基因组DNA测序文库构建
外显子文库构建标准操作流程
外显子文库构建标准操作流程
外显子文库构建的标准操作流程如下：
1.将质量合格的基因组DNA超声打碎成200-300bp左右的片段。
2.将打碎的基因组DNA片段进行末端修复，3’端加A和5’端进
行磷酸化。
3.对修复后的片段进行接头连接。
4.对接头连接后DNA片段进行线性扩增制备成杂交文库。
5.将构建好的文库进行探针杂交捕获。
6.将捕获后的文库进行PCR扩增富集。
7.对PCR反应扩增后的产物进行质控和建库，最终获得外显子文
库。
具体操作步骤和试剂可参照《高通量测序外显子组文库构建技术规范》。
如需更多信息，建议咨询基因学专家或查阅相关论文。
基因测序的流程
基因测序的流程
基因测序是指对生物体的基因组进行测序，以获取其基因组的
信息。
基因测序的流程主要包括DNA提取、文库构建、测序、数据
分析等步骤。
首先，DNA提取是基因测序的第一步。
DNA提取是指从生物体的
细胞中提取出DNA，并将其纯化，以获取高质量的DNA样本。
DNA提
取的方法多种多样，可以根据样本的来源选择适合的提取方法，比
如血液、组织、细胞等不同的样本来源，需要采用不同的提取方法。
接着，文库构建是基因测序的第二步。
文库构建是指将提取得
到的DNA样本进行文库构建，将DNA片段插入载体中，构建成文库。
文库构建的关键是要选择合适的文库构建方法，保证文库的质量和
覆盖度，以及避免文库中的污染和假阳性。
然后，测序是基因测序的第三步。
测序是指对构建好的文库进
行测序，获取DNA序列信息。
目前，常用的测序技术包括Sanger测序、二代测序和三代测序等。
不同的测序技术有不同的优缺点，可
以根据研究目的和预算选择合适的测序技术。
最后，数据分析是基因测序的最后一步。
数据分析是指对测序得到的数据进行质控、比对、组装、注释等分析，以获取基因组的信息。
数据分析的关键是要选择合适的分析软件和工具，保证数据分析的准确性和可靠性，以及对数据进行合理的解释和应用。
综上所述，基因测序的流程包括DNA提取、文库构建、测序、数据分析等步骤。
每个步骤都有其特定的方法和技术，需要根据实际情况进行选择和优化，以保证基因测序的准确性和可靠性。
基因测序技术的不断发展和进步，为生命科学研究和临床诊断提供了强大的工具和支持。
基因组文库构建的基本过程
基因组文库构建的基本过程构建基因组文库，听起来是不是有点高大上？其实啊，这个过程就像是做一碗丰富的杂烩，里面有各种各样的成分，味道可好了。
今天就让我们轻松愉快地聊聊这个过程，从头到尾都不复杂，保证让你听完后恍若领悟了宇宙的奥秘！1. 基因组的准备首先，咱们得有“食材”，也就是目标基因组。
想象一下，像个侦探一样，你得先找到你要研究的生物，这可能是一只可爱的青蛙，或者一株神秘的植物。
然后，从这些生物体中提取DNA，这一步就像是把青蛙放在水里，慢慢观察它的变化。
提取DNA的过程其实也没那么神秘，简单来说，就是用一些化学试剂把细胞里的DNA分离出来。
就像剥蒜一样，简单又有效。
接下来，得把提取的DNA切割成小片段。
这就好比在厨房里把食材切成小块，方便后面的烹饪。
这个切割的过程，通常用一些特殊的酶，听上去高端，但实际上就是让DNA变得易于处理。
你可能会想，这么多小块到底怎么存起来呢？别急，接下来就要介绍基因组文库的“容器”了。
2. 构建文库2.1 载体的选择在我们的基因组文库中，载体就像是一个个小小的运输箱，专门用来存放那些切割好的DNA片段。
这里面有各种各样的选择，最常见的就是质粒，这种小圆圈状的DNA 能在细胞中独立复制，真是个省心的好伙伴！当然，也有其他的载体选择，比如病毒载体，听起来就有点神秘，实际上它们也只是利用病毒的特性来运送我们的DNA而已。
2.2 转化过程有了载体后，咱们就可以把这些小DNA片段装进去，进行转化了。
转化就像是给每个小箱子上锁，把它们装上货车，准备运输到指定地点。
通常我们会把这些装有DNA的载体放入细胞中，等待它们“安家落户”。
这一步可有讲究了，要控制好温度和环境，让细胞在“舒适”的状态下接纳这些新朋友。
3. 筛选与鉴定3.1 筛选一旦我们的载体和DNA片段都进了细胞，接下来就是筛选这些“小箱子”了。
这一步可以想象成是在参加一个聚会，大家都是陌生人，但你只想和那些有趣的、能引起你兴趣的人交朋友。
7.DNA 文库的构建
