TILLING技术及其基因突变克隆

论文题目 TILLING技术及其突变基因克隆

作者管家伟

学号 12223104

指导教师王沛政

专业班级非师范2班

完成日期：2015 年 6 月18 日

TILLING技术及其基因突变克隆

摘要：TILLING[1]（定向诱导基因组局部突变）技术是近年发展起来的一种高通量筛选化学诱变技术。是一种全新的反向遗传学研究方法,它提供了一种高通量、低成本规模化高效筛选化学诱变剂EMS诱发产生点突变的技术。本文简要介绍了TILLING的原理和技术优势,并对其在植物功能基因组学[2]、突变分子育[3]种和预测突变频率中的应用作了初步探讨。

关键词: TILLING；点突变；植物功能基因组学；突变分子育种；克隆

1 TILLING技术介绍

1.1 TILLING技术基本原理

通过化学诱变产生一系列的点突变，经PCR 扩增放大，经过变性复性过程产生异源双链DNA 分子，再利用能够特异性识别异源双链中错配碱基的核酸酶，从错配处切开DNA，然后进行双色电泳分析筛选突变体。该技术将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR 筛选技术和高通量检测方法有效结合，可以发现分析目标区域点突变，是一种全新的高通量、低成本的反向遗传学研究方法。

1.2 TILLING技术的发展

TILLING技术开始是利用变性高效液相色谱(DHPLC)来检测DNA池中的突变的[4,13],但这种检测手段不能用于大规模的突变体筛选,TILLING技术的应用也仅少数物种突变体库的筛选和突变体检测。随着应用领域的不断拓宽,TILLING技术也逐步得到了发展和完善。

1.2.1 双色红外荧光扫描对TILLING技术的作用

双色红外荧光扫描系统的引入提高了突变筛选效率双色红外荧光扫描系统的出现大大提高了突变筛选效率。该系统是利用一对不同荧光进行标记的引物来扩增几个样品混合后的DNA模板,PCR产物经变性后再逐渐复性,如果在混合的DNA样品中存在一个突变样品,那么扩增产物中就会形成异源双链分子,这些异源双链分子即可被核酸内切酶剪切,酶切产物利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。因为被切开的片段两端采用的是不同的荧光染料标记,那么在图像上下方都会出现一个条带,就可以通过估计载有3′和5′端标记的这两个条带的大小推测突变发生的位置。如果在一个混合样品中检测到了突变,再逐一对该混合

样品池中的每一个DNA样品按同样的方法重新进行筛选,直到筛选到突变个体。研究表明,当将一对分别用700nm和800nm荧光染料标记的引物和没有标记的引物混和后进行PCR[10]扩增时,扩增产物会非常稳定[5],这样做既节约了检测突变体的成本,又提高了检测的效率。

1.2.2CELL酶的引入解决了TILLING技术的核心问题

从TILLING技术的操作流程来看,形成异源双链后怎样识别并有效地切割其中的错配碱基是TILLING技术的关键点。一些核酸内切酶(S1）核酸酶[14]、T4内切酶[15]和绿豆核酸酶[16]曾被用于尝试切割这些异源双链分子,但效果并不理想,绿豆核酸酶切割处局限于富含ＴＡ区域,并且只有在pH值酸性条件下才能进行有效切割[17,18]。S1核酸酶对多个碱基的错配切割效率较高,但不能对SNP进行有效地切割[19]。从芹菜中提取的核酸酶CELL能高度特异的识别双链DNA中错配的碱基。该酶提取技术较为简单,在常规的实验室即可进行。并且CELL最佳的切割条件为pH值中性,在Zn2+和Mg2+存在条件下能对包括ＳＮＰ在内的碱基错配进行有效切割[21]。该酶是通过识别错配碱基并在错配碱基的3′

端进行切割的,酶切后的产物经变性的序列胶(PAGE)分离,能够将超过1k的PCR扩增产物内的点突变定位在几个碱基对内[20,21]。林英等从芹菜中粗纯化了CELL酶,以杂合双链DNA为底物,研究了CELL 酶在不同纯化程度、不同温度、不同处理时间以及有无T a q DNA聚合酶条件下的错配切割活性。研究发现,CELL酶的最适活性温度范围为45～50℃ ,处理时间长达150ｍｉｎ时,CELL酶仍能特异识别并切割错配碱基;在含有T a q DNA聚合酶的酶切体系中,CELL酶错配切割效果更佳。对CELL酶的提取及活性分析,为TILLING技术大规模和低成本地应用于功能基因组研究提供了保障[22]。CELL 酶被成功应用于TILLING技术是大大地提高了工作效率[23],是TILLING得到广泛应用的基础。各种软件的开发推动了TILLING技术的发展TILLING技术的快速发展得益于一些基于网络的相关软件的开发。比如基于网络的COODDLE软件可预测基因的重要功能域或氨基酸的变化对基因影响较大的影响。

