070第七章 干细胞与组织工程
干细胞技术与组织工程
干细胞技术与组织工程干细胞技术与组织工程是当今医学领域备受瞩目的前沿技术，它们为治疗各种疾病和损伤提供了全新的思路和方法。
干细胞具有自我更新和多向分化的能力，可以分化为各种类型的细胞，因此被认为是修复和再生组织的理想来源。
组织工程则是利用细胞、支架和生长因子等生物材料构建人工组织和器官，为重建受损组织提供了新的途径。
本文将从干细胞技术和组织工程的基本概念、应用现状以及未来发展方向等方面进行探讨。
一、干细胞技术干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，根据其分化能力和来源的不同，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。
胚胎干细胞来源于早期胚胎，具有最广泛的分化潜能，可以分化为人体的任何细胞类型；而成体干细胞存在于成体组织中，分化潜能较低，主要起到组织修复和再生的作用。
1.1 胚胎干细胞胚胎干细胞具有最广泛的分化潜能，可以分化为各种类型的细胞，包括心脏细胞、神经细胞、肌肉细胞等。
它们通常来源于早期受精卵，通过体外培养可以获得大量的干细胞。
胚胎干细胞的应用主要集中在疾病治疗和再生医学领域，如心脏病、糖尿病、神经退行性疾病等。
1.2 成体干细胞成体干细胞存在于成体组织中，包括骨髓干细胞、脂肪干细胞、神经干细胞等。
它们具有一定的分化潜能，可以分化为相应组织的细胞类型，用于组织修复和再生。
成体干细胞的应用范围较广，包括骨髓移植、软骨修复、皮肤再生等领域。
二、组织工程组织工程是利用细胞、支架和生长因子等生物材料构建人工组织和器官，旨在重建受损组织和器官，为临床治疗提供新的选择。
通过组织工程技术，可以实现体外培育组织工程器官，或者在体内种植人工组织，为患者提供个体化的治疗方案。
2.1 细胞在组织工程中，细胞是构建组织和器官的基本单位，可以是干细胞、成体细胞或iPS细胞等。
不同类型的细胞具有不同的特性和应用范围，选择合适的细胞来源对于组织工程的成功至关重要。
2.2 支架支架是支撑细胞生长和定向分化的载体，可以是生物材料或人工材料制成。
第七章干细胞与组织工程
中的多能干细胞。
二、胚胎干细胞（Embryonic Stem cell, ES细胞）
（一）定义：当受精卵分裂发 育成囊胚时，内层细胞团的细 胞即为胚胎干细胞。 ES细胞的研究可追溯到上世纪 五十年代，由于畸胎瘤干细胞 （EC细胞）的发现开始了ES 细胞的生物学研究历程。
胚胎干细胞和成体干细胞的比较
霍金批评欧美人士试图禁止人类胚胎 干细胞研究
中国人对胚胎干细胞研究的看法 比较一致
• 大多数中国人能够接受此项研究,主要是 受儒家思想的影响。儒家很早以前就已 经指出，人生出来的时候，人才开始。 按照大多数中国人的看法，胚胎还不是 人，不涉及人权问题。
伦理冲突
• ES研究也引发了当前最为激烈而敏感的伦 理之争。主要围绕如何看待胚胎。ES主要 有三个来:
• （1）（自然和人工）流产的胚胎； • （2）辅助生殖剩余的胚胎； • （3）通过体细胞核转移术得到的胚胎。
• 不管哪一个来源，提取ES必定会损毁胚胎。 于是，胚胎是不是生命，是不是人，研究 ES是不是“毁灭生命”、“杀人”，很自 然地成为争论的焦点。
新进展
※ 1999年12月，美国《科学》杂志公布了当年世界科 学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗 资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。 ※ 2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们 首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎 干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。
第7章 干细胞工程
成体干细胞
7.1.2
7.1.2.1
成体干细胞
造血干细胞（Hematopoietic stem cell）
• 体内各种血细胞的唯一来源，主要存在于成体骨髓、外周 血、脐带血中。 • 应用：20世纪50年代，骨髓移植治疗血液系统疾病。 80年代末，外周血干细胞移植技术 1979年，脐带血干细胞
7.1.2
② ES细胞高度未分化，具有形成畸胎瘤的可能性
③ ④ 技术上仍需突破 伦理
7.1.2
成体干细胞
成体干细胞：
是分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更新、并
能构建和补充相应组织的各种类型细胞潜能的干细胞。
7.1.2
成体干细胞
成体干细胞：造血干细胞 神经干细胞 骨髓间充质干细胞 皮肤干细胞 „
