和合成、DNA聚合酶的活性维持以及核苷酸的供应和连接都需要耗费能量。
这些能量的提供使得PCR技术能够在体外高效、迅速地扩增DNA片段，为生物学研究和医学诊断的发展提供了重要的工具和手段。
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聚合酶链式反应（PCR）原理：DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板 - 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR技术分类（常用）（1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。
该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。
用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。
（2）锚定PCR技术(Anchored PCR, APCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。
（3）不对称PCR技术(asymmetric PCR)：两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。
在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。
在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。
（4）反转录PCR技术(reverse transcription PCR, RT-PCR)：当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。
应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。
（5）巢式PCR技术(NEST-PCR)：先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR 带, 此为巢式PCR。
若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。
为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。
这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。
这种PCR称中途进退式PCR，主要用于极少量DNA模板的扩增。
（6）多重PCR技术(multiplex PCR)：在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。
主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。
（7）重组PCR技术：重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中, 两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。
（8）原位PCR技术：利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。
直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。
（9）荧光定量实时PCR技术反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升，最终DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算，Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n表示循环次数。
平均扩增效率理论值为100%，但实际情况达不到，反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，此效应称平台期，与DNA聚合酶数量和活性、PCR扩增效率、非特异性产物的竞争等因素有关。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分，短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。
短、长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。
进入第二个反应周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（长产物片段）结合引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，故这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点、止点都限定于引物扩增的序列以内，形成长短一致的短产物片段。
由于短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，故可忽略不计，使得PCR的反应产物不需再纯化既可以保证足够纯的DNA片段供分析、监测。
反应五要素---引物、模板、DNA聚合酶、四种dNTP、Mg2+（1）引物设计①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。
【引物的GC含量和Tm值应该协调：Tm=4（G+C）+2（A+T）】④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般3‘端也不能发生错配，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败。
5’端无严格限制，只起限定PCR产物长度的作用，对扩增特异性影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
⑧引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
（2）DNA聚合酶：目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量0.5-2.5 U/50 ml，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
（3）dNTP的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP 降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
（4）模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L 时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
RT-PCR -- 是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
总RNA提取（-70℃保存）Trizol法：1、取组织100㎎于玻璃匀浆器中，加入1ml Trizol 冰上抽打匀浆（边匀浆边暂停）2、移入1.5mlEP管中，颠倒混匀，室温保存5min3、加氯仿0.2ml（总体积的1/5），振荡混合，室温放置5min4、4℃，离心12000 rpm，15min5、取上层液相（约400μl）移入一新1.5ml EP管中，加等体积异丙醇（约400μl）,振荡混合，室温保存10min6、4℃，离心12000 rpm，10min7、弃上清液，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合8、4℃，离心7500 rpm，5min9、弃上清液，室温放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）10、加20ul DEPC水至EP管中，在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解（可保存在液氮或低温冰箱-70℃）测RNA浓度：走RNA变性电泳观察18s、28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值调零：750ul DEPC水测量：745ul DEPC水 + 5ul RNA总RNA浓度= OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml= OD260×40×150 ug/ml= OD260×6 ug/ulA1/A2应在1.8-2.0之间注意：提取RNA的质量主要是要通过260/280的比值看是不是在2.0左右，当OD260/OD280<1.8时提示有蛋白或酚的污染，需要进一步纯化RNA；还要跑胶看看28s、18s、5s的三条带是不是清晰，一般质量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1左右，最后一条5s的应该比较淡。