cDNA 第二条链的合成在 cDNA 的构建中 非常重要， 非常重要，有：自身引导法，置换合成法，引 自身引导法，置换合成法， 导合成法，引物－ 导合成法，引物－衔接头合成法可以后可以通过表型筛选法、杂交筛 选和 PCR 筛选、免疫筛选法筛选目标基因。 筛程序包括：
1、提取研究对象基因组 DNA ，制备合适大 小的 DNA 片段，或提取组织或器官的 mRNA 片段， 并反转录成 cDNA ； 2、DNA 片段或 cDNA 与经特殊处理的载体 连接形成重组 DNA ； 3、重组 DNA 转化宿主细胞或体外包装后侵 染受体菌； 染受体菌； 4、阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 阳性重组菌落或噬菌斑有不同， 构建。 连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采 连接产物不用电转化的方法转化宿主， 用包装蛋白进行包装并侵染宿主。 用对简单， 其需要很多特殊的处理以及必要的仪器设备， 其需要很多特殊的处理以及必因组覆盖倍数的计算方法一般包括两个过程 1.计算法，基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度× 1.计算法，基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度×克 计算法 隆数/ 隆数/基因组 DNA 的长度（一般是约数）； 的长度（一般是约数）； 2.结合基因组覆盖度的检测来进行的。 2.结合基因组覆盖度的检测来进行的。基因组覆盖覆盖倍数又等于 该基因位点的覆盖倍数，因此， 所有探针筛到的阳性克隆的总个数/ 所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比 值。代表性和随机性 二、代表性和随机性
代表性是指中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可 片段寻找最适的比 例。 在电转化和包装侵染过程中， 在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化 效率高的感受态细胞或行脱盐处理也可以明显地提高 其效率。 其效率。 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不 对于电转化而言， 同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。 的转化效率也有所不同。
怎样构建基因组文库
i. 两菌株分别培养,分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
sa c B
K anr
p a c lo x P
D N A h ea d fu l
+
+ p a c c le a v a g e
p r o te in
C re
R e c o m b ila tio n
DNA
A m p lific a tio n七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
第四章基因的建立来自基因文全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比
S
C o s o r i A pr S
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamH I 小片段
Cos
H
35-45kb DNA 片 段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S
库载
感 染 E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
二代测序文库构建流程
二代测序文库构建流程想象一下，我们要建造一个小房子，那得先准备好材料吧。
构建二代测序文库也是这样，得有DNA。
DNA就像是小房子的设计图纸，它藏着好多秘密。
比如说，我们身体里的DNA就像一本超级厚的故事书，每个小片段都有自己的故事。
科学家们从细胞里把DNA取出来，这就像从一个装满宝藏的盒子里拿出了最珍贵的东西。
有了DNA之后呢，要把它剪成一段一段的。
这就好比把长长的面条剪成一小段一小段的。
为什么要这么做呢？因为太长的话，后面的操作就不好做啦。
就像长长的面条很难一口吃下去，剪成小段就方便多啦。
