公共场所嗜肺军团菌污染状况调查分析

公共场所嗜肺军团菌污染状况调查分析

［摘要］目的应用PCR技术对奉贤地区部分公共场所空调冷却塔水及其他环境（淋浴设施等）进行军团菌污染状况调查。方法于2010年5月和10月，分别采集中央空调冷却塔水样品及环境样品用聚合酶链（PCR）对其进行嗜肺军团菌检测，同时用常规法进行分型鉴定。结果采集的125份样品中，PCR法检出嗜肺军团菌45份，阳性检出率为36%，水样检出率远高于环境（分别为67.19%和3.28%）。在检出的59株军团菌中共鉴定出6种不同菌型，其中LP1为重点菌型，占50.85%。且在同一样品中检出不同菌型有2株以上的占35.29%。结论奉贤地区中央空调冷却塔及环境中存在军团菌污染，需引起重视，以防止军团菌所致的疾病暴发或流行。

军团菌是一种革兰阴性杆菌，能引起急性呼吸道传染病[1]，军团菌已被发现存在40个种，60多个血清型。经流行病学调查研究，这种细菌存在于各种自然界水源以及空调水管道，供水系统等人工水源中，在引进空调冷却塔做冷却水时，随空调器把细菌散布于室内空气中，被人吸入而引发肺炎。

我国自1982年南京首次证实军团菌病例以来已有多起军团菌爆发流行［2］，上海在近几年内也从患者和环境中分离到军团菌［3］。而上海地区健康人血清抗体水平调查也证明军团菌早已存在，并对人群构成潜在威胁［4］。近年来从军团菌的流行可以看出军团菌对人类健康的威胁已达到不容忽视的程度，因此对该病的研究也越来越受到人们的重视。

目前用于军团菌检测的常规培养约7～10d，不仅花费大量时间和精力，还具有敏感性、特异性差的缺点，且操作复杂，易造成漏检和误检。分子生物学技术的发展为军团菌检测提供了新的契机，该课题应用聚合酶链（PCR）技术，检测环境中的军团菌，以分析奉贤地区军团菌的污染状况。

1．材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株大肠埃希菌（A TCC25922）、肠炎沙门菌（ATCC13076）均购于美国典型微生物菌种中心保藏中心提供标准菌株。米克达德军团菌、杜莫夫军团菌由市疾控中心提供。

1.1.2 样品来源2010年分别在5月和10月以单纯随机抽样方式选取奉贤地区具有集中式中央空调设备的各大型超市，酒店共10家。以无菌方式采集空调冷却塔水于无菌广口瓶中，每件约200 ml（根据《公共场所集中空调通风系统卫生规范》），共采集64件。以沾湿生理盐水的棉签反复涂抹空调出风口以及酒店浴室莲蓬头出水口表面，剪去棉签接触手部位，将棉签置5 ml生理盐水中，共采集61件，采样后即送实验室检验。

1.1.3 培养基GVPC平板由柯玛嘉公司提供，血琼脂平板，各反应试剂由上海市疾病预防控制中心提供，均在有效期内使用。

1.1.4 诊断血清军团菌诊断血清由上海市疾病预防控制中心提供,均在有效期内使用。1.1.5 PCR扩增仪Techne Flexigene；全自动数码凝胶成像系统Tanon GIS-2010。

1.1.6 PCR试剂盒嗜肺军团菌（LP）PCR检测试剂由上海健益生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分离培养鉴定样品经负压过滤后,剪碎放入蒸馏水中,混合振荡后吸取1毫升进行酸处理,静置5分钟后同时接种GVPC平板和血平板.36℃，5%CO2培养72 h后进行鉴定[5]。

