重组DNA药物
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＃ 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用
＃ 应首先选择能除去含量最多杂质的方法
＃ 应尽量选择高效的分离方法
＃ 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最 后阶段
◎合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Sepharose。 理想的分离纯化介质应具有下列性质： ＃ 对目标蛋白具有较高的分辨效率 ＃ 对目标蛋白不会造成变性 ＃ 化学性能和机械性能稳定，重复性好 ＃ 价格低廉
二、基本过程
上游阶段： 实验室 获得目的基因、酶切和酶连、插入适当载体、转入 宿主细胞、复制、目的基因分析确证、表达、筛选 合适表达系统等
下游阶段：将实验室成果产业化 发酵参数确定、新型生物反应器研制、高效分离介质 及装置开发、生物传感器设计制造、电子计算机优 化控制、产品质量控制
• 注意：上游DNA重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备 为指导思想；而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现和保 证，这是基因工程产业化的基本原则。
靶DNA的扩增
5’
3’
(a)
引物2 5’
(b)
3’
3’ 5’ 引物1
5’ (c) 引物2互补链
3’
3’ 引物1互补链
5’
(d)
3’
5’
新引物
5’
3’
(e) 不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’
3’
(g)
3’
引物1互补链
5’
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
PCR用于基因突变 靶DNA片段 5’ 3’
如： MTT法: MTT 琥珀酸fo脱r氢m酶azan (蓝紫色)
干扰素类蛋白：可用细胞毒抑制试验来测定干扰 素的体外活性。
五、重要的重组DNA药物
（一）利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽
代表产品：重组人胰岛素、重组人生长激素、重组人干扰素、 重组人白细胞介素、重组人集落刺激因子、重组抗体及其片 断等。
3）、构建工程菌 目的基因与载体DNA的连接 • 重组DNA向宿主细胞内转移 • 筛选与鉴定带有目的基因的阳性克隆
• 影响目的基因表达的因素
三、重组药物的分离纯化
A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 ◎ 针对不用的产物表达形式采取不同的策略 ◎针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 ◎多种分离纯化技术的联合运用 ◎合适分离纯化介质的选择 ◎分离纯化过程的规模化
◎针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
等电点处于极端区域（大于8或小于5）的重组蛋白应首选 离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；
重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和 层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离 常数应在合适的范围内（10－8～10－4mol/L）;
大肠杆菌：生长快；遗传研究深入；产品多为 胞内（包含体）或周质中；不能糖基化修饰。 需注意内毒素污染。
枯草芽孢杆菌： 分泌力强，不形成包含体；不 修饰；胞外酶可能会降解产物
链霉菌：分泌能力强；不致病，安全；有糖基 化能力。
真核
酵母：研究基因表达调控最有效的单细胞真核 微生物；基因组小，仅为大肠杆菌4倍；传代 时间短；无毒；有分泌功能和修饰功能；已用 于干扰素、乙肝表面抗原等重组DNA药物的 生产。
• (c) AB链同时表达法
3）生长激素
1944年，李卓浩等从牛垂体中分离出牛生长激素
1956年，从人垂体中分离出hGH
1969年，hGH序列报道
临床上用于垂体性侏儒症。1956~1985年，只 能从人尸体垂体中分离纯化。但至1985年，共 发现50多例克-雅氏症，5人病亡，研究结果证 实由垂体来源的生长激素污染有朊病毒。
2）、纯度分析：SDS-PAGE, CE, IEF, HPLC 3）、生物活性测定 4）、残余杂质检测 宿主细胞蛋白含量、宿主细胞DNA、残余抗生素等 5）、安全性检测 无菌实验、热原实验、毒性实验、免疫原性检查
A 体内生物学活性测定方法 生物学模型 生长激素
B 体外生物学活性测定方法
大鼠 脑垂体
1、水解→ 与载体连接→转链合成 → cDNA克隆→将重组体导入宿主细胞→ cDNA鉴定→目的cDNA克隆的分离和鉴 定
3）、合成法 4）、PCR法
保证编码DNA序列正确 要了解以下特性：
A、目的基因来源、克隆过程、序列 B、表达载体名称、结构、遗传特性及酶切图谱、抗 生素标记等
C、宿主名称、来源、传代历史、检定结果及生物学 特征
D、载体引入宿主方式、及载体再宿主中状态 E、插入基因于表达载体两侧控制区核酸序列 F、启动和控制克隆基因表达的方法及水平
1986年，FDA批准Roch公司的重组IFNα2a和Schering公司的重组IFN-α2b，重组 IFN-β、γ分别在1990年和1993年上市。
我国中国预防医学科学院病毒学研究所侯 云德等发现中国人受病毒攻击产生的干扰 素主要为IFN-α1b型，1992年我国第一个 基因工程药物IFN-α1b获得国家一类新药 证书。
引物A
引物A’
3’
5’ 5’
引物5’B 3’
PCR PCR
3’ 3’ 5’ 5’
3’ 5’
3’
PCR
5引’ 物C
PCR
3’
混合,变性,退火
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