接下来呀，要给这些小片段加上一些特殊的“小帽子”和“小尾巴”。
这就像给每个小积木块加上独特的标记一样。
比如说，我们在每个小片段的开头和结尾都贴上一个彩色的小贴纸，这样就能很容易地找到它们，也能让它们更好地和其他东西组合在一起。
然后呢，要把这些加了“小帽子”和“小尾巴”的小片段变得更多。
这有点像魔法，一个小片段可以变成好多好多一样的小片段。
就像我们有一个小玩具，然后用魔法让这个小玩具变出好多一模一样的小玩具来。
这样做是为了后面能更容易地检测到这些小片段。
再之后呀，要把这些小片段按照一定的顺序排好。
这就像把不同颜色的积木按照我们想要的图案排列起来。
科学家们会用一些特殊的方法，让这些小片段整整齐齐地排好队。
最后呢，这个二代测序文库就构建好啦。
这个构建好的文库就像一个装满了秘密小盒子的大箱子。
科学家们可以用特殊的仪器去读取这些小盒子里的秘密，就像打开一个个小盒子，发现里面藏着的宝贝一样。
这些宝贝可能是关于我们身体为什么会生病，或者是一些小动物有什么特别的地方之类的秘密。
Iontorrent微生物全基因组重测序文库构建实验方案
“Iontorrent微生物（细菌）全基因组重测序文库构建实验方案”清晨的阳光透过实验室的窗户，洒在略显拥挤的操作台上，我的思绪开始像电流一样流转，10年的方案写作经验让我对每一个细节都了如指掌。
就让我们一起探索这个关于Iontorrent微生物（细菌）全基因组重测序文库构建的实验方案吧。
我们要明确实验的目的：通过Iontorrent平台，对微生物（细菌）进行全基因组重测序，以获取更准确、更全面的基因组信息。
那么，就是具体的步骤了。
一、实验材料与仪器1.材料：微生物（细菌）样本、DNA提取试剂盒、磁珠、PCR试剂、测序试剂盒等。
2.仪器：Iontorrent测序仪、离心机、PCR仪、磁珠分离器、凝胶成像仪等。
二、实验步骤1.样本处理：将微生物（细菌）样本进行适当的预处理，如离心、洗涤等，确保样品的纯净度。
2.DNA提取：使用DNA提取试剂盒，按照说明书操作，提取微生物（细菌）的基因组DNA。
3.DNA定量：利用纳米滴技术或紫外可见分光光度计，对提取的DNA进行定量，以确保DNA的浓度和纯度。
4.DNA片段化：将提取的DNA进行片段化处理，使其成为适合测序的片段大小。
5.文库构建：将片段化的DNA与测序适配器连接，通过PCR扩增，构建测序文库。
6.文库质检：利用凝胶成像仪，对构建的文库进行质检，确保文库的质量。
7.测序：将质检合格的文库上机测序，使用Iontorrent测序仪进行测序。
8.数据分析：将测序得到的原始数据进行质控、比对、组装等分析，得到微生物（细菌）的全基因组序列。
9.结果验证：对测序结果进行验证，如通过PCR、一代测序等方法，确保测序结果的准确性。
三、注意事项1.实验过程中，要注意无菌操作，避免样本污染。
2.操作过程中，要严格按照说明书进行，确保实验的准确性。
3.测序数据的质量控制和分析是关键步骤，要密切关注每个环节，确保结果的可靠性。
4.实验过程中，要随时记录实验数据和操作过程，以便后续的数据整理和分析。
基因文库的构建与使用
基因文库的构建与使用在生物科学领域，基因文库的构建和使用是研究基因功能和生物多样性的重要工具。
基因文库是指包含某种生物全部基因的克隆文库，它可以为我们提供深入了解该生物基因组的信息。
本文将详细介绍基因文库的构建与使用，包括基因文库的基本概念、构建方法、使用方法以及优势和展望。
一、基因文库的基本概念和作用基因文库是包含某种生物全部基因的克隆文库，它为我们提供了该生物基因组的全面信息。
构建基因文库的目的是为了方便研究者们筛选、分析和研究基因的功能以及多样性。
基因文库可以用于寻找基因的新颖功能、发现新的药物靶点以及为基因组编辑和改造提供资源。
二、构建基因文库的方法构建基因文库主要包括以下步骤：1、基因组文库的构建：首先需要获得该生物的基因组，然后将基因组进行分解，形成一系列重叠的DNA片段。
这些片段经过纯化、扩增和克隆到特定的载体中，形成基因组文库。
2、表达文库的构建：为了筛选出具有特定功能的基因，还需要构建表达文库。
表达文库中的基因需要在特定的细胞或组织中表达，以便研究者们能够确定基因的功能。
在构建基因文库时，需要考虑到基因的种类、基因表达水平以及克隆载体的选择等因素。
这些因素都会影响到基因文库的质量和实用性。
三、基因文库的使用方法使用基因文库可以方便地筛选和研究基因的功能。
