仙人掌对体外培养成纤维细胞生长增殖的影响(精)

仙人掌对体外培养成纤维细胞生长增殖的影响

作者：金照，金可可，陈雷，刘长宝

【摘要】目的：观察仙人掌对体外培养成纤维细胞增殖的影响及其量-效关系。方法：以小鼠成纤维细胞株(NIH3T3)为研究对象，采用四氮唑盐(MTT) 比色法测定仙人掌对成纤维细胞增生的影响(以OD值反映细胞活性)，采用免疫细胞化学染色法检测成纤维细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果：在一定浓度范围内(0.0625～0.5 mg/mL)，仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞生长增殖，同时促进PCNA蛋白的表达，并随着仙人掌浓度的增加，成纤维细胞数量和PCNA蛋白的表达均不断增加，在0.5 mg/mL浓度时达到高峰，呈现明显的剂量-效应关系(r分别为0.761，0.783;P均<0.01)。结论：在一定浓度范围内，仙人掌具有促进体外培养成纤维细胞增殖的作用，并表现为明显的量-效关系。

【关键词】仙人掌;成纤维细胞;增殖

Abstract: Objective: To explore the effects of Opuntia on fibroblast proliferation in vitro and its concentration-effect relationship. Methods: The effects of Opuntia on proliferation of fibroblast were measured with MTT colorimetric assay，and PCNA productions were examined with immunocytechemistry. Results: Opuntia could provoke fibroblast proliferation and increase PCNA protein expression in concentration range 0.0625～0.5 mg/mL. Furthermore，the effects exhibited a significant concentration-dependent relationship (r =0.761，0.783 respectively，P <0.01). Conclusion: Opuntia can provoke fibroblast proliferation within a certain concentration range， which exhibits a significant concentration-effect relationship.

Key words: Opuntia;fibroblast;proliferation

仙人掌(Opuntia)，又名神仙掌、老鸦舌、观音掌等，已经被用来治疗糖尿病、溃疡等症[1-2]。仙人掌治疗胃溃疡的机制可能与成纤维细胞的增殖有关[3]。近几年来，虽然仙人掌的药理作用已成为医学热门研究方向，但有关仙人掌对体外培养的成纤维细胞增殖的影响未见报道。本研究以体外培养成纤维细胞为实验对象，观察仙人掌对成纤维细胞生长增殖的影响及其量-效关系。

1 材料和方法

1.1 材料小鼠成纤维细胞株(NIH3T3)购自上海肯强仪器有限公司，鼠抗人PCNA单克隆抗体及其他试剂均购自武汉博士德生物有限公司。仙人掌干粉为鲜茎片80 ℃烘干制成，由福州日冕科技开发有限公司生产提供。

1.2 方法

1.2.1 药物处理：将仙人掌粉溶于80 ℃左右蒸馏水中，制成不同浓度溶液，经1 500 r/min离心5 min，取上清液，调节pH值为7.0～7.4，高压蒸汽灭菌20 min，冰箱中(-18 ℃)保存备用。

1.2.2 采用四氮唑盐(MTT)比色法测定仙人掌对成纤维细胞增殖的影响：取NIH3T3对数生长期细胞常规消化，调整细胞为5×104个/mL，以每孔104个细胞密度接种于96孔培养板中，37 ℃、5% CO2条件下培养。细胞贴壁后随机分成6组，第1组只加入无血清DMEM 50μL作为空白对照组;2～6组加入等量的用无血清DMEM配制的仙人掌干粉液，浓度分别为：0.0625、0.125、0.25、

0.5、1 mg/mL。37 ℃ 5% CO2条件下培养48 h，吸出培养液，各孔加入20μL 的MTT液(以不含血清的DMEM高糖培养基配置，浓度为5 mg/mL)，继续培养4 h，小心吸弃培养液，加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，使结晶物充分溶解。应用酶标仪490 nm处测定各孔的吸光值(OD值)。

1.2.3 免疫细胞化学技术测定仙人掌对成纤维细胞表达增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的影响：将NIH3T3细胞接种于含玻片的12孔板中培养24 h，细胞贴壁后第1组只加无血清DMEM作为空白对照组;第2～第6组加入等量的用无血清DMEM配制的仙人掌干粉液，浓度分别

为0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL。培养48 h后撤药，加入含体积分数20%胎牛血清的DMEM液继续培养24 h，取出长有细胞的玻片固定，用鼠抗人细胞PCNA单克隆抗体作第一抗体， SABC法行免疫细胞化学染色。显微镜(×400)下计数100个细胞数，计算阳性细胞(棕黄色染色)数占细胞总数的比率。具体操作过程严格按试剂盒说明书进行。

同时设空白对照试验：用PBS代替一抗，余步骤同上。

1.3 统计学处理方法组间比较用One-Way ANOVA分析后，采用Student-Newman-Keuls检验。相关分析采用Bivariate过程的Pearson相关分析法。

2 结果

2.1 仙人掌对成纤维细胞增殖的影响在一定浓度范围内(0.0625～0.5

mg/mL)，仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞生长增殖，在0.5 mg/mL浓度时达到高峰，并随着仙人掌浓度的增加，成纤维细胞数量也不断增加，表现为明显的剂量-效应关系(r为0.761，P <0.01)。但是当仙人掌浓度达到1

mg/mL时，不影响成纤维细胞生长增殖，见表1。

2.2 免疫细胞化学技术测定仙人掌对成纤维细胞表达PCNA的影响一定浓度范围内(0.0625～0.5 mg/mL)的仙人掌能明显促进体外培养的成纤维细胞PCNA蛋白的表达，在0.5 mg/mL浓度时达到高峰，并表现为明显的剂量-效应

关系，即随着仙人掌浓度的增加，其表达量不断增加(r为0.783，P <0.01)。但是当仙人掌浓度达到1 mg/mL时，不影响PCNA蛋白的表达，见表2。