5’
5’
3’
+
3’
3’
5’
DNA聚合酶
3’ 5’
用引物B和C作PCR
3’ 5’
PCR定点诱变
2、基因表达
1）、选择宿主细胞 原核
◎针对不同的产物表达形式采取不同的策略
采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度 低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行 浓缩处理；
采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包 涵体；
采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性 的，拟首先选用亲和层析进行纯化
表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应 用低浓度的溶菌酶处理，然有再用渗透压休克法释放 重组蛋白。
第三节 重组DNA药物
一、重组DNA技术与基因工程的基本定义
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载 体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受 体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产 物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技 术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本 元件。
• 效率高、产量大
• 周期短、成本低
• 工艺稳定、质量可控
• 缺点是易形成包含体
1）、干扰素（IFN-α、β、γ） 1957年Isaccs等发现病毒干扰现象，即病毒感 染的细胞能产生一种因子，作用于其他细胞干 扰病毒复制，因而命名为干扰素。
根据产生干扰素细胞的来源、理化性质和生物 活性等差异，可分为α、β、γ等3种，其中 IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。
疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；
凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；
径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的 一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越 性。
◎多种分离纯化技术的联合运用
在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种 技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列 原则：
• (a) AB链分别表达法 体外折叠成功率低，通 常只有10～20％
• (b) 人胰岛素原表达法 由于C肽的存在，胰岛 素原在复性条件下能形成天然的空间构象， 为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件， 使得体外折叠率高达80％以上 目前Ely Lily 用这种工艺路线年产几十吨的重组人胰岛素， 其经济效益相当可观。
• 人生长激素的结构与性质
• 重组人生长激素工程菌的构建
（二）利用重组酵母生产医用蛋白
优势： • 1.最简单的真核生物，基因表达调控机理较清楚，
并且遗传操作相对较为简单； • 2.具有原核无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰
加工系统 • 3.不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母
小不同的外源基因 d、容易控制，在细胞内稳定性高，安全可靠。
如大肠杆菌的pBV220系统，为温度诱导表 达载体，已成功用于IL-2，IL-3，IFN等
pET系统，最有潜力的系统，可用乳糖代替 IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖），产物可 达细胞总蛋白20~30%，表达量可达总蛋白 50%。
pET载体
在大肠杆菌内形成大 量无活性包含体。
• 因无法有效的解决复
性问题，在美国每年 造成的经济损失就达 几十亿美元
包含体电镜图
蛋白质复性概念
将蛋白质从结构不规则、无 活性的状态，恢复到有唯一 立体结构、有生物活性的 状态的过程称为蛋白质复性。
2）、表达载体 要求： a、能独立复制 b、有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记 c、具有有效运载外源基因的能力，能携带大
丝状真菌：有很强的蛋白质分泌能力，能正确 加工，糖基化方式与高等生物相似，有成熟发 酵和后处理工艺
哺乳动物细胞：类似天然产物，但培养条件苛 刻
大肠杆菌与真核细胞表达系统比较
大肠杆菌:
发酵 包含体 复性 纯化 目的蛋白
真核细胞:
发酵 上清液 纯化 目的蛋白
大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体
• 高效表达的目的蛋白
2）胰岛素(Insulin, Ins) 1921年，Banting FG等从胰脏中分离 1955年，Sanger F测序 1965年，我国完成结晶牛胰岛素全合成 1979年，Rutter W等克隆了胰岛素基因 1982年，第一个重组人胰岛素批准上市
• 胰岛素的结构及生物合成 • 胰岛素原与胰岛素 • 人胰岛素的生产方法 • 产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略
• 种子克隆纯而且稳定，在培养工程 中工程菌不应出现无突变或质粒丢 失的现象
• 种子批系统
• 工作细胞库