以下是如何使用基因文库的一般步骤：1、选择相应的基因文库：首先需要选择包含所需基因的文库。
如果研究目标是寻找特定功能的基因，可以选择包含该功能基因的文库。
2、筛选候选基因：根据研究目标，可以在文库中进行筛查，挑选出可能具有所需功能的候选基因。
3、验证基因功能：通过实验验证挑选出的候选基因是否具有所需功能。
这可以通过表达和检测候选基因在细胞或整体生物中的功能来实现。
4、利用基因文库进行基因组编辑：基因文库也可以为基因组编辑提供资源和指导。
通过比对和分析基因文库中的序列，可以确定目标基因的精确位置和剪切位点，从而实现精准的基因组编辑。
DNA文库的构建
真核生物mRNA的结构
2、提取RNA基本步骤
总步骤：裂解细胞、沉淀蛋白、去除DNA、质量分析等； 裂解细胞： 强离液剂：胍盐, SDS, N-laurylsarcosine
(sarcosyl), 尿素, 苯酚 ； 破坏质膜，保持细胞核或细 胞器的完整性 ：如Nonidet P-40 (NP-40)，研磨、蛋白 酶K、蜗牛酶(含纤维素酶、甘露聚糖酶、葡糖酸酶和几丁 质酶等，可破坏酵母菌细胞壁)、SDS等处理； 沉淀蛋白：SDS、β -巯基乙醇、氯仿、苯酚、盐酸胍、异 硫氰酸胍等； 沉淀RNA：乙醇、异丙醇、氯化锂等； RNA质量分析； 从总RNA中纯化分离mRNA； RNA的长期保存。
制备基因组DNA的常用试剂
破碎细胞（液氮研磨、匀浆、超声波破碎） 除去蛋白杂质：（蛋白酶K、SDS、 CTAB、苯
酚）； 除去RNA(RNase A) 除去黏多糖(CTAB); 沉淀DNA（乙醇、异丙醇）； 抑制DNase（EDTA，可以螯合Mg++等）； 脱盐（70%乙醇漂洗）。
关键是对付RNase：措施
为了保证mRNA的完整性，必须使用最新鲜的生物材料， 最好是培养的活细胞，或从活体即刻采集的样品进行制备， 或者置于液氮、超低温冰箱保存的样品；
DEPC处理配置溶液用水：用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯 ，一种很强的RNA酶抑制剂）浸泡处理和高压灭菌；
烘烤玻璃器皿：200-300℃烘烤4小时；塑料器皿：在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底清洗，灭菌，即可去除 RNase；
基因组测序实验报告
基因组测序实验报告简介：本实验旨在通过测序技术对样本的基因组进行测序，以获得DNA 序列信息，并利用这些数据来研究基因组的结构、功能以及与疾病之间的关联。
以下是对实验过程、方法和结果的详细描述。
实验材料和方法：材料：1. 样本 DNA：从细胞中提取的 DNA 样本，采用常规的提取方法获得。
2. 高通量测序仪：使用 Illumina HiSeq 2000 进行高通量测序。
方法：1. DNA 提取：使用DNA提取试剂盒，按照说明书中的步骤从细胞中提取 DNA 样本。
2. DNA 文库构建：将样本 DNA 进行片段化处理，通过末端修复、加入接头等步骤，构建 DNA 文库。
3. 测序：将构建好的 DNA 文库装入高通量测序仪中，进行测序。
4. 数据处理：经过测序仪的运行后，得到原始的测序数据，需要进行数据处理和分析。
结果及讨论：1. 数据质量评估：对测序得到的原始数据进行质量评估，包括测序质量、测序深度和 GC 含量等。
通过评估，我们可以得出数据的可靠性，并为后续数据分析提供基础。
2. 数据预处理：对原始数据进行去除接头序列、低质量碱基修剪、过滤和去除PCR 重复等预处理步骤，以得到更加干净和高质量的数据。
3. 读长组装：使用序列拼接软件将测序数据进行组装，得到尽可能长的连续序列，称为 contig。
通过 contig 可以获得样本的基因组信息。
4. 基因注释：对得到的基因组序列进行注释分析，包括基因预测、基因功能注释、基因富集分析等，以揭示基因组的结构和功能。
5. 变异检测：通过比对样本的基因组序列与参考基因组序列，识别样本中的变异位点，包括SNP、InDel等。
这些位点的分析可以帮助我们了解个体之间的遗传差异，并探索与疾病相关的变异位点。
6. 结果分析和总结：根据实验的结果进行分析，并结合相关文献资料进行讨论，总结出实验的结果和相关的结论。
结论：本实验通过基因组测序技术对样本进行了测序，并得到了样本的基因组序列信息。
基因文库的构建
