实验二细菌的芽孢染色, 鞭毛染色, 荚膜染色
细菌的特殊染色法实验报告
细菌的特殊染色法实验报告一、实验目的学习掌握芽孢、荚膜和鞭毛的染色原理和方法。
二、实验原理芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理,用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。
芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，而进入芽孢的染料则难以透出。
若再复染(蕃红液)，则菌体呈红色而芽孢呈绿色。
观察荚膜通常采用负染色法，即将菌体染色后，再使背景着色，从而把荚膜衬托出来。
观察鞭毛是采用在染色的同时将染料堆积在鞭毛上使它加粗的方法。
细菌只有在个体发育到一定的时期才具有鞭毛，一般在多次移种之后，在其旺盛生长阶段染色。
三、实验用品1、器材(1)显微镜(2)载波片(3)接种环(4)酒精灯(5)香柏油(6)二甲苯(7)无菌水(8)1%盐酸(9)电炉(10)墨汁(11)20%CuSO4(12);95%乙醇(13)擦镜纸等2、试剂和材料(1)菌种:巨大芽孢杆菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌等(2)芽孢染色用7.6%饱和孔雀绿液、0.5%蕃红液(或石炭酸复红液和吕氏美蓝液)。
(3)莢膜染色用刚果红、明胶水溶液、吕氏美蓝液等。
(4)鞭毛染色用硝酸银染色液(A、B液)或Leifson染色液(A、B、C液)。
四、实验方法与步骤1、芽孢染色:有两种常用的方法。
(1)孔雀绿染色法:取干净载片按无菌法取巨大芽孢杆菌菌体少许制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加法7.6%的孔雀绿饱和水溶液，染色10分钟后，用水冲洗，再用0.5%恭红花红液染色彩1分钟，水洗，风干后镜检。
芽孢被染成绿色，营养体呈红色。
(2)石炭酸复红染色法:在一支小试管(10X 100mm)中，滴入3--4滴蒸溜水，用接种环取巨大芽孢杆菌于水中，充分搅匀，使菌体分散，制成较浓的菌悬液。
然后滴加等体积的(3-4滴)石炭酸复红液摇匀。
将此试管放入沸水浴中煮10-15分钟,使芽孢及菌体着色。
水产微生物实验—细菌特殊构造的染色法及活细菌运动性的观察
实验六细菌特殊构造的染色法及活细菌运动性的观察一、基础知识荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。
由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。
所以通常用衬托染色法染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈。
由于荚膜含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。
实验中介绍3种荚膜染色法，其中湿墨水法较简便、并适用于各种有荚膜的细菌。
芽孢又叫内生孢子，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。
细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。
由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圆或椭圆形的圈。
为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。
芽孢染色法的基本原理是：用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进人菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。
鞭毛是细菌的运动“器官”细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的一项重要形态特征。
细菌的鞭毛很纤细，其直径通常为0.01—0.021xm，所以，除了很少数能形成鞭毛束(由许多根鞭毛构成)的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。
要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。
鞭毛染色的基本原理，是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。
鞭毛染色方法很多，本实验介绍硝酸银染色法和改良的Leifson氏染色法，前一种方法更容易掌握，但染色剂配制后保存期较短。
实验 二 细菌的芽孢染色
实验二细菌的芽孢染色, 鞭毛染色, 荚膜染色生物科学贺冰冰 040012010025 周二 9、0 节一、实验目的1 学习细菌的芽孢染色法2 学习细菌的鞭毛染色法3 学习细菌的荚膜染色法二、实验原理1 芽孢染色的原理:细菌的芽孢具有厚而致密的壁。
透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。
芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色但一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。
