PCR检验技术

第一节 概述
⒈ PCR 循环 - Step 1 - 热变性
第一节 概述
⒉ PCR 循环- Step 2 - 引物对 （Primer Pair）退火结合到靶序列
第一节 概述
⒊ PCR 循环- Step 3 - Taq DNA 聚合酶 催化引物延伸
第一节 概述
⒋ 第一个PCR 循环结束- 产生靶序列的两个拷贝 （Copies）
第一节 概述
四 扩增HBV—C基因片断为例 简述PCR原理
HBV病毒 是带有3182个碱基的双螺旋的双链DNA 步骤 1 前处理 2 基因扩增 3 电泳 4 检测报告
第一节 概述
基因扩增
模板DNA—HBV病毒 ↓ 950C 变性：使双链打开，变成两个单链，二个单链 是实验成败的关键 ↓ 550C 退火：在合成原料d NTPs.Mg2+的作用下，模板DNA与引物 C 构成 二条杂交链,二条杂交链决定其实验的特异性 ↓ 720C延伸：在Taq酶的作用下，以引物为起点，开始DNA链延伸反应，使 链延长。形成一条新的链 对实验的特异性和产量有关！ ↓ 生成二个特异性的DNA片断，完成了第一次循环 ↓ 生成的二个特异性的DNA片断，继续进行下一次循环，经过25-30次循环， 模板DNA得到了大量的复制。HBV-C可扩增到几百万倍。
脱氧核糖 磷酸 氢键
第一节 概述
DNA的基本构成单位：
在DNA结构中，4种碱基，以A—T、G—C 进行严格配对的。 A—T、G—C排列顺序的变化是 无穷无尽的。 人体中大约有30亿（3X109）DNA的基因组。 碱基的顺序是DNA的生命。
第一节 概述
RNA与DNA的区别： ① RNA的核糖是不脱氧的五碳糖 ② RNA的4种碱基是 A.U.G.C A——腺嘌呤 U——尿嘧啶 G——鸟嘌呤 C——胞嘧啶 U在DNA中对应的碱基是T（胸腺嘧啶）
第一节 概述
RNA与DNA的区别： 核糖
脱氧核糖
第一节 概述
碱基以3个为1组（三联密码）
DNA mRNA ATG AUG AAG AAG AGT AGU ↓ GTC ↓ GUC
缬氨酸
CAT CAU
CAC CAC
TAA UAA
蛋白质 甲硫氨酸 赖氨酸 丝氨酸
组氨酸 组氨酸 无意义
ATG（AUG）：起始密码，是转译的开始 TAA（UAA）：终止密码，是使1条肽链的合成到此中止。 CAT（CAC） 简并密码，是一种氨基酸，可以有多于 CAU（CAC） 1个的三联密码，但也是特定的。
氨基酸则是由无数个基因即DNA组成的
这就是说DNA是蛋白质的生命
第一节 概述
DNA的基本构成单位： ① 脱氧核糖 ②核苷酸 ③磷酸 核苷酸有4种碱基： A——腺嘌呤 T——胸腺嘧啶 G——鸟嘌呤 C——胞嘧啶
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DNA的基本构成单位：
C-胞嘧啶 ( G) A-腺嘌呤 (T) T-胸腺嘧啶 ( A) G-鸟嘌呤 (C)
第一节 概述
DNA的结构： DNA大分子以反向互补的两条单链形成双 螺旋的立体结构。其形状多少有点象人 们常见的小食品“麻花”。
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① DNA的复制 半保留复制 DNA 的复制过程先是两个链分开，然 后两条亲代链均以各自为模板，复制另 一条互补链，之后再形成子1代的双螺旋 结构，继之再以同样的方式复制成子2代、 子3代、子4代……。 此时把这种复制方式称为半保留复制。
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理论上讲，DNA的产量是指数方式增加，即n次循环后， 扩增产物拷贝数为r=2n 但是应该指出，扩增产物的指数式增加不是无限制 进行的。在 PCR 反应后期，由于引物和底物的消耗， Taq酶活力下降等因素的影响，扩增产物的增加逐渐由 指数形式变为线性形式。所以实际上进行 30个循环后， 扩增倍数一般可达106-107。 如果想提高扩增产物的产量，可将产物 DNA 样品稀 释1000-10000倍后，作为新的模板再进行第二轮 PCR 扩增。
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基因突变：
基因突变，也就是碱基的突变。 例如。 ATG 编码是甲硫氨酸，但如果发生了基 因突变，是ATG中的T变成了A，则三联密码变 成了 AAG，在新合成的蛋白质长链上与甲硫氨 酸对应的位置上就只能是赖氨酸，而不再是甲 硫氨酸了。这就是突变的本质。有时人体就因 此发生病变。这也就是“突变”的主要实质。
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DNA与蛋白质合成的关系 用Watson和Crick的中心法则说明则是：
转录 翻译
DNA
逆转录
mRNA
蛋白质
第一节 概述
DNA与蛋白质合成的关系 先由在细胞核中的 DNA（基因）的碱基以 3个为一组（三联密码）转录成mRNA的三联密 码 mRNA 来到细胞核外的核糖体（蛋白质合 成的场所）上，且每一种三联密码指使一种特 定的氨基酸同毗邻的氨基酸连接起来，变成了 一种肽链（蛋白质）。这个过程称为转译。 如果合成的肽链很长的话，也可以形成立 体结构的蛋白质。
第一节 概述
⒌ 靶序列扩增
第一节 概述
上述的扩增是在PCR扩增仪上进行的。 然后将扩增产物经过EB电泳， 最后在紫外透射仪上进行鉴定、定量分析。
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常规PCR 反应方式 2步法 3步法 反应液成分 dNTP，引物，模板， 酶 结果检测 琼脂糖凝胶电泳。 结果性质 定性 定量PCR 2步法 3步法 dNTP，引物，模板， 酶，探针，参照。 ELISA，或实时荧光 检测。 定量，或定性
PCR
(Polymerase Chain Reaction)
检验技术
黑龙江中医药大学 临床医学院 诊断教研室 黄 萍
第一节 概述
一. 何为PCR？ PCR聚合酶链反应 英文全称 polymerase chain reaction 简称为PCR
第一节 概述
二 PCR的基本原理 PCR聚合酶链反应实际上是一种快速的特定DNA 片断在体外扩增技术。 简单的说： DNA的特性三步曲: 高温变性 低温退火 中温延伸
通过一个热循环仪（ DNA 扩增仪）将特异片断的基因 ( DNA. 又叫模板 DNA）在短时间内，经过引物 Taq 酶和三 磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）等作用后，放大到几百万倍。 最后得到能肉眼看到的DNA区带或可定量分析的DNA量。
第一节 概述
三 简单复习一下DNA的结构与复制
生命是由蛋白质合成的 蛋白质是由无数氨基酸连接成肽链而合成的