生物倒置光学显微镜实验

实验十八生物倒置光学显微镜实验

【引言】

光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器，已有300多年的发展史。

1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。

17世纪中叶，英国的胡克和荷兰的列文胡克，都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。1665年前后，胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。这些部件经过不断改进，成为现代显微镜的基本组成部分。

1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜，其中九台保存至今。胡克和列文胡克利用自制的显微镜，在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出的成就。

19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜。19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为19世纪后半叶包括科赫、巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。

在显微镜本身结构发展的同时，显微观察技术也在不断创新：1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝尔物理学奖。

古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接收器来观察放大的像。后来在显微镜中加入了摄影装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。现代又普遍采用光电元件、电视摄象管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图象信息采集和处理系统。

【实验目的】

①学习和了解普通光学显微镜的原理和结构；

②学习掌握光学显微镜的操作，观察标尺和溶液中μm量级的聚苯乙烯小

球，并利用软件采集图像作处理。

③利用磁镊系统观察记录并分析DNA长度与磁力大小的关系，

【实验仪器】

光学倒置显微镜，载玻片，标尺，修饰有DNA分子的样品槽，三维手动微操纵仪，磁铁

【实验原理】

1．显微镜的成像原理

显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像A'B'。 A'B'再经目镜放大为虚像A''B''后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。

图1. 显微镜成像原理。

2．显微镜的几个基本概念

2.1分辨率(分辨距离)：显微镜能分辨的最小距离，用D 表示。

D=0.61/ n sin λα ;

D ：分辨率 λ:光波的波长 n:介质折射率 α:物镜镜口角的一半

在明视距离（25cm ）之处，正常人眼所能看清相距0.073mm 的两个物点，这个0.073mm 的数值，即为正常人眼的分辨距离。显微镜的分辨率越小，即表示它的分辨力越高，也就是表示它的性能越好。显微镜的分辨力的大小由物镜的分辨力来决定的，而物镜的分辨力又是由它的数值孔径和照明光线的波长决定的。

2.2孔径角：由标本上一点发出的进入物镜最边缘光线L 和进入物镜中心光线OA 之间的夹角α;称为孔径角。

2.3数值孔径：令NA = n sin α⋅, 叫物镜的数值孔径。数值孔径与显微镜的分辨率有密切关系， NA 越大，分辨率越高。介质折射率n 代表了该媒质的光密度，如玻璃和空气（即光的传播速度）。一般情况下，在物镜和样品之间为空气，其折射率约为1。在样品和物镜之间以油替代空气的一类特别的透镜称为油镜，油

镜所用的浸油折射率约为1.5, 因此使用油镜可以提高分辨率。最大的数值孔径一般是1.2—1.4。

2.4放大率

在显微镜下所看到的物像和实际物体之间的大小比例叫显微镜的放大率或放大倍数。显微镜下物像的放大主要由物镜、镜筒长度、目镜所决定。适合的放大倍数决定于物镜的数值孔径，一船应为数值孔径的500――1000倍。

2.5焦点深度

一般物镜成象时并不仅仅只成一个平面，而是上下一定范围内都能看清楚，超出这段距离的物体就模糊不清。这段距离位于显微镜焦点的上下很小的范围之内。这段距离的上下限叫焦点深度。焦深随物镜倍率增加而减小，越是高倍的物镜焦深越短。对于显微摄影，如果需要焦深较大的效果，则可以选择同倍率下NA较小的物镜或使用带光阑的物镜，减小NA值。

2.6视野

目镜中观察到的物像的一定范围叫视野。

显微镜的总放大率小的时候所能看到的标本的范围大，而总放大率愈大所能看到的标本的局部愈小。所以说视野与显微镜的总放大率成反比。

在同一总放大率的条件下视野也可有大小差别。这种差别决定于目镜的某

些性能。首先目镜的视场光栏的直径是最主要的条件。视场光栏的直径叫目镜的视场数值．

2.7工作距离

工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。

在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。

数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。

【实验装置】

光学显微镜结构

普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。1．机械部分

（1）镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。

（2）镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。

（3）镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。

（4）镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。（5）物镜转换器(旋转器)：接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有3－4个圆孔，是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。

（6）镜台(载物台)：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器(推片器)，推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标本作左右、前后方向的移动。

（7）调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。

①粗调节器(粗螺旋)：大螺旋称粗调节器，移动时可使镜台作快速和较大幅度的升降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物象。

②细调节器(细螺旋)：小螺旋称细调节器，移动时可使镜台缓慢地升降，多在运用高倍镜时使用，从而得到更清晰的物象，并借以观察标本的不同层次和不同深度的结构。

2．照明部分