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端 互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体的寡核苷酸链为探针）
2. mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特 定功能基因工作量较小。
3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。（转录特征）
4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白
5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA不同 6. 不能研究基因组的结构功能
构建cDNA1.制备mRNA凝胶阻滞法
DNase Ⅰ足迹法
4.7.1 凝胶阻滞实验
又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于 在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊 的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点， 也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质定长度的DNA片段克隆到某种载体上发育时期所转录的mRNA 经逆转录形成的cDNA片段与某种载体ene pool)：某一生物群体所拥有的全部基因。
4. 筛选目的基因
原核细胞不可用来作为基因的表达系统 （无转录后加工）。
原核细胞基因库——只能用核酸探针杂 交筛选目反转录酶的作 用下将点：
1. cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸 纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显 示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性 酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）
溶菌、使DNA 暴露
简述基因组文库构建的基本步骤。
简述基因组文库构建的基本步骤。
答:
1、首先从含有目的基因的供体生物的细胞或组织中提纯获得高质量的基因组DNA。
2、用特定的限制性内切酶将含有目的基因的供体基因组DNA切割成许多片段。
3、用能产生互补粘性末端的限制性内切酶将载体(噬菌体)DNA切开并去除其中的填充片段。
4、用专一性强的DNA连接酶将供体DNA片段分别与载体DNA连接(供体DNA片段克隆到载体中)。
5、经包装繁殖而产生重组噬菌体克隆(DNA重组体)，建成供体基因组DNA文库成员。
6、当制备的克隆数多到足以把某种供体生物的全部基因都包含在内时，这些克隆的总体就称为该生物的基因文库。
7、有了基因文库，在分离带有目的基因的DNA重组体时就可以从文库中筛选而不必重复地进行全部操作。
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序基因组文库构建程序基因组文库构建是基因组学研究中的重要步骤之一，它是将DNA 分子切割成小片段，并将这些小片段插入到载体DNA中，形成文库。
文库构建的成功与否直接影响到后续的测序结果和分析结果。
因此，开发高效、准确的基因组文库构建程序对于基因组学研究具有重要意义。
基因组文库构建程序的主要步骤包括DNA片段切割、文库构建、文库质量控制等。
其中，DNA片段切割是文库构建的关键步骤之一。
DNA片段切割的方法有多种，如限制性内切酶切割、超声波切割、化学切割等。
不同的切割方法适用于不同的样品类型和研究目的。
例如，限制性内切酶切割适用于较小的基因组，而超声波切割适用于大型基因组。
文库构建是基因组文库构建程序的核心步骤之一。
文库构建的方法有多种，如插入式文库构建、接头式文库构建等。
插入式文库构建是将DNA片段直接插入到载体DNA中，而接头式文库构建则是在DNA片段的两端加上接头序列，再将其插入到载体DNA中。
接头式文库构建相对于插入式文库构建具有更高的文库构建效率和更低的文库构建偏差。
文库质量控制是基因组文库构建程序的最后一步。
文库质量控制的目的是检测文库的质量和纯度，以保证后续的测序结果和分析结果的准确性。