1.2.2 PCR检测方法样品经负压过滤后,剪碎放入5 ml蒸馏水中，混合后取500 µl,12 000 rpm/min离心5 min,弃上清液，加100 µl DNA提取液入沉淀中，振荡混匀，置100℃水浴加热10 min,12 000 rpm/min离心5 min，保留上清液待用。取4 µl上清液加入26 µl PCR反应液中,同时做阳性对照。振荡混匀，将PCR反应管放入PCR扩增仪中。首先预变性94℃5 m

in，然后按94℃30 s、55℃30 s、72℃60 s循环35次，最后72℃延长5 min。取15 µl的扩增产物加入2%琼脂糖凝胶孔中进行电泳，然后用凝胶成像系统进行分析。

1.2.3 PCR特异性试验以嗜肺军团菌DNA作为阳性对照，以其他菌株DNA作为干扰菌进行PCR特异性检测。

1.2.4 测序验证将PCR结果阳性的样品扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序验证。

2 结果

2.1 PCR检测结果

2.1.1 PCR反应和测序验证一共采集125份样品进行嗜肺军团菌的检测，有45份样品检出阳性。经上海生工生物工程有限公司测序验证,送检的阳性样品扩增产物确认为嗜肺军团菌,见图1。

2.1.2 PCR特异性引物只与嗜肺军团菌发生阳性扩增，扩增长度为430bp，其他菌没有扩增产物，具有很好特异性，结果见图2。

M:100bpDNA标准带；1: 嗜肺军团菌;2:阴性对照; 3: 肠炎沙门菌; 4: 米克达德军团菌; 5:大肠埃希菌; 6: 杜莫夫军团菌

图2 嗜肺军团菌特异性检测情况

2.1.3 样品检测情况用PCR检测的125份样品中，水样64份，环境样品61份，水样的阳性检出率远远高于环境中的阳性检出率。经统计学分析，水样与环境样品检出率的比较差异有统计学意义（X2 =55.37，P<0.05）。

3 讨论

运用PCR技术对奉贤地区大型中央空调和部分环境的军团菌污染调查中发现，中央空调冷却塔水中的阳性率达67.19%，远高于环境中的阳性率3.28%，证明上海奉贤区空调冷却水军团菌污染相当严重。冷却塔作为中央空调系统的一部分，其产生的循环水不仅为军团菌提供了理想的生存环境［6 ］，而且提供了传播的形式—气溶胶。冷却塔水被污染后，通过空调机入口和通风管被抽入室内或在冷却塔一定范围形成气溶胶，人引吸入而被感染。空调系统冷却塔污染是导致军团菌感染的主要原因之一［7 ］，由于军团菌是一类水生菌群，生存环境界限广泛，水中存活时间较长，因此水质的跟踪检测及水的消毒十分重要。

在此次的调查中，检出了6种不同菌型，而其中又以LP1为重点菌型，占检出菌的50.85%。这与之前国内报道的军团菌分布情况一致［8］。而且在同一样品中检出了不同菌型，2株以上的占35.29,%，证明奉贤地区空调冷却塔水中存在着严重的多重污染，由军团菌污染环境可能导致严重后果应该引起足够的重视。

在军团菌的研究中从环境中检出的菌株以空调系统冷却塔水较多，而此次在酒店的浴室花洒中检出了2株军团菌，这属少见，也充分说明军团菌就存在日常生活中。提醒市民对自己家里的淋浴器等设备也要进行定期检测、消毒、清除水、污物。军团菌病爆发流行的可能性正日益临近，居民小区的集中供水，加湿器，热水器，空调器的日益普及无时不刻提醒卫生管理部门急需重视这个文明病。

由于军团菌的培养分离方法繁琐，人工培养条件的苛刻及其生长代谢的缓慢导致标本检出率低下，从而造成事实上的假阴性，漏检。检测技术相对滞后，对于军团菌的预防与治疗十分不利。PCR方法检测军团菌完全是从细菌的基因水平入手，针对5SrRNA设计的属特异性引物，从而比以往所有传统的外显蛋白质表型检测更为可靠。而运用聚合酶链反应技术（PCR）的高敏感性，强特异性和快速等特点，可以克服常规检验技术的缺陷,显著简化了操作，有利于军团病防治工作的开展。而此次运用两种方法对嗜肺军团菌进行检测，检出率