所有的芽孢染色法都基于同一个原则；除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。
当染芽孢时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。
然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。
2 鞭毛染色的原理:细菌的鞭毛极细，直径一般为0.01～0.02μm，只有用电子显微镜才能观察到。
但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。
鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理、让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。
常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。
3 荚膜染色的原理:荚膜是细菌分泌到菌体周围的一层黏液状物质,通常是多糖和多肽类物质. 由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。
由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定。
以免荚膜皱缩变形。
三、实验器材1菌种：培养24h的枯草杆菌（Bacillcus subtilis）、培养12-16h的变形杆菌斜面,培养3d的固氮菌。
2染色液和试剂：5％孔雀绿水溶液、番红水溶液, 鞭毛染色液A液与B液，蒸馏水，香柏油，显微镜擦拭液,绘图墨水或黑色素溶液．3器材：酒精灯、接种环、镊子、载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、显微镜等。
四、实验方法（一）芽孢染色：1涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。
实验二细菌的观察
细菌一般形态染色观察一、实验目的学习了解微生物染色的基本原理与方法学习掌握细菌的简单染色和革兰氏鉴别染色技术巩固显微镜油镜的使用方法。
二、实验原理细菌的个体极微小，无色透明，必须借助于染色法，使细菌（或背景）着色，与背景（或菌体）形成明显的对比便于在显微镜下观察细菌的形态构造。
染色方法主要有：见下图简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用染料有：碱性染料：结晶紫、碱性复红、龙胆紫、番红、中性红、孔雀绿等。
酸性染料：酸性复红、刚果红、曙红等简单染色一般常用碱性染料进行染色原因：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，带正电荷，因此碱性染料很容易与细菌结合使细菌着色细菌细胞壁含有蛋白质或多肽，也就有等电点已知细菌的等电点pH为2～5。
革兰氏阳性菌为2～3，革兰氏阴性菌为4～5。
当细菌的培养液pH值大于等电点时，细菌带有负电荷；反之，带有正电荷。
一般，细菌的培养、染色、试验过程均在偏碱性（7～7.5）、中性、偏酸性（6～7）条件下，都高于细菌的等电点，故均带有负电荷革兰氏染色革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，根据细菌对这种染色反应的不同，可分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两大类，其机理是由于细菌细胞壁的化学组成及结构不同和通透性不同的缘故。
革兰氏染色对于细菌的分类、鉴定及食品卫生检测都有重要意义。
革兰氏染色原理影响革兰氏染色结果的因素菌龄培养基pH值染色技术：涂片质量、染色时间、脱色时间、染色脱色均匀度等三、实验器材1. 器材：显微镜，擦镜纸，二甲苯，香柏油，载玻片，接种环，酒精灯,火柴，吸水纸，无菌牙签。
2. 染色液及试剂：石碳酸复红染液、碱性美蓝染液、结晶紫染色液，路戈氏碘液，95％的酒精，蕃红染色液，黑色素水溶液，蒸馏水。
3. 菌种：白葡萄球菌、大肠杆菌的新鲜斜面菌种各1支。
四、操作步骤（一）简单染色涂片火焰固定染色水洗干燥镜检（二）革兰氏染色涂片→干燥→火焰固定结晶紫染色→水洗碘液媒染95%酒精脱色→水洗蕃红复染→水洗干燥镜检（三）口腔中微生物观察负染色五、实验报告1、实验结果绘图2、思考题（1）细菌制片过程应注意哪些？（2）试分析菌龄、培养pH、染色技术对革兰氏染色结果的影响。
细菌的芽孢染色法和鞭毛染色法
细菌的芽孢染色法和鞭毛染色法本文由翼知特别奉献一、实验目的1、学习并掌握芽孢染色方法。
2、初步了解芽孢杆菌的形态特征。
3、学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征。
二、实验原理1.芽孢染色法原理芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。
芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。
