070第七章 干细胞与组织工程

• John D. Gearhart在 Johns Hopkins约翰霍普金斯大学领导 另一个研究小组也从人胚胎组织中建立了干细胞株。他们的 方法是：从受精后 5－ 9周人工流产的胚胎中提取原始生殖细 胞( primordial germ cell )。由此培养的细胞株，证实具有多 能干细胞的特征。(PNAS, 1998 (l95):13726-13731)
（一）干细胞有几个主要特征
干细胞本身不是终末分化细胞；
干细胞能无限增殖分裂；
干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内
处于静止状态；
干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运—
—保持为干细胞 或分化为特定细胞。
一方面进行自我更 新（self-renew)，产 生与亲本完全相同的 子代细胞，以保持干 细胞数量的恒定；
2. ES细胞的分离培养
目前已证明，小鼠、兔、羊。猪、牛等多种动物
的桑椹胚以前以及囊胚的ICM细胞具有发育的全能
性，因此桑胚胚或囊胚成为分离ES细胞的常用材料。
早期胚胎的获取及处理方法 原始生殖细胞的获取和ES细胞的分离 分化抑制物的选择, 包括：饲养层（feeder lopr）， 条件培养基（conditioned medium， CM） 和分化抑制因子（differentiation inhibitory activity， DIA） 基础培养基的选择 添加物的选用
4）. ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生
长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界
限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的 扁平状上皮细胞。 5）. ES细胞增殖迅速，18—24 h分裂增殖 1次。 6）. ES还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻 存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其 原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的
※ 2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们 首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎 干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。 ※ 目前已有报导ES细胞能在适当条件下分化为心肌细 胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。
（三）ES细胞生物学特性
1.细胞形态结构及核型
2.细胞的高度分化潜能 3.碱性磷酸酶的表达 4.胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达 5.细胞分化的调控
切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层
干细胞、神经元干细胞、肌肉中的成肌细胞等。
2.根据干细胞所处的发育阶段来分：
胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)
成体干细胞(somatic stem cell)
3.根据来源来分: 来源于胚胎--- 胚胎干细胞 ESC （Embryonic Stem Cell ） 胚胎性生殖细胞 EGC （Embryonic Germ Cell ） 来源于成体--- 成体组织来源的干细胞 ASC （Adult-derived Stem Cell ）
另一方面在一定条 件下可以进入分化程 序，通过不对称分裂 产生分化的子代细胞， 最终形成功能特异的 组织类型，在组织修 复和新陈代谢中起重 要作用。
（二）分类 1.按分化潜能大小来分类:
① 全能干细胞:有形成完整个体的分化潜能。如受
精卵，桑葚胚。
② 三胚层多能干细胞（万能干细胞 ）：失去发育
成完整个体的能力，但仍具有分化成个体中包括
从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC
• 小鼠早期胚胎的体外培养---饲养层： 饲养层细胞的作用：培养的鼠胚成纤维细胞经丝裂霉素C 处理后，可用作饲养层细胞。饲养层细胞经丝裂霉素C处理 后，虽然失去分裂能力，但仍然保持生存活性，并为胚胎干 细胞的存活、增殖和未分化状态的维持提供一些必需因子， 还可去除培养环境中的毒素和代谢抑制因子。 饲养层细胞的处理方法如下：取P12-16的孕鼠，剖腹取 胚胎，去除头、四肢、内脏后，Hanks液反复冲洗，剪碎鼠 胚组织，胰酶消化成单细胞悬液，接种，即为原代培养鼠胚 成纤维细胞。将原培养液弃去，加入含10μg/ml丝裂霉素C 的培养液作用2-4h，然后胰酶消化制成单细胞悬液，接种在 四孔板中备用。
许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和 囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的EC 细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的 EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的 桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作
为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。
5.胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达
EC细胞：来自于自发或诱发的生殖细胞瘤或畸胎瘤
中的多能干细胞。
二、胚胎干细胞（Embryonic Stem cell, ES细胞） （一）定义：当受精卵分裂发
育成囊胚时，内层细胞团的细
胞即为胚胎干细胞。 ES细胞的研究可追溯到上世纪 五十年代，由于畸胎瘤干细胞 （EC细胞）的发现开始了ES 细胞的生物学研究历程。
胚胎干细胞和成体干细胞的比较
定义:当受精卵分裂发育 成囊胚时，内细胞团的 细胞就是胚胎干细胞。
成体干细胞位于成 体的组织和器官
特点：具有很强的分化能 力，可以无限增加，并且 可以分化成全身２００多 种细胞类型。
总结：它能长成动物的 任何组织和器官
特点：在特定条件下，成 体干细胞或者产生新的干 细胞，或者按一定的程序 进行分化，形成新的功能 细胞，从而使组织和器官 保持生长和衰退的动态平 衡。
• 不管哪一个来源，提取ES必定会损毁胚胎。 于是，胚胎是不是生命，是不是人，研究 ES是不是“毁灭生命”、“杀人”，很自 然地成为争论的焦点。
新 进 展
※ 1999年12月，美国《科学》杂志公布了当年世界科 学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗 资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。
*用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导，90％以上
的ES细胞分化为神经胶质细胞，
*聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律性
收缩的心肌细胞。
*将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，
其细胞组成可代表3个胚层细胞。
*用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可 发育重构胚和动物个体。