7.1.2
7.2
组织工程
组织工程：是指应用工程学和生命科学的原理和方法来研究正 常或病理状况下哺乳动物组织的结构、功能和生长的机制，
研究开发能够修复、维持或改善损伤组织的人工生物替代
物的一门学科。
7.2
组织工程
人体组织与器官的基本结构
7.2
组织工程
人体组织由细胞及支撑细胞
的细胞外间质构成extra-cellular
成体干细胞
•HSC的主要生物学特征: (1) 自我更新或自我维持。即HSC能维持自己的数量不变。 (2) 高度增殖潜能。仅占骨髓有核细胞总数的1%-3%,且大多 数处于G0 期。
(3) 多向分化潜能。在特定的环境条件和其他因素作用下,
HSC具有向各系血细胞分化的能力,以满足机体各种血细
胞数量的平衡。此外,HSC还具有可塑性,可向某些非造血
7.1.2
成体干细胞
干细胞在组织工程中的应用方案探索
干细胞在组织工程中的应用方案探索干细胞是具有自我复制和分化能力的细胞种类，被广泛研究用于组织工程和再生医学领域。
干细胞的应用潜力巨大，可以为受损组织提供新的细胞源，促进组织修复和再生。
本文将探索干细胞在组织工程中的应用方案，重点讨论干细胞来源、处理方法以及在组织修复和再生中的具体应用。
一、干细胞来源：干细胞的来源多种多样，包括胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞。
胚胎干细胞是最早被发现和研究的干细胞类型，具有较高的多能性，能够分化成各种不同类型的细胞。
然而，由于胚胎干细胞来源的伦理和法律问题，其应用受到了限制。
成体干细胞是成熟组织中存在的一类特殊细胞，具有一定的分化潜能。
成体干细胞来源广泛，包括骨髓、脂肪组织、血液、牙髓等。
通过适当的处理和培养条件，成体干细胞可以扩增并分化成需要的细胞类型。
诱导多能干细胞是通过基因转导或药物处理等方式将成体细胞重编程成类似胚胎干细胞的状态，具有多能性。
这些来源的干细胞都可以应用于组织工程，但在选择来源时需综合考虑细胞的多能性、获取难度和伦理法律等因素。
二、干细胞处理方法：干细胞处理是保证其在组织工程中应用成功的关键步骤。
处理方法涉及到细胞的培养、扩增、分化和植入等过程。
首先，干细胞需要经过严格的培养条件来保持其干性和稳定性。
培养基中的各种生长因子和细胞外基质可以促进干细胞的增殖和维持干性。
其次，干细胞的扩增是实现足够细胞数量的必要步骤。
通过适当的扩增条件，干细胞可以快速增加，并保持其干性和遗传稳定性。
再次，干细胞的分化是将其导向特定细胞类型的过程。
通过调控培养条件和添加适当的诱导因子，干细胞可以分化为神经细胞、心脏细胞、肝细胞等不同细胞类型。
最后，干细胞的植入是实现组织修复和再生的关键步骤。
正确植入和定位干细胞可以促进组织的再生和修复，治疗各种组织缺陷和疾病。
三、干细胞在组织修复和再生中的具体应用：干细胞在组织工程中的应用日益广泛，主要应用领域包括神经组织、心血管组织、骨骼组织和肝脏组织等。
细胞工程-第7章-干细胞与组织工程
（2）神经干细胞特点
• 自我更新：神经干细胞具有对称分裂及不对称
分裂两种分裂方式，从而保持干细胞库稳定。 • 多向分化潜能：神经干细胞可以向神经元、星形
胶质细胞和少突胶质细胞分化。 • 低免疫源性：神经干细胞是未分化的原始细胞，
不表达成熟的细胞抗原，不被免疫系统识别。 • 组织融合性好：可以与宿主的神经组织良好融合，
（6）OCT基因活性鉴定
• OCT基因:ES细胞中特异性表达，常作为标 志基因。利用OCT抗血清和间接免疫荧光 法可检测ES细胞。也可作为鉴定ES细胞分 化与否的依据。
• 此外，ES细胞发育全能性的标志：ES细胞 表面表达时相专一性胚胎抗原（Stage specific embryonicant，SSEA），
（5）组织工程应用
• ①组织工程化皮肤
• ②组织工程化骨骼
• ③组织工程化血管 • ④组织工程化管状器官（食道，气管，肠道，
尿道、肾脏）
• ⑤组织工程化腺体器官（肝脏，胰脏，甲状腺）
科学家首次利用人体干细胞培育出颚骨
（6）组织工程的意义
• 在体外构建有生物活性的种植体，植入体 内修复组织缺损，替代器官功能；
(3).造血干细胞移植的作用
• 造血干细胞移植是现代生命科学的重大突破。造 血干细胞移植可治疗恶性血液病，部分恶性肿瘤， 部分遗传性疾病等 75 种致死性疾病。包括急性 白血病、慢性白血病、骨髓增生异常综合征、造 血干细胞疾病、骨髓增殖性疾病、淋巴增殖性疾 病、巨噬细胞疾病、遗传性代谢性疾病、组织细 胞疾病、遗传性红细胞疾病、遗传性免疫系统疾 病、遗传性血小板疾病、浆细胞疾病、地中海贫 血、非血液系统恶性肿瘤、急性放射病等。
如何解决伦理矛盾
不破坏胚胎的情况下获取胚胎干细胞 成体干细胞横向分化 睾丸细胞：胚胎干细胞的新来源 iPS
细胞工程原理成体干细胞及组织工程学ppt课件