2. 鞭毛染色法的原理鞭毛是细菌的运动“器官”，一般细菌的鞭毛都非常纤细，其直径为0.01-0.02μm，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。
鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的沉淀作用，使染料堆积在鞭毛上，以加粗鞭毛的直径，同时使鞭毛着色，在普通光学显微镜下能够看到。
鞭毛染色方法很多，本实验主要介绍硝酸银染色法。
三、实验器材1. 仪器：显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯等。
2. 染色液：芽孢染色液：孔雀绿水溶液，沙黄水溶液鞭毛染色液：硝酸银鞭毛染色液A液，B液3. 菌种：枯草芽孢杆菌（芽孢染色用）、变形杆菌（鞭毛染色用）四、实验内容与步骤1、细菌芽孢染色（1）将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。
（2）滴加3-5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。
（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。
加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4-5分钟。
这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6％）染10分钟。
（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。
实验二 细菌的形态观察(简单染色法和革兰氏染色法)
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→固定→干燥→水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
实验二细菌基本形态及特殊形态观察
四 实验内容及步骤
1 细菌基本形态观察 2 细菌特殊结构观察 3 细菌运动性观察悬滴片的制作。
1 细菌基本形态观察
学习油镜的正确使用方法。 用油镜观察——
大肠杆菌 枯草杆菌 金黄色葡萄球菌
菌体
2 细菌特殊结构观察
学习油镜的正确使用方法。 用油镜观察细菌特殊结构—— 芽孢
钾细菌荚膜（高倍镜） 枯草芽孢杆菌芽孢（油镜）
思考题
（1）观察细菌染色片时应如何调节光线？ （2）油镜观测时，是否可以除香柏油以外的其它液体作介质？
低，难于染色，但一旦被染
色又难于脱色。因此先用强
着色力的染料（孔雀绿）处
理，并同时加热，使菌体以
及芽孢均着色，后使菌体脱
色，而芽孢保留原色，经复
染（蕃红），菌体与芽孢分
芽
孢
菌 体
别以不同颜色显现。
菌芽 体孢
对有芽孢的菌体进行简单染 菌体 色（只用一种染料染色）。 菌体和芽孢着色情况如何？
芽孢
5 鞭毛染色 及运动观察
目镜
物镜
10 X 100X
⑵ 显微镜的分辨率
油镜比低倍镜、高倍镜观察物体更清晰。
原因： ◆ 油镜分辨率高于低倍镜、高倍镜 ◆ 油镜汇聚光线的能力大于低倍镜、高倍镜
◆ 分辨率是指显微镜能够分辨的最小距离即鉴别限度（R）
R=λ∕2NA
(λ为入射光波波长； NA为显微镜数值孔径)
NA= η.sinθ
１ 普通光学显微镜的结构
（1 ) 机械系统 包括镜座、镜臂、载物台、物镜转换器、镜筒及调节器等
（2 ) 光学系统 包括反光镜、聚光器、物镜、目镜等。
２ 普通光学显微镜的光学成象原理
（1）显微镜的放大倍数 放大倍数：目镜的放大倍数与物镜的放大倍数之乘积 。
实验报告2-细菌的荚膜染色、芽孢染色及其运动性观察实验报告
细菌的荚膜染色、芽孢染色及其运动性观察实验报告马子午生命科学学院食品科学与工程专业 14101班 02号1.引言1.1实验目的学习荚膜染色技术，观察和分辨细菌的荚膜形态，进一步理解细菌细胞的特殊结构；了解细菌芽孢染色的原理意义，掌握芽孢染色的方法。
学习水浸片的制作方法，观察细菌的运动。
1.2实验原理芽孢染色法：芽孢具有厚而致密的壁，通透性低，对各种不利因素如高温、冷冻、射线、干燥、化学药品和染料等具有很强的抵抗力。
因此，当用一般染色方法染色时，只能使菌体着色，芽孢不易着色（芽孢呈透明）或仅显很淡的颜色。
威力使芽孢着色便于观察，需采用特殊染色法——芽孢染色法。
先用一弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红在加热条件在进行长时间染色，此染料不仅可以进入菌体，也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经睡洗脱掉，而进入芽孢的染料则难以透出。
若再用复染液（如番红染液）或衬托染液（如黑色素液）处理，芽孢和菌体就呈现不同的颜色，借此将芽孢与菌体区别开。
荚膜染色法：荚膜的主要成分是多糖，多糖与染料亲和力差，不易着色，但荚膜通透性较好，某些染料可通过荚膜使菌体着色，正因如此，染色后呈浅色或无色的菌体就形成了一个明显的色差，荚膜染色常采用负染法，即将背景染成淡蓝色，此法使菌体和背景显色以衬托无色的荚膜。
细菌的运动性观察：细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的主要特征之一，因鞭毛较细，在普通光学显微镜下不易观察，但有鞭毛的细菌在液体中能借助鞭毛的旋转和摆动使菌体能定向的运动，可以借此判断细菌是否有鞭毛。
