生物倒置光学显微镜实验

实验十八生物倒置光学显微镜实验【引言】光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器，已有300多年的发展史。

1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。

1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。

17世纪中叶，英国的胡克和荷兰的列文胡克，都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。

1665年前后，胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。

这些部件经过不断改进，成为现代显微镜的基本组成部分。

1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜，其中九台保存至今。

胡克和列文胡克利用自制的显微镜，在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出的成就。

19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。

1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜。

19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。

这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为19世纪后半叶包括科赫、巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。

在显微镜本身结构发展的同时，显微观察技术也在不断创新：1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝尔物理学奖。

古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接收器来观察放大的像。

后来在显微镜中加入了摄影装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。

现代又普遍采用光电元件、电视摄象管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图象信息采集和处理系统。

【实验目的】①学习和了解普通光学显微镜的原理和结构；②学习掌握光学显微镜的操作，观察标尺和溶液中μm量级的聚苯乙烯小球，并利用软件采集图像作处理。

③利用磁镊系统观察记录并分析DNA长度与磁力大小的关系，【实验仪器】光学倒置显微镜，载玻片，标尺，修饰有DNA分子的样品槽，三维手动微操纵仪，磁铁【实验原理】1．显微镜的成像原理显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。

只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。

物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。

所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像A'B'。

A'B'再经目镜放大为虚像A''B''后供眼睛观察。

目镜的作用与放大镜一样。

所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。

图1. 显微镜成像原理。

2．显微镜的几个基本概念2.1分辨率(分辨距离)：显微镜能分辨的最小距离，用D 表示。

D=0.61/ n sin λα ;D ：分辨率 λ:光波的波长 n:介质折射率 α:物镜镜口角的一半在明视距离（25cm ）之处，正常人眼所能看清相距0.073mm 的两个物点，这个0.073mm 的数值，即为正常人眼的分辨距离。

显微镜的分辨率越小，即表示它的分辨力越高，也就是表示它的性能越好。

显微镜的分辨力的大小由物镜的分辨力来决定的，而物镜的分辨力又是由它的数值孔径和照明光线的波长决定的。

2.2孔径角：由标本上一点发出的进入物镜最边缘光线L 和进入物镜中心光线OA 之间的夹角α;称为孔径角。

2.3数值孔径：令NA = n sin α⋅, 叫物镜的数值孔径。

数值孔径与显微镜的分辨率有密切关系， NA 越大，分辨率越高。

介质折射率n 代表了该媒质的光密度，如玻璃和空气（即光的传播速度）。

一般情况下，在物镜和样品之间为空气，其折射率约为1。

在样品和物镜之间以油替代空气的一类特别的透镜称为油镜，油镜所用的浸油折射率约为1.5, 因此使用油镜可以提高分辨率。

最大的数值孔径一般是1.2—1.4。

2.4放大率在显微镜下所看到的物像和实际物体之间的大小比例叫显微镜的放大率或放大倍数。

显微镜下物像的放大主要由物镜、镜筒长度、目镜所决定。

适合的放大倍数决定于物镜的数值孔径，一船应为数值孔径的500――1000倍。

2.5焦点深度一般物镜成象时并不仅仅只成一个平面，而是上下一定范围内都能看清楚，超出这段距离的物体就模糊不清。

这段距离位于显微镜焦点的上下很小的范围之内。

这段距离的上下限叫焦点深度。

焦深随物镜倍率增加而减小，越是高倍的物镜焦深越短。

对于显微摄影，如果需要焦深较大的效果，则可以选择同倍率下NA较小的物镜或使用带光阑的物镜，减小NA值。

2.6视野目镜中观察到的物像的一定范围叫视野。

显微镜的总放大率小的时候所能看到的标本的范围大，而总放大率愈大所能看到的标本的局部愈小。

所以说视野与显微镜的总放大率成反比。

在同一总放大率的条件下视野也可有大小差别。

这种差别决定于目镜的某些性能。

首先目镜的视场光栏的直径是最主要的条件。

视场光栏的直径叫目镜的视场数值．2.7工作距离工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。

在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。

数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。

【实验装置】光学显微镜结构普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。

1．机械部分（1）镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。

（2）镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。

（3）镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。

（4）镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。

（5）物镜转换器(旋转器)：接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有3－4个圆孔，是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。