角蛋白19（cytokeratin 19, CK19）， 神经细胞粘附分子（neural cell adhesion
molecule，NCAM） 上皮细胞粘附分子（EpCAM） claudin-3（CLDN-3）
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
首都医科大学附属神经外二科主任黄红云等自 2001年起在世界上率先开展流产胎（婴）儿嗅 鞘细胞（一种干细胞）移植治疗脊髓损伤。
已经治疗近400例，部分完全性脊髓损伤患者 恢复部分功能。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
干细胞横向分化 （transdifferentiation）
组织干细胞通过活化潜 在的其他分化程序，改 变了组织干细胞的特异 性种系分化进程 。
造血干细胞向非造血组 织细胞分化、神经干细 胞向血液系统细胞分化
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
1996，我国徐荣祥在烧伤创面上找到皮肤器官原 位再生的原始细胞“角蛋白十九型皮肤干细胞”， 他们成功诱导上皮组织基底层的干细胞分化生成 皮肤细胞，使受伤的皮肤得以迅速康复，实现人 体器官原位再生，获得美国专利。
该技术显示我国干细胞研究已进入组织和器官的 原位干细胞修复和复制阶段，在国际上处于领先 地位。
胚胎干细胞与成体干细胞
胚胎干细胞——全能干细胞（totipotent stem cell）
干细胞技术在组织工程中的应用研究
干细胞技术在组织工程中的应用研究在组织工程中，干细胞技术被用于修复和再生受损的组织和器官。
研究人员可以通过实验室培养的方法将干细胞分化为特定的细胞类型，然后将这些细胞移植到患者体内。
这种方法可以用于修复各种类型的组织和器官，如肝脏、心脏、肺部和神经组织等。
首先，干细胞技术在肝脏组织工程中有着重要的应用。
肝脏是人体最重要的器官之一，能够合成和代谢多种物质。
由于常规的治疗方法无法治愈一些肝脏疾病，使用干细胞技术来修复和再生受损的肝脏组织成为一种新的治疗方法。
通过将干细胞培养为肝细胞，并将其植入患者体内，可以恢复肝脏的功能。
大量的实验研究已经证明，干细胞技术在肝脏组织工程中具有巨大的潜力。
其次，干细胞技术在心脏组织工程中也有着广泛的应用。
心脏疾病是世界范围内的主要死因之一，心肌细胞的损伤和死亡是造成心脏疾病的主要原因之一、通过使用干细胞技术，研究人员可以将干细胞培养成心肌细胞并将其植入受损的心肌组织中。
这些干细胞可以重新定向分化为心肌细胞，从而促进心脏组织的再生和修复。
早期的研究结果表明，干细胞技术对于心脏病的治疗具有巨大的潜力。
另外，干细胞技术在肺部组织工程中也显示出重要的应用前景。
肺部是呼吸系统的主要组成部分，可以吸入氧气并从体内排除二氧化碳。
由于肺脏受到污染、损伤和疾病的严重威胁，一旦肺脏受损，就极难恢复其正常功能。
使用干细胞技术，研究人员可以定向分化干细胞成为肺部细胞，并将其移植到受损的肺组织中。
干细胞可以促进肺部组织的再生和修复，为肺部疾病的治疗提供新的方法。
最后，干细胞技术在神经组织工程中有着重要的应用。
神经组织的损伤和疾病会导致多种神经系统疾病，如帕金森病、脑卒中和脊髓损伤等。
干细胞技术可以用来修复和再生受损的神经组织，通过将干细胞植入受损的神经系统中，可以提供新的神经元和神经细胞以重建神经通路。
这项技术在实验室和临床研究中已经取得了一系列的突破。
综上所述，干细胞技术在组织工程中的应用研究为治疗各种疾病和恢复受损组织提供了新的方法。
细胞工程-第7章-干细胞
• （1）形态学鉴定：典型的ES细胞体积较小， 有一个大核，核内有一个或多个明显的核仁， 胞质较少。细胞之间界限不清晰，紧密聚集呈
鸟巢状克隆。
（2）碱性磷酸酶活性鉴定
碱性磷酸酶染色（固蓝），呈阳性 （深蓝黑色）
未分化细胞（ES细胞）
已分化细胞
（3）体内分化试验：
将一定量培养的ES细胞注入同源动物的皮
（2）ES细胞的分离方法：
• A: 免疫学方法 • 利用ES细胞所具 有的特殊标记细胞。
B:免疫外科学方法
• 利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体与补体结 合后所产生的对其它细胞的毒性杀伤作用，除去滋 养层细胞，保留ES细胞。 • 聚集在胚胎的一端，个体较大的细胞，称为内细胞 团（inner cell mass，ICM），属于ES细胞，将 来发育成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和 排列的，个体较小的细胞，称为滋养层细胞，不能 发育成胚体，它们将来只能发育成胚外结构如，胎 膜和胎盘。
7.1.4 ES细胞的分化与调控