• 尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂 蛋白等杂质，并避免在纯化过程带入有 害物质
纯化每一步应测定纯度、计算提纯倍数、 收率等等
1）、产品的鉴别
氨基酸组成分析： 肽图分析： N末端和C末端氨基酸测序： 蛋白质二硫键的分析： 重组蛋白相对分子量： 等电点的测定：
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应 用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与 构建（即重组DNA技术）；而下游则涉及到基 因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分 离纯化过程。
优点：
1、可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白 和多肽；去除内源性物质的不足之处
1985年，垂体来源的被禁用，同年，rhGH上市。
• 1985年，美国FDA批准由大肠杆菌发酵 生产的重组人生长激素上市，随后各种 途径生产的重组人生长激素迅速充斥市 场。1997年，仅美国Genentech和Ely Lily两家公司的重组人生长激素年产量已 达20kg，年销售额超过3.5亿美元。
欧洲
治疗肿瘤
1989
欧洲
治疗贫血
治疗中性白细胞 减少症
1988 1991
欧洲 美国
治疗血栓症
1987
美国
DNA重组药物制造的主要步骤
获得目的基因
DNA的体外重组（切与连）
载体的选择 受体细胞的选择
重组DNA分子转化 （转）
转化子的筛选与鉴定（选） 外源基因的大规模表达和分离纯化
产品的检验和制剂制备
◎分离纯化过程的规模化
蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大 规模产业化过程未必合适，如：
＃ 实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破 细胞壁）
＃ 实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超 速离心）
因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于 生产工艺。
四、质量控制
1、原材料质量控制 2、培养过程质量控制 3、纯化工艺质量控制 4、目标产品质量控制
2、提供足够数量的生理活性物质，以进行生 理生化、结构的研究
3、利用基因工程技术可发现、挖掘更多内源 性生理活性物质
4、获得新型化合物
主要基因工程产品的研制、开发、上市时间
产品
首次克隆 表达时间
人生长激素释放抑制素（SRM) 1977
人胰岛素
1978
人生长激素（HGH) 人α干扰素（ α－IFN)
1979 1980
乙肝疫苗
1983
人白细胞介素－2
1984
人促红细胞生成素
人粒细胞集落刺激因子
人组织纤溶酶原激活剂 （t-PA)
国家
日本 美国 美国 美国 美国 日本
用途
首次进入 市场时间 国家/地区
治疗巨人症 治疗糖尿病
1982
欧洲治疗侏儒症19 Nhomakorabea5治疗病毒感染症 1985
美国 美国
预防乙型肝炎 1986
＃ 应首先选择能除去含量最多杂质的方法
＃ 应尽量选择高效的分离方法
＃ 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最 后阶段
◎合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Sepharose。 理想的分离纯化介质应具有下列性质： ＃ 对目标蛋白具有较高的分辨效率 ＃ 对目标蛋白不会造成变性 ＃ 化学性能和机械性能稳定，重复性好 ＃ 价格低廉
二、基本过程
上游阶段： 实验室 获得目的基因、酶切和酶连、插入适当载体、转入 宿主细胞、复制、目的基因分析确证、表达、筛选 合适表达系统等
下游阶段：将实验室成果产业化 发酵参数确定、新型生物反应器研制、高效分离介质 及装置开发、生物传感器设计制造、电子计算机优 化控制、产品质量控制
• 注意：上游DNA重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备 为指导思想；而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现和保 证，这是基因工程产业化的基本原则。
靶DNA的扩增
5’
3’
(a)
引物2 5’
(b)
3’
3’ 5’ 引物1
5’ (c) 引物2互补链
3’
3’ 引物1互补链
5’
(d)
3’
5’
新引物
5’
3’
(e) 不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’
3’
(g)
3’
引物1互补链
5’
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
PCR用于基因突变 靶DNA片段 5’ 3’
如： MTT法: MTT 琥珀酸fo脱r氢m酶azan (蓝紫色)
干扰素类蛋白：可用细胞毒抑制试验来测定干扰 素的体外活性。
五、重要的重组DNA药物
（一）利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽
代表产品：重组人胰岛素、重组人生长激素、重组人干扰素、 重组人白细胞介素、重组人集落刺激因子、重组抗体及其片 断等。
3）、构建工程菌 目的基因与载体DNA的连接 • 重组DNA向宿主细胞内转移 • 筛选与鉴定带有目的基因的阳性克隆
• 影响目的基因表达的因素
三、重组药物的分离纯化
A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 ◎ 针对不用的产物表达形式采取不同的策略 ◎针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 ◎多种分离纯化技术的联合运用 ◎合适分离纯化介质的选择 ◎分离纯化过程的规模化
◎针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