2.材料与方法2.1材料与试剂枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），孔雀绿，番红染液，无菌水，6%的葡萄糖，胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus），黑色素液，甲醇，甲基紫染液，香柏油，二甲苯。
2.2仪器与设备显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯，接种环，镊子，试管，凹玻片，擦镜纸，吸水纸。
2.3方法与步骤2.3.1细菌的芽孢染色法取一支试管，滴一滴无菌水，用接种环取2~3环枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）充分混合成菌悬液，再滴加两滴孔雀绿，沸水浴15~20分钟后用接种环取3~5环菌悬液涂抹在载玻片上，自然干燥，固定，冷却后水洗至水流无色，用吸水纸吸干后滴加番红染液复染5分钟，用吸水纸吸干多余染料，在显微镜下镜检。
细菌的特殊染色
细菌的特殊染色一、实验目的学习掌握芽孢、荚膜和鞭毛的染色原理和方法。
二、实验原理芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。
芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，而进入芽孢的染料则难以透出。
若再复染（蕃红液），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。
观察荚膜通常采用负染色法，即将菌体染色后，再使背景着色，从而把荚膜衬托出来。
观察鞭毛是采用在染色的同时将染料堆积在鞭毛上使它加粗的方法。
细菌只有在个体发育到一定的时期才具有鞭毛，一般在多次移种之后，在其旺盛生长阶段染色。
三、实验用品1、器材（1）显微镜（2）载波片（3）接种环（4）酒精灯（5）香柏油（6）二甲苯（7）无菌水（8）1%盐酸（9）电炉（10）墨汁（11）20%CuSO4 （12））95%乙醇（13）擦镜纸等2、试剂和材料（1）菌种：巨大芽孢杆菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌等（2）芽孢染色用7.6%饱和孔雀绿液、0.5%蕃红液（或石炭酸复红液和吕氏美蓝液）。
（3）荚膜染色用刚果红、明胶水溶液、吕氏美蓝液等。
（4）鞭毛染色用硝酸银染色液（A、B液）或Leifson染色液（A、B、C液）。
四、实验方法与步骤1、芽孢染色：有两种常用的方法。
（1）孔雀绿染色法：取一干净载片按无菌法取巨大芽孢杆菌菌体少许制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加法7.6%的孔雀绿饱和水溶液，染色10分钟后，用水冲洗，再用0.5%蕃红花红液染色彩1分钟，水洗，风干后镜检。
芽孢被染成绿色，营养体呈红色。
（2）石炭酸复红染色法：在一支小试管（10×100mm）中，滴入3--4滴蒸溜水，用接种环取巨大芽孢杆菌于水中，充分搅匀，使菌体分散，制成较浓的菌悬液。
然后滴加等体积的(3—4滴) 石炭酸复红液摇匀。
将此试管放入沸水浴中煮10—15分钟，使芽孢及菌体着色。
实验二++细菌的形态学检查(1)
实验二细菌的形态学检查【目的和要求】1．熟悉细菌染色的常用染料和一般程序。
2．掌握革兰染色的方法、原理、结果观察及意义。
3．熟悉不染色标本检查法（压滴法和悬滴法）的方法与结果观察。
4．熟悉细菌的特殊染色法。
【试剂与器材】1．菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌。
2．试剂：革兰染色液、细胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理盐水等。
3．其他：载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、香柏油、蜡笔、擦镜纸、脱油剂等。
【实验内容】一、细菌染色的一般程序细菌染色法分单染法和复染法。
单染法是用一种染料去染，所有细菌都染成一种颜色；复染法是用多种染料对细菌进行染色，不同细菌可染成不同的颜色。
大部分细菌染色的基本程序相同，即：涂片→干燥→固定→染色，根据实验目的选择不同的染色方法，在实际工作中，应用最广泛的是革兰染色法。
二、革兰染色1．染色原理（1）等电点学说：革兰阳性菌的等电点（pI2～3）比革兰阴性菌（pI4～5）低，在同一pH条件下革兰阳性菌带负电荷比革兰阴性菌要多，与带正电荷的碱性染料（结晶紫）结合性牢固，不易脱色。
（2）化学学说：革兰阳性菌含有大量的核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95%酒精脱色；而革兰阴性菌含此种物质少，故易被乙醇脱色。
（3）通透性学说：革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层较厚，含脂质少，脱色时，乙醇不易进入，而且95％乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小，通透性降低，阻碍结晶紫和碘复合物渗出。