• 1. ES细胞的分化 • ES细胞在体外极易分化。 • ES细胞中碱性磷酸酶 （AKP ）及端粒酶 活性较高，可用于ES细胞分化与否的鉴定。 • 把ES细胞与饲养层细胞共培养，可以抑制 其分化，维持其稳定的增殖状态。解除共 培养，则会导致ES细胞自发分化。
2. ES细胞分化的调控
• （1）内源性调控 • 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号 起反应从而调节其增殖和分化，包括调节 细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的 核因子等。 • 这种内源性调控主要来自ES细胞内所含蛋 白（如结构蛋白等），以及部分转录因子。
（2）外源性调控
• 间质细胞的分泌因子，能维持ES细胞增殖分化等；
细胞。它具有发育的全能性，能分化出成
干细胞与组织工程 ppt课件
25
Neural Stem Cell Therapy for Clinical Application
神经干细胞治疗临床应用
帕金森病（Parkinson disease，PD）； 阿尔兹海默病（Alzheimer disease，AD）； 亨廷顿病（Huntington disease，HD）；
针对患者组织或器官缺损的情况，利用 干细胞工程技术，诱导细胞定向分化，为其 提供空间支持材料，在体内外培育出所需的 人体组织。
今后可能进一步培育出人造器官。
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Three Steps on the Research of Tissue Engineering
制备干细胞，诱导定向分化； 建立由细胞和可降解材料构成的三维空
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造血干细胞转腺苷脱氨酶基因（ada），6年后在外 周血淋巴细胞尚可检测到表达；
标记造血干细胞移植治疗急性白血病儿童，8年后 尚可在外周血中检测到标记的血细胞；
造血干细胞基因治疗的临床效果大多不理想；
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Neural Stem Cell (NSC)
神经干细胞（1）
1992年，Reynolds等首先从胎鼠和成鼠的 纹状体分离得到神经干细胞，形成球形细胞 团；可分化为神经系统的三种主要细胞：神 经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞；
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成人干细胞体外增殖太久可能癌变 之原因
其原因是这些开始生成端粒酶。端粒酶有阻 止端粒随细胞分裂而逐渐缩短的作用，从而 稳定染色体的末端，在保持细胞“永生”性 中起重要作用。永久打开充质干细胞的端粒 酶基因，最终将使其变成癌细胞。
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展望
随着干细胞工程研究的不断深入， 生命的奇迹必然在21世纪出现!
干细胞与组织工程 概述
植入细胞存活情况
TUNEL
植入后干细胞凋亡率小于20%
乳酸脱氢酶显示细胞死亡情况和 对照组无明显差异
电镜观察 组织学评价
肝细胞植入2天后电镜观察，细胞附着 在基质上生长情况良好
干细胞植入后细胞生长情况良好，表达干细胞特异性标志物 Albumin、G6pc、Ugt1a
制得大鼠脱细胞肺脏后，采用肺上皮细 胞、血管内皮细胞再细胞化，获得的再 细胞化肺脏在植入到大鼠体内后具有一 定的气体交换功能
按分化潜能
• 全能干细胞 • 多能干细胞 • 单能干细胞
干细胞：生命机体和组织器官的起源细胞
囊内 胚胎干细胞
受精卵
原始胚胎干胞
囊胚
胚胎干细胞 全能干细胞
胎儿 脐血 成人
成体干细胞 多能干细胞
再生医学 重塑生命
成体干细胞
机体多种成熟分化的组织中普遍存在成体干细胞
骨髓间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞、脂肪干细胞、肌肉干细 胞、表皮干细胞、角膜缘干细胞、视网膜干细胞、肝脏干细胞 、胰腺干 细胞、肠黏膜干细胞等
Cell Based Delivery (Pro vidence, RI) Collagenesis (Beverly, MA) CellSource (Pittsburgh, PA)
Creative Biomolecules (Hopkinton) Cyto Therapeutics (Providence, RI)
MRI图： A、D箭头所指显示软骨缺 损； B、E术后一年，植入物厚度 低于正常的50% C、F术后六年，植入物厚度 与正常软骨相当
J Orthop Sci. 2012 Jul;17(4):413-24.