等电点处于极端区域（大于8或小于5）的重组蛋白应首选 离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；
重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和 层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离 常数应在合适的范围内（10－8～10－4mol/L）;
大肠杆菌：生长快；遗传研究深入；产品多为 胞内（包含体）或周质中；不能糖基化修饰。 需注意内毒素污染。
枯草芽孢杆菌： 分泌力强，不形成包含体；不 修饰；胞外酶可能会降解产物
链霉菌：分泌能力强；不致病，安全；有糖基 化能力。
真核
酵母：研究基因表达调控最有效的单细胞真核 微生物；基因组小，仅为大肠杆菌4倍；传代 时间短；无毒；有分泌功能和修饰功能；已用 于干扰素、乙肝表面抗原等重组DNA药物的 生产。
• (c) AB链同时表达法
3）生长激素
1944年，李卓浩等从牛垂体中分离出牛生长激素
1956年，从人垂体中分离出hGH
1969年，hGH序列报道
临床上用于垂体性侏儒症。1956~1985年，只 能从人尸体垂体中分离纯化。但至1985年，共 发现50多例克-雅氏症，5人病亡，研究结果证 实由垂体来源的生长激素污染有朊病毒。
2）、纯度分析：SDS-PAGE, CE, IEF, HPLC 3）、生物活性测定 4）、残余杂质检测 宿主细胞蛋白含量、宿主细胞DNA、残余抗生素等 5）、安全性检测 无菌实验、热原实验、毒性实验、免疫原性检查
A 体内生物学活性测定方法 生物学模型 生长激素
B 体外生物学活性测定方法
大鼠 脑垂体
1、水解→ 与载体连接→转链合成 → cDNA克隆→将重组体导入宿主细胞→ cDNA鉴定→目的cDNA克隆的分离和鉴 定
3）、合成法 4）、PCR法
保证编码DNA序列正确 要了解以下特性：
A、目的基因来源、克隆过程、序列 B、表达载体名称、结构、遗传特性及酶切图谱、抗 生素标记等
C、宿主名称、来源、传代历史、检定结果及生物学 特征
D、载体引入宿主方式、及载体再宿主中状态 E、插入基因于表达载体两侧控制区核酸序列 F、启动和控制克隆基因表达的方法及水平
1986年，FDA批准Roch公司的重组IFNα2a和Schering公司的重组IFN-α2b，重组 IFN-β、γ分别在1990年和1993年上市。
我国中国预防医学科学院病毒学研究所侯 云德等发现中国人受病毒攻击产生的干扰 素主要为IFN-α1b型，1992年我国第一个 基因工程药物IFN-α1b获得国家一类新药 证书。
引物A
引物A’
3’
5’ 5’
引物5’B 3’
PCR PCR
3’ 3’ 5’ 5’
3’ 5’
3’
PCR
5引’ 物C
PCR
3’
混合,变性,退火
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
5’
5’
3’
+
3’
3’
5’
DNA聚合酶
3’ 5’
用引物B和C作PCR
3’ 5’
PCR定点诱变
2、基因表达
1）、选择宿主细胞 原核
◎针对不同的产物表达形式采取不同的策略
采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度 低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行 浓缩处理；
采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包 涵体；
采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性 的，拟首先选用亲和层析进行纯化
表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应 用低浓度的溶菌酶处理，然有再用渗透压休克法释放 重组蛋白。
第三节 重组DNA药物
一、重组DNA技术与基因工程的基本定义
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载 体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受 体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产 物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技 术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本 元件。
• 效率高、产量大
• 周期短、成本低
• 工艺稳定、质量可控
• 缺点是易形成包含体
1）、干扰素（IFN-α、β、γ） 1957年Isaccs等发现病毒干扰现象，即病毒感 染的细胞能产生一种因子，作用于其他细胞干 扰病毒复制，因而命名为干扰素。
根据产生干扰素细胞的来源、理化性质和生物 活性等差异，可分为α、β、γ等3种，其中 IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。
疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；
凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；
径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的 一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越 性。
◎多种分离纯化技术的联合运用
在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种 技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列 原则：
• (a) AB链分别表达法 体外折叠成功率低，通 常只有10～20％