而革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层较薄，含脂质多，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫与碘复合物易被溶出而脱色。
2．方法（1）涂片：取清洁无油迹的载玻片1张，用蜡笔划线将其分成左右两格。
用接种环先挑取生理盐水1~2环于载玻片每格中央，再分别挑取大肠杆菌和葡萄球菌少许菌落与生理盐水研匀，涂成直径约1.5cm的菌膜。
（2）干燥：让涂片自然干燥，也可在酒精灯火焰较远处微微加热烘干，但切勿靠近火焰。
实验二细菌的染色及形态观察
实验二细菌的染色及形态观察一、目的要求1、了解细菌染色的基本原理。
2、掌握细菌的简单染、革兰氏染色及其他染色方法。
3、观察和识别细菌的形态及细菌细胞的特殊结构。
二、实验说明细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下特别是在油浸物镜下几乎与背景无反差，很难看清楚，如将其染色，使折光率增大，便容易观察。
由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不同，因此可以利用不同的染色方法来区别不同的细菌及其结构。
用于细菌染色的染色剂是苯环上含有发色基团和助色基团的化合物。
发色基团使化合物本身具有染色之能力，助色基团有电离特性，可以于被染物结合，使被染物着色。
染色剂有三种：酸性染色剂（电离后分子带负电荷）；碱性染色剂（电离后分子带电荷）；复合染色剂（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色剂）。
酸性染色剂主要用于染细胞质；碱性染色剂主要用于染核和异染颗粒等细胞结构；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次氏体。
三、实验材料1、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸。
2、酒精灯、接种环、载玻片。
3、石炭酸复红染色液、革兰氏染色液、荚膜染色液、鞭毛染色液（配方见附录）。
四、方法步骤（一）简单染色法步骤：涂片干燥固定染色水洗干燥镜检。
1、涂片在干净的载玻片中央加一滴蒸馏水，以无菌操作法，从斜面上挑取少量菌种，在载玻片上和水混合后，涂成一均匀薄层。
2、干燥固定涂片让其在空气中自然干燥，有时为使其干燥得快点，也可在酒精灯上加温，但勿贤紧靠火焰。
3、固定待涂片干燥徨，手持载玻片一端，有菌膜的一面向上，在酒精灯火焰上通过几次（用手背触载玻片背面，以不烫手为宜），待冷却后，再加染料。
4、染色玻片置于水平位置。
加石炭酸复红液于菌膜部位。
染1-2min。
5、水洗倾去染液，斜置玻片，用很细水流的自来水冲洗（切勿使水流直接冲刷在菌膜处），直至洗下水呈无色为止。
6、干燥自然干燥或用吸水纸吸干。
7、镜检。
（二）革兰氏染色法步骤：涂片干燥固定结晶紫染色水洗吸干 95%酒精脱色水洗吸干蕃红复染水洗干燥镜检。
芽孢染色
芽孢、荚膜和鞭毛染色，都是利用细菌细胞不同的构造部分与染料的亲和力不同，用各种特殊染色法使之显示出不同的颜色，籍以显微观察。
芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料亲合力不同的原理，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别，芽孢壁厚，透性低，着色，脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料—孔雀石绿在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色；而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（沙黄）进行复染色，此时菌体即被染成红色，而芽孢难着色，仍呈绿色。
使之显示出不同的颜色，籍以显微镜观察。
荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成份是多糖类，不易被染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景染色而把不着色透明的荚膜衬托出来，荚膜很薄，易变形，因此制片时一般不用热固定。
细菌的鞭毛极为纤细，直径在0.1微米以下，因此在普通光学显微镜下不能见到，只有用特殊的染色方法，才能把鞭毛显示出来，鞭毛的染色方法很多，但主要的原理都是采用不稳定的胶体溶液作媒染剂，在鞭毛上生成沉淀，加大鞭毛的直径，然后再进行染色，同时，培养稍久的菌，鞭毛易脱落，所以要用新鲜的菌体，一般是用经3~5代（每代培养时间16~20小时）的斜面，最后一代接到含0.8~1.2%琼脂的软琼脂培养基（带有冷凝水）经12~16小时培养的菌体为佳。