（6）镜台(载物台)：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器(推片器)，推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标本作左右、前后方向的移动。

（7）调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。

①粗调节器(粗螺旋)：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快速和较大幅度的升降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物象。

②细调节器(细螺旋)：小螺旋称细调节器，移动时可使镜台缓慢地升降，多在运用高倍镜时使用，从而得到更清晰的物象，并借以观察标本的不同层次和不同深度的结构。

2．照明部分装在镜台下方，包括反光镜,集光器。

（1）反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。

（2）集光器(聚光器)位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。

①聚光镜：由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。

②光圈(虹彩光圈)：在聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，其外侧伸出一柄，推动它可调节其开孔的大小，以调节光量。

3．光学部分（1）目镜：装在镜筒的上端，通常备有2－3个，上面刻有5×、10×或15×符号以表示其放大倍数，一般装的是10×的目镜。

（2）物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3－4个物镜，其中最短的刻有“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有“100×”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。

显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为10×，目镜为10×，其放大倍数就为10×10=100。

磁镊装置整个装置建立在一倒置显微镜（Nikon-TE2000U）上。

样品池由两片载玻片夹住一片侧面抛光的盖玻片并用玻璃胶密封构成。

上面载玻片上面钻有两个1 mm 大小的小孔，玻璃管从小孔中接出并与硅胶管相连，一根硅胶管连接微注射泵，另一根接样品溶液。

通过调节微注射泵的流速和拉伸方式，可以使样品进入或流出样品池（图2A）。

一端带有磁球而另一端带有地高辛的DNA溶液引入后可通过地高辛和抗地高辛之间的特异结合，连接在铺好抗地高辛的抛光盖玻片侧壁上，形成如图2B所示结构。

样品池一侧有安装在手动微操纵仪的永磁铁，通过吸引磁球对DNA施加拉力。

可以通过改变永磁铁的位置来改变磁力大小。

样品池内显微镜成像通过外接CCD 每秒25帧成像实时传送到计算机主机上安装的图像采集卡并录像保存视频供分析（图2C ）。

磁球在焦平面x 方向的运动相当于一个阻尼摆运动。

热涨落倾向于让小球偏离平衡位置δx,导致了x 方向回复力θFsin F x =与之抗衡，这里θ为摆偏离平衡位置夹角，F 为垂直于x 方向的外力.由于θ较小，L /x sin δθθ=≈，于是有F x ≈F δx/<L>=k x δx,其中<L>为DNA 的末端距长度即磁球到侧壁的距离，k x =F/<L>，是该阻尼摆的有效劲度.这样摆的小角度的x 方向运动可以看作一维谐振子运动，其能量等于k x < δx 2>/2，而根据能量均分定理，小球在垂直磁场方向即x 方向自由度上的能量为K B T/2,这样K B T/2= k x < δx 2>/2= F< δx 2>/(2<L>),得到：2/B F K T L x δ=， （1）其中K B 为波尔兹曼常数，T 为热力学温度，< δx 2>为磁球布朗运动X 方向的均方差。

磁球的运动轨迹利用基于快速傅立叶变换的自相关算法程序分析采集的视频得到。

这样δx 和〈L 〉可以通过图像分析直接得到并通过上式求得外力大小。

图2. A）样品池设计；B）实验设计；C）实验装置图。

【实验步骤】1.显微镜使用实验时先把显微镜放在座前桌面上稍偏左的位置，镜座应距桌沿 6～7 cm 左右。

打开光源开关，调节光强到合适大小。

转动物镜转换器，使低倍镜头正对载物台上的通光孔。

在载物台上放上标尺，先用10倍物镜观察，使被观察的部分位于通光孔的正中央。

观察之前，先转动粗动调焦手轮，使载物台上升，物镜逐渐接近玻片。