4.碱性磷酸酶的表达
进展极为迅速，已经成为干细胞应用的主要方
向。
一、干细胞的概念
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能
的细胞。并能产生至少一种高度分化子代
细胞的细胞。 在干细胞的发育过程中，还有一种中间 类型的细胞称为祖细胞，祖细胞也具有有 限的增殖和分化能力，与干细胞不同的是，
祖细胞没有自我更新能力，它在经过几轮
细胞分裂周期后产生的两个子代细胞均为 终末分化细胞。
第七章 干细胞与组织工程
干细胞研究成为继人类基因组大规模测序
之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生
命学科研究领域，1999年干细胞研究被美国
《科学》杂志评为1999年度世界十大科学之冠，
2000年干细胞研究再次被《科学》杂志评为该 年度世界十大科学成就之一。 组织工程是以干细胞研究为基础发展起来， 它有望解决临床上急需的人工组织与器官问题，
早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗
原（SSEA－1）。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、
EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA－1(3)
的表达。小鼠SSEA－1的表达自8一细胞期开始，直 到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈强阳 性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性， 少部分为阴性。因此，SSEA也常作为ES细胞鉴定的 一个标志。
（二）胚胎干细胞的研究概况 1.1981年Evans埃文斯和Kaufrnan考夫曼及Martin马丁首次
由小鼠中分离得到鼠的胚胎干细胞。
至今已分离得到的胚胎干细胞物种有： 金黄地鼠（1988）、貂（1993）、猪（1994，1997）、鸡 （1996）、恒河猴（1995）、绒猴（1996）。
• James A. Thomson詹姆斯· a· 汤姆森在 Wisconsin 威斯康星 州大学领导一个研究小组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。 他们使用的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段， 提取内细胞团，建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面标 志 和 酶 活 性 ， 证 实 它 们 就 是 胚 胎 干 细 胞 。 (Science, 1998 (l282):1145-1147)
3.ES细胞的高度分化潜能
ES细胞的全能性是其区别于成 纤维细胞等体细胞的
显著特点
1）. ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持
其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。
2）. 在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮
培养中： “简单类胚体” “囊状胚体” 细胞分
化物。
3）. ES细胞可进行诱导分化
（四）.胚胎干细胞的建系
1.ES细胞的分离
从着床前（孕3-5天）的胚泡中分离内细胞群(ICM) 免疫学方法: 利用干细胞表面特殊标记分子分离 免疫外科学：利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体补体 结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM。
组织培养法：利用滋养层和ICM发育情况不同进行分离 显微外科学：显微操作系统直接分离
1.ES细胞形态结构及核型
1）. 各种动物的ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的
形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。
2）. ES细胞与卵圆柱期（egg cylinder stage）胚 胎外胚层和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似。 3）. 细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着 大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性质。 正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分 化形成动物个体。
百度文库生殖细胞在内的各种细胞的潜能，有这种潜能的
细胞称为三胚层多能干细胞。如内细胞团。
③ 单胚层多能干细胞（多能干细胞 ）：有分化
出多种组 织细胞的潜能，失去了发育成完整个体
的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓多能造
血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血
细胞。间充质干细胞也属于单胚层多能干细胞
④ 单能干细胞:这类干细胞只能向一种类型或密
• Scientists James Thomson and John Gearhart joined patient advocate Christopher Reeve 克里斯托弗· 里夫to discuss stem cell research
2007年欧盟经过长时间的辩论后决定拨款资助人类干 细胞研究。而此前，美国总统布什首次动用否决权，驳 回胚胎干细胞研究的法案，引起轩然大波。这个事件在 科学、 伦理和政治的揪扯下，愈演愈烈，最后终于引 发了一场激烈的“文化战争”。
特征。
2.ES细胞的全能性表现
①形成畸胎瘤。将ES细胞注入同源动物皮下可形成 畸胎瘤，包括三个胚层细胞； ②形成类胚体。培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生 长，或控制增殖细胞数目。能够使之生成类胚体，它 是一个与畸胎瘤相似的多种系混杂的集合体、具有三 个胚层组织；
2.ES细胞的全能性表现
③直系分化。通过控制ES细胞生长环境，或遗传操纵 特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞， 例如将神经决定基因NeuroD2和NeuroD3转人ES细胞， 可使之分化为神经细胞； ④形成嵌合体。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后， 可以形成嵌合体（chimera），ES细胞可以参与嵌合体各 个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为 ES细胞的标准。
4.根据干细胞组织发生的名称来分: 造血干细胞、骨髓间质干细胞、肌肉干细胞、成骨干细胞、视网 膜干细胞、胰腺干细胞
5.根据干细胞组织发生部位分类：
ES细胞：存在于早期胚胎内细胞团的全能干细胞； AS细胞：来自成体组织的各种多能干细胞；
EG细胞：来自于早期胚胎生殖嵴原始生殖细胞的多
能干细胞；
霍金批评欧美人士试图禁止人类胚胎 干细胞研究
中国人对胚胎干细胞研究的看法 比较一致
• 大多数中国人能够接受此项研究,主要是 受儒家思想的影响。儒家很早以前就已 经指出，人生出来的时候，人才开始。 按照大多数中国人的看法，胚胎还不是 人，不涉及人权问题。
伦理冲突
• ES研究也引发了当前最为激烈而敏感的伦 理之争。主要围绕如何看待胚胎。ES主要 有三个来: • （1）（自然和人工）流产的胚胎； • （2）辅助生殖剩余的胚胎； • （3）通过体细胞核转移术得到的胚胎。