突变体分析是生物学研究中最重要的研究工具之一,人们对植物生长发育、细胞生物学以及生物代谢的深入研究和理解都离不开突变体分析。人为地创造突变体已经成为近80年来遗传学研究的主要驱动力。在各种诱导突变的物质中,化学诱变剂的应用尤其广泛,比如其中之一的甲基磺酸乙酯就尤为有效,这是因为ＥＭＳ能对碱基进行修饰,最终在DNA复制的过程中因错配而引入突变。然而,尽管遗传学家非常依赖于高效的化学诱变,但由于传统的对突变体的遗传学筛选主要是针对表型来选择,不容易鉴定出那些没有明显可见表型变化的突变体,这致使人们只能鉴定出很少一部分突变。随着多种模式生物的基因组计划的完成和生物信息学的高速发展,现在人们已经拥有了多种生物大量的基因组序列,因而反向遗传学方法正变得越来越重要。但是以PCR为基础的检测方法只能检测到插入缺失突变体,对于那些点突变却无能为力。几年前发展起来的定向诱导基因组局部突变技术,,即TILLING技术能够检测到单个碱基的突变和变异,这种技术首先由 Mclallum提出,后来由于CELL 核酸内切酶的应用得到了进一步的发展和完善.。

2 TILLING和Ecotilling技术在麦类作物改良中的应用

与拟南芥等植物不同,麦类作物基因组普遍较大,应用TILLING技术难度较大,如六倍体小麦基因组高达17 000 Mb,是人类基因组大小的5倍,是拟南芥基因组大小的140倍,而且基因组内部有大量的冗余重复序列,每个基因往往含有至少三个以上的拷贝,这无疑更加剧了TILLING技术在小麦中的应用难度。但随着该项技术经过不断的改进和完善,其在小麦和大麦等麦类作物中的应用也逐渐变得可行起来。Caldwell等[15]分别利用变性的高效液相色谱技术对经EMS处理的大麦群体进行了研究,发现经20、30 mmol/L EMS处理的大麦种子不育率小于10%,较适合TILLING研究,并在Hordolindoline基因中发现了28个新的单倍型,由此推断经EMS处理的大麦群体中其DNA片段每1Mb 就会有一点突变发生,同时还在表型筛选中发现了多个群体不同表型的变化类型。苏格兰大麦研究所采用EMS诱变技术已经处理产生了超过22 000份大麦突变体品系,发现群体中每隔10万个核苷酸序列就会有1到5个碱基的变异,并与英国和欧洲多家实验室联合鉴定突变体,从而建立了大麦的TILLING筛选方案性状涉及到穗发芽、种子春化、开花时间、抗病和种子萌发等诸多指标。更为惊奇的是,Slade等[16]以小麦颗粒淀粉合成酶I(Granule-bound starch synthase I,GBSSI)基因片段为引物,利用TILLING技术对经EMS处理的小麦群体进行了筛选,在1 152个M2小麦单株(768份0.75%的EMS处理群体和384份1%的EMS处理群体)和768个硬粒小麦单株中分别获得了196个和50个新的等位变异基因,并发现有些等位变异的发生减少了小麦中直链淀粉的合成,因此可以推断在小麦中平均每24 kb就有一个点突变出现,而在硬粒小麦中平均每40 kb的DNA片段上就有一个点突变出现,远远高于拟南芥的突变频率。从而表明,TILLING技术在小麦作物的功能基因组研究和分子改良实践中具有光明的应用前景。之后,Wang等[17]采用Ecotilling技术对来源于中国不同生态类型的小麦微核心种质资源中籽粒硬度基因类型进行了等位变异鉴定,并在一来源于新疆冬春麦区的小麦品种卡什白皮中发现了一种新的硬度变异类型,将其命名为Pinb-D1x。最近,Feiz等[18]利用EMS诱变技术创建了2 500株普通软质小麦突变体库,通过对所有调查植株中小麦籽粒硬度基因Pina和Pinb的全长序列进行测序后,共获得了超过250个突变体,推算发现,每隔12 kb就会有一突变体产生,而且,有些突变体品系的硬度值有很大提高,其创制的突变体库是目前报道中突变频率最高的突变体库。笔