构建：自体软骨组织，体外培养软骨 细胞
干细胞与组织工程间充质干细胞及其应用
通过间充质干细胞的软骨分化能力，构建软骨组织工程产 品，用于关节软骨损伤、退行性关节病等治疗。
心肌组织再生
利用间充质干细胞的心肌分化潜能，结合生物材料支架和 生长因子等，构建心肌组织工程产品，用于心肌梗死、心 力衰竭等治疗。
挑战与前景展望
挑战
目前间充质干细胞在再生医学领域的应用仍面临许多挑战，如细胞来源、安全性、有效性等问题。
干细胞与组织工程间充质干细胞的精准医疗应用
随着精准医疗理念的深入人心和基因编辑技术的发展，未来有望实现间充质干细胞的精 准医疗应用，为个体化治疗提供新的解决方案。
干细胞与组织工程间充质干细胞的跨领域合作与创新
未来，随着多学科交叉融合的不断深入，有望实现间充质干细胞在再生医学、组织工程 、生物材料等多个领域的跨领域合作与创新，推动相关产业的协同发展。
原理概述
组织工程是应用生命科学和工程学原 理，通过构建生物功能替代物来修复 、维持或改善人体组织功能的一门新 兴交叉学科。
技术手段
主要包括细胞培养、生物材料支架制 备、细胞-材料复合物构建、移植及体 内外评价等步骤。
在再生医学领域应用实例
骨组织再生
利用间充质干细胞的成骨分化能力，结合生物材料支架， 构建骨组织工程产品，用于治疗骨缺损、骨折不愈合等。
03
间充质干细胞鉴定与功能分 析
鉴定方法
形态学鉴定
通过显微镜观察细胞形态，间充质干细胞呈长梭形或纺锤形，具 有贴壁生长的特性。
表面标志物鉴定
采用流式细胞术等方法检测细胞表面标志物，如CD73、CD90、 CD105等，以确认间充质干细胞的身份。
多向分化能力鉴定
在特定条件下诱导间充质干细胞向成骨、成脂、成软骨等方向分化 ，以验证其多向分化潜能。
细胞工程第七章-精品文档25页
（2）多能干细胞（Multipotent stem cell）：能够形成两种 或两种以上类型细胞的干细胞。例如骨髓造血干细胞就 是典型的多能干细胞，可以分化成红细胞、巨噬细胞、 粒细胞、巨核细胞、淋巴细胞等多种类型细胞。
第七章 干细胞
一、干细胞的定义与应用 （一）定义
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
（二）特征
1、自我更新特征 自我更新是指干细胞具有分裂和自我复制能力。
（1）对称分裂（symmetric division）是指一个干 细胞分裂产生的两个子细胞全是干细胞。
（2）不对称分裂（asymmetric division）是指一个 干细胞分裂成一个干细胞和一个短暂增殖细胞， 称之为祖细胞（progenitor cell)。祖细胞不具备 自我复制的能力。
2、增殖特征 （1）增殖的缓慢性：一般情况下，干细胞处于休眠
或缓慢增殖状态。缓慢增殖可以减少基因发生突 变的可能性。
（2）增殖的自稳性：也称自我维持，是指干细胞 会自我更新维持自身数目的恒定，主要是通过不 对称分裂来实现。
3、分化特征 （1）单能干细胞（Monopotent stem cell)：只能分化为单一
任何涉及丧失正常细胞的疾病都可以通过移植由 胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗。
《科学日报》2019年5月27日 报道，美国加州大学欧文分校 （UC Irvine）的科学家们用人 类胚胎干细胞培育出一种早期 阶段的视网膜，为开发可移植 性视网膜来治疗人类视网膜病 变迈出了第一步——Journal of Neuroscience Methods。
二、分类与特点
◆不同的干细胞具有不同的分化潜能。 ◆从所具有的分化功能上讲，干细胞可分为单能干
干细胞在组织工程中的应用指南
干细胞在组织工程中的应用指南干细胞是能够不断自我更新和分化为不同细胞类型的特殊细胞类型。
它们具有广泛的应用前景，在医学领域中被广泛研究和应用。
其中，干细胞在组织工程中的应用具有独特的优势和挑战。
本文将从干细胞的类型、来源、特点以及在组织工程中的具体应用等方面，为读者提供一份干细胞在组织工程中的应用指南。
一、干细胞的类型和来源干细胞可以分为两大类:胚胎干细胞（ES细胞）和成体干细胞（ASCs）。
ES细胞来自胚胎早期，具有广泛的分化潜能，并且可以无限制地自我复制。
ASCs来源于成体组织，分为两类:组织特异性干细胞和多能干细胞。
组织特异性干细胞局限于特定组织的再生，而多能干细胞则具有广泛的分化潜能。
二、干细胞在组织工程中的优势1.自我更新能力：干细胞具有不断自我更新的能力，可以提供源源不断的细胞来形成组织。
2.多潜能分化能力：干细胞可以分化为多种细胞类型，包括肌肉细胞、神经细胞和心脏细胞等，可以实现组织和器官的再生。
3.减少免疫排斥：干细胞在移植时可以避开免疫排斥反应，从而提高移植效果和存活率。
4.可控性和可操控性：研究人员可以通过外界刺激来控制干细胞的分化和增殖，实现对组织工程过程的精细控制。
三、干细胞在组织工程中的具体应用1.器官再生通过干细胞的多潜能分化能力，可以实现受损器官的再生。
例如，心脏病患者可以通过干细胞移植来修复受损的心肌组织。
干细胞可以分化为心肌细胞并进行植入，修复心肌损伤，提高心肌功能。
2.组织修复干细胞在组织修复中发挥重要作用。
例如，骨髓干细胞可以分化为成骨细胞，并用于骨组织修复。
这种方法可以有效治疗骨折、骨缺损等骨骼问题。
3.疾病治疗干细胞也应用在疾病治疗领域中，例如，造血干细胞移植用于治疗白血病、淋巴瘤等血液系统疾病。
这些干细胞可以重新建立正常的造血系统，恢复病人的免疫功能。
4.药物筛选和毒性评估干细胞在药物筛选和毒性评估方面具有潜在的应用价值。
通过将药物或毒素作用于干细胞，并观察其分化和增殖的变化，可以评估药物的疗效和毒性。
细胞工程动物要点总结
第十章动物染色体工程动物染色体倍性改造：染色体倍性改造工程是指有目的、有计划地增加或减少一组或几组同源或异源染色体，以创造动植物新品种的一项染色体工程技术，主要包括多倍体育种和单倍体育种。
染色体加倍技术：1、化学诱导方法：（1）秋水仙素：秋水仙素能抑制和破坏纺锤丝的形成。
因此，用秋水仙素处理正在分裂的细胞，可使染色体正常复制而细胞不发生分裂，从而形成同源多倍体的细胞。
（2）细胞松弛素B：通过抑制动物的肌动蛋白聚合成微丝，阻止细胞质的分裂。
（3）麻醉剂N2O等。