三、实验材料和用具：1．菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）园褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）普通变形杆菌（Proteus vulgaris）萤光假单胞菌（Pseudomonas fluoroscens）丙酮丁醇梭状芽孢杆菌（Clostridium acetobutylicum）苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）北京棒状杆菌Asl.299（Corynebacterium pekinense）2．染液：（配方见附录Ⅰ）（1）芽孢染液：A、5%孔雀石绿水溶液B、0.5%沙黄水溶液（2）荚膜染液：34A、石碳酸复红染液B、5%黑色素水溶液（或用墨汁）（3）鞭毛染液：硝酸银染色：A液：鞭毛染色媒染剂B液：硝酸银溶液美蓝染色：媒染剂：同硝酸银染色A液美蓝染色液3．用具：显微镜、载玻片、玻片架、滤纸、接种环、无菌水、酒精灯、香柏油、二甲苯、火柴、擦镜纸等。
实验二细菌涂片的制备和染色镜检
革兰染色步骤
蒸 滴馏水 水
接 种 环涂片
自然干燥
固定
稀释得 石 炭酸复红
干燥 镜检
复染 10~30s
95% 酒精
脱色 20~30s
碘液
草酸铵 结晶紫
初染1-2min
媒染 2-3min
革兰染色时注意事项:
1、要用幼龄培养物作革兰染色; 2、涂片不宜太厚,以免脱色不完全造成假阳性
革兰阳性菌:细胞壁肽聚糖层厚,交联而成得肽聚糖网状结构致密,经
乙醇处理发生脱水作用,使孔径缩小,通透性降低,结晶紫与碘形成得大 分子复合物保留在细胞内而不被脱色,结果使细胞呈现紫色。
革兰阴性菌:细胞壁肽聚糖层薄,网状结构交联少,类脂含量较高, 经
乙醇处理后,类脂被溶解,细胞壁孔径变大,通透性增加,结晶紫与碘得复 合物被溶出细胞壁,因而细菌细胞被脱色,再经石炭酸复红复染后细胞
大肠埃希菌 2-3 μm
布鲁菌 0.6-1.5 μm
杆菌(bacillus)
杆菌得形态多样
两端齐平
两端尖细
炭疽芽胞杆菌
白喉棒状杆菌
杆菌(bacillus)
杆菌得形态多样
分枝杆菌
双歧杆菌
螺形菌(spiral bacterium)
弧菌
螺菌
螺杆菌
细菌抗酸性染色
特殊染色法
就是对细菌特殊结构进行染色得方法。 包括芽胞染色、荚膜染色、鞭毛染色等。
干燥 镜检
染色
细菌涂片示例:
水
细菌涂(抹)片得制备和革兰氏染色
实验内容: 1、 细菌抹片得制备:
玻片准备:透明、洁净、无油渍。 抹片:液体材料、非液体材料、组织脏器材料得抹片方法讲解、示范。 干燥固定:火焰固定和化学固定得示范。讲解其目得及注意事项。
动物科学微生物实验指导
动物微生物学实验指导目录实验1 细菌的简单染色和革兰氏染色实验2 细菌的芽胞、荚膜、鞭毛染色及运动性观察实验3 微生物细胞形态及菌落特征观察实验4 培养基制作、灭菌消毒及无菌操作接种技术实验5 微生物的分离纯化与稀释平板菌落计数实验6 微生物细胞大小测定及显微镜直接计数附录1 常用培养基配方附录2 常用染色液的配制附录3 常用试剂和指示剂的配制参考书目实验1 细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的1、学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法；2、学习显微镜油镜观察的方法；二、实验内容1、细菌的简单染色；2、细菌的革兰氏染色；三、实验原理简单染色法是一种最基本的染色方法，是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。
因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，而碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红、孔雀绿或蕃红）等进行染色，当这类染料解离后，染料离子带正电荷，使菌体着色。
简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色反应。
通过革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类。
这是因为两类菌的细胞壁结构和成分的不同，G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经过蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，即紫色。
四、实验材料1、活材料：培养12～16h的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），培养24h 的大肠杆菌（Escherichia coli）。
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实验二细菌的芽孢染色, 鞭毛染色, 荚膜染色
一实验目的
1 学习细菌的芽孢染色法
2 学习细菌的鞭毛染色法
3 学习细菌的荚膜染色法
二实验原理
1 芽孢染色的原理:
细菌的芽孢具有厚而致密的壁。
透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。
芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色但一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。
所有的芽孢染色法都基于同一个原则；除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。