• (b) 人胰岛素原表达法 由于C肽的存在，胰岛 素原在复性条件下能形成天然的空间构象， 为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件， 使得体外折叠率高达80％以上 目前Ely Lily 用这种工艺路线年产几十吨的重组人胰岛素， 其经济效益相当可观。
• 人生长激素的结构与性质
• 重组人生长激素工程菌的构建
（二）利用重组酵母生产医用蛋白
优势： • 1.最简单的真核生物，基因表达调控机理较清楚，
并且遗传操作相对较为简单； • 2.具有原核无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰
加工系统 • 3.不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母
小不同的外源基因 d、容易控制，在细胞内稳定性高，安全可靠。
如大肠杆菌的pBV220系统，为温度诱导表 达载体，已成功用于IL-2，IL-3，IFN等
pET系统，最有潜力的系统，可用乳糖代替 IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖），产物可 达细胞总蛋白20~30%，表达量可达总蛋白 50%。
pET载体
在大肠杆菌内形成大 量无活性包含体。
• 因无法有效的解决复
性问题，在美国每年 造成的经济损失就达 几十亿美元
包含体电镜图
蛋白质复性概念
将蛋白质从结构不规则、无 活性的状态，恢复到有唯一 立体结构、有生物活性的 状态的过程称为蛋白质复性。
2）、表达载体 要求： a、能独立复制 b、有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记 c、具有有效运载外源基因的能力，能携带大
丝状真菌：有很强的蛋白质分泌能力，能正确 加工，糖基化方式与高等生物相似，有成熟发 酵和后处理工艺
哺乳动物细胞：类似天然产物，但培养条件苛 刻
大肠杆菌与真核细胞表达系统比较
大肠杆菌:
发酵 包含体 复性 纯化 目的蛋白
真核细胞:
发酵 上清液 纯化 目的蛋白
大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体
• 高效表达的目的蛋白
2）胰岛素(Insulin, Ins) 1921年，Banting FG等从胰脏中分离 1955年，Sanger F测序 1965年，我国完成结晶牛胰岛素全合成 1979年，Rutter W等克隆了胰岛素基因 1982年，第一个重组人胰岛素批准上市
• 胰岛素的结构及生物合成 • 胰岛素原与胰岛素 • 人胰岛素的生产方法 • 产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略
• 种子克隆纯而且稳定，在培养工程 中工程菌不应出现无突变或质粒丢 失的现象
• 种子批系统
• 工作细胞库
• 尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂 蛋白等杂质，并避免在纯化过程带入有 害物质
纯化每一步应测定纯度、计算提纯倍数、 收率等等
1）、产品的鉴别
氨基酸组成分析： 肽图分析： N末端和C末端氨基酸测序： 蛋白质二硫键的分析： 重组蛋白相对分子量： 等电点的测定：
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应 用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与 构建（即重组DNA技术）；而下游则涉及到基 因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分 离纯化过程。
优点：
1、可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白 和多肽；去除内源性物质的不足之处
1985年，垂体来源的被禁用，同年，rhGH上市。
• 1985年，美国FDA批准由大肠杆菌发酵 生产的重组人生长激素上市，随后各种 途径生产的重组人生长激素迅速充斥市 场。1997年，仅美国Genentech和Ely Lily两家公司的重组人生长激素年产量已 达20kg，年销售额超过3.5亿美元。
欧洲
治疗肿瘤
1989
欧洲
治疗贫血
治疗中性白细胞 减少症
1988 1991
欧洲 美国
治疗血栓症
1987
美国
DNA重组药物制造的主要步骤
获得目的基因
DNA的体外重组（切与连）
载体的选择 受体细胞的选择
重组DNA分子转化 （转）
转化子的筛选与鉴定（选） 外源基因的大规模表达和分离纯化
产品的检验和制剂制备
◎分离纯化过程的规模化
蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大 规模产业化过程未必合适，如：
＃ 实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破 细胞壁）
＃ 实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超 速离心）
因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于 生产工艺。
四、质量控制
1、原材料质量控制 2、培养过程质量控制 3、纯化工艺质量控制 4、目标产品质量控制
2、提供足够数量的生理活性物质，以进行生 理生化、结构的研究
3、利用基因工程技术可发现、挖掘更多内源 性生理活性物质
4、获得新型化合物
主要基因工程产品的研制、开发、上市时间
产品
首次克隆 表达时间
人生长激素释放抑制素（SRM) 1977
人胰岛素
1978
人生长激素（HGH) 人α干扰素（ α－IFN)
1979 1980
乙肝疫苗
1983
人白细胞介素－2
1984
人促红细胞生成素
人粒细胞集落刺激因子
人组织纤溶酶原激活剂 （t-PA)
国家
日本 美国 美国 美国 美国 日本
用途
首次进入 市场时间 国家/地区
治疗巨人症 治疗糖尿病
1982
欧洲治疗侏儒症19 Nhomakorabea5治疗病毒感染症 1985
美国 美国
预防乙型肝炎 1986