2、物理诱导法：（1）温度休克法：包括略低于致死温度的冷休克法(0～5℃)和略高于致死温度的热休克法(30℃左右)两种。
温度休克法廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段。
它受三个因素的制约：温度处理的开始时间,即受精后的时间(TA)处理持续时间(D)处理温度(T)。
（2）水静压法:采用较高的水静压(65 kg／cm。
)来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。
（3）高盐高碱法.3、生物学方法生物学方法主要是通过杂交方法，尤其是种间或不同属、科间的远缘杂交，使染色体加倍，也称为染色体组的合并技术。
如狮子和老虎杂交，马和驴杂交。
多倍体的倍性鉴定:1、直接法：（1）染色体计数法：染色体计数是鉴定多倍性的一个准确的直接方法，但比较费时。
质量好的染色体标本可以从胚胎获得，因为胚胎细胞分裂指数高。
（2）DNA含量测定：流式细胞仪(flow cytomety)可以简单、快速及准确测定单细胞DNA含量，从而确定细胞的倍性。
2、间接法：（1)细胞体积测量：按照一般规律，细胞大小与染色体数目成比例增加，而且为维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。
但多倍体的器官或身体并不一定都比二倍体大。
红细胞体积测量简便易行。
（3）蛋白质电泳（3）生化分析：二倍体和三倍体的血液成分和细胞组成比例不一样。
动物多倍体育种的意义：（1）诱导的多倍体动物多数都具有良好的生长率（2）低等动物(如鱼类等)的种间杂交优势也非常明显。
大学课程干细胞与组织工程课件
癌症干细胞驱动肿 瘤的发生，并逃避 放化疗引起复发
Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature, 2012 A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature, 2012 Lineage Tracing Reveals Lgr5+ Stem Cell Activity in Mouse Intestinal Adenomas. Science, 2012
四倍体补偿实验
2-细胞期诱导2个卵裂球融合形成四倍体，继续发育形 成的四倍体囊胚没有ICM，只有滋养层。将ESC显微 注射到这种空囊胚中，移植后出生的后代完全来自 ESC。被称为验证ESC多能性的金标。
ESC多能性的体现（验证方法）
✓形成畸胎瘤（ teratoma） ✓形成类胚体（embryoid body） ✓直系分化（direct differentiation） ✓形成嵌合体（chimera） ✓四倍体补偿（tetraploid complementation）
畸胎瘤实验
ESC注射到裸鼠皮下，形成畸胎瘤，其中三胚层来源 的各类组织杂乱聚集。体内鉴定ESC多能性的指标
ES细胞分化的调控
内源性调控：
✓细胞内结构蛋白对分裂的调控 ✓转录因子的调控（如OCT4， NANOG，SOX2等）
外源性调控：
✓间质细胞分泌的因子（如TGFβ家 族，Wnt/β-catenin信号通路） ✓膜蛋白介导的细胞间相互作用 （Notch信号通路） ✓整合素（integrin）与ECM
Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell–Like Cells in Mice. Science, 2012
组织工程与干细胞技术的发展
组织工程与干细胞技术的发展随着现代科技的迅猛发展，医学科技也在不断地进步和更新。
其中，组织工程和干细胞技术的发展尤为引人注目。
组织工程组织工程是一种将生物和非生物材料以特定的方式组合成功能性组织的科技。
它的主要目的是在人体内重建受损组织，或为医学研究提供新的材料。
组织工程结合了生物材料学、细胞生物学和力学等多个学科，可以帮助医生们构建出由细胞、材料和生物化学平衡所组成的“组织构造体”。
关于组织工程，我们不能不提到一些基础研究，例如干细胞文化和基因工程等技术。
这些科技提供了从数百到数百万个细胞的纯化方法，使得细胞可以在生物或非生物材料上获得形成组织所需的化学和物理功能。
组织工程也已应用在很多领域，例如心血管医学、骨科和皮肤学等。
在制备工程组织的过程中，散在的细胞会在生物和非生物材料上通过三维细胞培养技术定向排列。
此外，工程组织中的细胞和材料通常会使用生长因子、细胞信号和物理刺激等手段进行激活，以获得更好的功能。
在兼具强韧度和稳定性的生物材料和细胞的共同努力下，细胞组成的组织会趋向于在生物环境中产生与自然结构相似的形状和功能。
干细胞技术干细胞技术是指通过利用干细胞的分化和自我更新能力来修复或替换不同组织和器官。
干细胞通常被认为是具有高度可塑性和自我复制能力的特殊类型的细胞，这种细胞可以在体内不断分化，形成各种不同的功能性细胞，并且可以自我复制，产生更多的同类细胞。
干细胞天然的自我更新和不断分化的能力使得它成为一种有着极高潜力的替代品。
但是，由于干细胞诱导技术可能引起细胞分化方向的偏离、不干净的培养条件、肿瘤或病毒感染等问题，因此发展科技工程干细胞，已成为当前最热点的研究领域之一。
最近研究表明，工程组织中的干细胞可以通过使用相应的化学物质和物理学建议增强细胞与工程组织的相互作用，使干细胞能够定向分化和增殖，将工程组织推向一个更高的水平。
在干细胞技术的帮助下，工程组织和干细胞组成的已造出类似于人心脏、皮肤等模型。
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5.根据干细胞组织发生部位分类：
ES细胞：存在于早期胚胎内细胞团的全能干细胞； AS细胞：来自成体组织的各种多能干细胞；
EG细胞：来自于早期胚胎生殖嵴原始生殖细胞的多
能干细胞；
霍金批评欧美人士试图禁止人类胚胎 干细胞研究
中国人对胚胎干细胞研究的看法 比较一致
• 大多数中国人能够接受此项研究,主要是 受儒家思想的影响。儒家很早以前就已 经指出，人生出来的时候，人才开始。 按照大多数中国人的看法，胚胎还不是 人，不涉及人权问题。
伦理冲突