当染芽孢时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。
然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。
2 鞭毛染色的原理:
细菌的鞭毛极细，直径一般为0.01～0.02μm，只有用电子显微镜才能观察到。
但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。
鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理、让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。
常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。
3 荚膜染色的原理:
荚膜是细菌分泌到菌体周围的一层黏液状物质,通常是多糖和多肽类物质. 由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。
由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定。
以免荚膜皱缩变形。
三实验器材
1 菌种：培养24h的枯草杆菌（Bacillcus subtilis）、培养12-16h的变形杆菌斜面,培养3d 的固氮菌。
2 染色液和试剂：5％孔雀绿水溶液、番红水溶液, 鞭毛染色液A液与B液，蒸馏水，香柏油，显微镜擦拭液,绘图墨水或黑色素溶液．
3 器材：酒精灯、接种环、镊子、载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、显微镜等。
四实验方法
（一）芽孢染色：
1 涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。
2 晾干固定；待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过3次。
3 染色：
A 加染色液。
加5％孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片用试管夹夹住，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽对开始计算时问，约维持４～５min。
加热过程中要随时交替添加染色液和蒸馏水，切勿让标本干涸（加热时温度不能太高）。
B 水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。
C 复染：用番红液染色２－３min。
D 水洗、晾干或吸干。
4镜捡：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽孢和菌体的形态。
（二）鞭毛染色
１制片：吸取少量蒸馏水滴在洁净玻片的一端，无菌操作在斜面上取菌少许，在蒸馏水中轻沾，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端。
用吸水纸吸去多余的菌液。
涂片放空气中自然干燥。
2染色：
1）滴加A液，染4～6min。
2）用蒸馏水充分洗净A液。
3）用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.5～lmin (加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸)。
4) 用蒸馏水洗，自然干燥。
3 镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。
（三）荚膜染色：
1 制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。
2 推片：取一清洁载玻片一端接触混合液，以30°角进行推片。
3 晾干：在空气中自然晾干。
4镜检：先用低倍镜、再用高倍镜、油镜观察。
五实验报告
1绘出所观察菌种的芽孢和菌体的形态图．
2绘出细菌鞭毛的形态及着生位置．
3 绘出固氮菌的菌体和荚膜的形状。
六思考题
1 用简单染色法能否观察到细菌的芽孢?说明原因.
答：能。
因为芽孢难以染色，用简单染色法可以把易染上色的菌体染上色，而芽孢则没染上色，形成对比，因此也可观察到芽孢。
2 用鞭毛染色法准确鉴定一株菌是否有鞭毛,要注意哪些环节?
答：A．良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用已形成芽孢或衰老期培养物做鞭毛染色的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落。
B．玻片要光滑、洁净（用洗衣粉洗），尤其忌用带油迹的玻片（将水滴在玻片上，无油迹玻片水能均匀散开）。
这是染色的关键。
C．挑菌时，尽可能不带培养基。
菌量要少。
D．掌握好B液的染色时间。
3 荚膜染色为什么要用衬托染色法?
答：荚膜的成分多为多糖、糖蛋白或多肽，因此与染料的亲和力弱、不易着色，而且荚膜可溶于水，易在用水冲洗时被除去。
所以用衬托染色法染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围便形成一透明圈。
这样便可观察到荚膜的在菌体中的形状和位置。