• ES研究也引发了当前最为激烈而敏感的伦 理之争。主要围绕如何看待胚胎。ES主要 有三个来: • （1）（自然和人工）流产的胚胎； • （2）辅助生殖剩余的胚胎； • （3）通过体细胞核转移术得到的胚胎。
1.ES细胞形态结构及核型
1）. 各种动物的ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的
形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。
2）. ES细胞与卵圆柱期（egg cylinder stage）胚 胎外胚层和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似。 3）. 细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着 大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性质。 正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分 化形成动物个体。
生殖细胞在内的各种细胞的潜能，有这种潜能的
细胞称为三胚层多能干细胞。如内细胞团。
③ 单胚层多能干细胞（多能干细胞 ）：有分化
出多种组 织细胞的潜能，失去了发育成完整个体
的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓多能造
血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血
细胞。间充质干细胞也属于单胚层多能干细胞
④ 单能干细胞:这类干细胞只能向一种类型或密
3.ES细胞的高度分化潜能
ES细胞的全能性是其区别于成 纤维细胞等体细胞的
显著特点
1）. ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持
其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。
2）. 在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮
培养中： “简单类胚体” “囊状胚体” 细胞分
化物。
3）. ES细胞可进行诱导分化
第七章 干细胞与组织工程
干细胞研究成为继人类基因组大规模测序
之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生
命学科研究领域，1999年干细胞研究被美国
《科学》杂志评为1999年度世界十大科学之冠，
2000年干细胞研究再次被《科学》杂志评为该 年度世界十大科学成就之一。 组织工程是以干细胞研究为基础发展起来， 它有望解决临床上急需的人工组织与器官问题，
另一方面在一定条 件下可以进入分化程 序，通过不对称分裂 产生分化的子代细胞， 最终形成功能特异的 组织类型，在组织修 复和新陈代谢中起重 要作用。
（二）分类 1.按分化潜能大小来分类:
① 全能干细胞:有形成完整个体的分化潜能。如受
精卵，桑葚胚。
② 三胚层多能干细胞（万能干细胞 ）：失去发育
成完整个体的能力，但仍具有分化成个体中包括
（一）干细胞有几个主要特征
干细胞本身不是终末分化细胞；
干细胞能无限增殖分裂；
干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内
处于静止状态；
干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运—
—保持为干细胞 或分化为特定细胞。
一方面进行自我更 新（self-renew)，产 生与亲本完全相同的 子代细胞，以保持干 细胞数量的恒定；
• Scientists James Thomson and John Gearhart joined patient advocate Christopher Reeve 克里斯托弗· 里夫to discuss stem cell research
2007年欧盟经过长时间的辩论后决定拨款资助人类干 细胞研究。而此前，美国总统布什首次动用否决权，驳 回胚胎干细胞研究的法案，引起轩然大波。这个事件在 科学、 伦理和政治的揪扯下，愈演愈烈，最后终于引 发了一场激烈的“文化战争”。
※ 2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们 首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎 干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。 ※ 目前已有报导ES细胞能在适当条件下分化为心肌细 胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。
（三）ES细胞生物学特性
1.细胞形态结构及核型
2.细胞的高度分化潜能 3.碱性磷酸酶的表达 4.胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达 5.细胞分化的调控
特征。
2.ES细胞的全能性表现
①形成畸胎瘤。将ES细胞注入同源动物皮下可形成 畸胎瘤，包括三个胚层细胞； ②形成类胚体。培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生 长，或控制增殖细胞数目。能够使之生成类胚体，它 是一个与畸胎瘤相似的多种系混杂的集合体、具有三 个胚层组织；
2.ES细胞的全能性表现
③直系分化。通过控制ES细胞生长环境，或遗传操纵 特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞， 例如将神经决定基因NeuroD2和NeuroD3转人ES细胞， 可使之分化为神经细胞； ④形成嵌合体。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后， 可以形成嵌合体（chimera），ES细胞可以参与嵌合体各 个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为 ES细胞的标准。
切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层
干细胞、神经元干细胞、肌肉中的成肌细胞等。
2.根据干细胞所处的发育阶段来分：
胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)
成体干细胞(somatic stem cell)
3.根据来源来分: 来源于胚胎--- 胚胎干细胞 ESC （Embryonic Stem Cell ） 胚胎性生殖细胞 EGC （Embryonic Germ Cell ） 来源于成体--- 成体组织来源的干细胞 ASC （Adult-derived Stem Cell ）
胚胎干细胞和成体干细胞的比较
定义:当受精卵分裂发育 成囊胚时，内细胞团的 细胞就是胚胎干细胞。
成体干细胞位于成 体的组织和器官
特点：具有很强的分化能 力，可以无限增加，并且 可以分化成全身２００多 种细胞类型。
总结：它能长成动物的 任何组织和器官
特点：在特定条件下，成 体干细胞或者产生新的干 细胞，或者按一定的程序 进行分化，形成新的功能 细胞，从而使组织和器官 保持生长和衰退的动态平 衡。
2. ES细胞的分离培养
目前已证明，小鼠、兔、羊。猪、牛等多种动物
的桑椹胚以前以及囊胚的ICM细胞具有发育的全能
性，因此桑胚胚或囊胚成为分离ES细胞的常用材料。
早期胚胎的获取及处理方法 原始生殖细胞的获取和ES细胞的分离 分化抑制物的选择, 包括：饲养层（feeder lopr）， 条件培养基（conditioned medium， CM） 和分化抑制因子（differentiation inhibitory activity， DIA） 基础培养基的选择 添加物的选用
（四）.胚胎干细胞的建系
1.ES细胞的分离
从着床前（孕3-5天）的胚泡中分离内细胞群(ICM) 免疫学方法: 利用干细胞表面特殊标记分子分离 免疫外科学：利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体补体 结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM。
组织培养法：利用滋养层和ICM发育情况不同进行分离 显微外科学：显微操作系统直接分离
（二）胚胎干细胞的研究概况 1.1981年Evans埃文斯和Kaufrnan考夫曼及Martin马丁首次
由小鼠中分离得到鼠的胚胎干细胞。
至今已分离得到的胚胎干细胞物种有： 金黄地鼠（1988）、貂（1993）、猪（1994，1997）、鸡 （1996）、恒河猴（1995）、绒猴（1996）。
• James A. Thomson詹姆斯· a· 汤姆森在 Wisconsin 威斯康星 州大学领导一个研究小组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。 他们使用的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段， 提取内细胞团，建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面标 志 和 酶 活 性 ， 证 实 它 们 就 是 胚 胎 干 细 胞 。 (Science, 1998 (l282):1145-1147)
• 不管哪一个来源，提取ES必定会损毁胚胎。 于是，胚胎是不是生命，是不是人，研究 ES是不是“毁灭生命”、“杀人”，很自 然地成为争论的焦点。
新 进 展
※ 1999年12月，美国《科学》杂志公布了当年世界科 学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗 资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。
早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗
原（SSEA－1）。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、
EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA－1(3)
的表达。小鼠SSEA－1的表达自8一细胞期开始，直 到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈强阳 性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性， 少部分为阴性。因此，SSEA也常作为ES细胞鉴定的 一个标志。
*用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导，90％以上
的ES细胞分化为神经胶质细胞，
*聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律性
收缩的心肌细胞。
*将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，
其细胞组成可代表3个胚层细胞。
*用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可 发育重构胚和动物个体。
4.碱性磷酸酶的表达
4）. ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生
长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界
限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的 扁平状上皮细胞。 5）. ES细胞增殖迅速，18—24 h分裂增殖 1次。 6）. ES还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻 存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其 原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的