文库质量控制的方法有多种，如琼脂糖凝胶电泳、荧光定量、质量评估等。
其中，质量评估是文库质量控制的重要步骤之一，它可以评估文库的质量和纯度，并确定文库的适用范围和测序深度。
基因组文库构建程序是基因组学研究中不可或缺的步骤之一。
开发高效、准确的基因组文库构建程序对于基因组学研究具有重要意义。
未来，随着基因组学研究的不断深入，基因组文库构建程序的研究和开发将会越来越重要。
基因测序的流程
基因测序的流程基因测序是一种对生物体基因组进行全面分析的技术手段，它可以揭示生物体的基因组结构、功能和演化。
基因测序的流程通常包括DNA提取、文库构建、测序、序列拼接和分析等步骤。
首先，进行DNA提取。
DNA提取是基因测序的第一步，其目的是从生物样本中提取出足够纯净的DNA。
提取方法通常包括化学法、机械法和热溶法等，不同的样本类型需要选择不同的提取方法。
接下来是文库构建。
文库是指将DNA样本转化为适合测序的文库。
文库构建包括DNA片段的末端修复、连接接头、文库扩增和纯化等步骤。
这一步骤的关键是确保文库的质量和纯度，以保证后续测序的准确性和可靠性。
然后是测序。
测序是基因测序的核心步骤，它通过测定DNA序列来揭示基因组的结构和功能。
目前常用的测序技术包括Sanger测序、高通量测序和第三代测序等，它们在测序速度、成本和读长等方面各有优势。
接着是序列拼接。
由于测序技术的限制，得到的测序数据通常是碎片化的，需要进行序列拼接来还原原始的DNA序列。
序列拼接是基因测序中比较复杂的步骤，需要借助计算机算法和软件来进行数据处理和分析。
最后是序列分析。
序列分析是基因测序的最后一步，它包括基因预测、基因功能注释、基因组比对和进化分析等内容。
通过序列分析，可以揭示基因组的结构和功能，为后续的基因功能研究和生物信息学分析提供重要的数据支持。
综上所述，基因测序的流程包括DNA提取、文库构建、测序、序列拼接和分析等多个步骤，每个步骤都至关重要。
随着测序技术的不断发展和进步，基因测序已经成为生物学、医学和生物信息学等领域中不可或缺的重要工具，为人类认识生命、治疗疾病和改善生活提供了重要的支持和保障。
2_二代测序DNA文库构建概述
二代测序DNA文库构建概述杂交捕获流程➢探针根据感兴趣的目标序列设计➢探针与目标序列互补，因而可进行特异性杂交➢实验的关键是探针和基因组DNA或cDNA的杂交，其特异性决定了靶向富集的效率检测变异类型：•Single nucleotide polymorphism (SNP) •Insertion/deletion (indel)•Copy number variation (CNV)•Gene Fusion二代测序文库构建流程DNA 样品*片段化核心步骤：➢末端修复➢加A尾➢接头连接*文库扩增文库产出测序文库构建概述（Illumina平台）Y 形测序接头原始DNA片段化DNA接头连接PCR 扩增DNA 插入片段文库构建步骤概述DNA 样本投入DNA片段化片段末端补平&加“A”尾测序接头连接片段大小筛选（可选）PCR文库富集DNA 文库产出建库时需要加入多少的DNA量呢？需要根据实际的应用及样本情况进行选择优化如何对DNA进行片段化？1、物理打断：通常使用超声来打断，如Covaris2、酶切打断：如KapaHyperplus文库构建试剂盒DNA片段末端补平、5`端磷酸化、3`端加“A”尾补平及磷酸化末端加“A”尾测序接头与DNA片段的连接通过磁珠纯化、文库片段大小选择（可选步骤）通过调节结合buffer的浓度，实现磁珠选择吸附不同大小的片段对两端都加上接头的文库通过PCR扩增？Primer 1Primer 2AA最终得到的文库起始DNA片段最终文库。
Ion torrent微生物(细菌)全基因组重测序文库构建实验方案
Ion torrent微生物（细菌）全基因组重测序文库构建实验方案微生物全基因组重测序文库构建实验方案一、重测序原理全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
二、技术路线培养至对数期的单一菌落↓基因组DNA提取细菌DNA↓超声波打断 DNA片段化↓文库构建↓Ion OneTouch 乳液PCR、ES↓Ion PGM、Ion Proton 上机测序↓生物信息学分析DNA片段化↓末端修复↓纯化接头连接、缺口修复↓纯化文库片段筛选↓文库片段扩增↓纯化 Agilent Test、Qubit定量↓ Ion OneTouch System 重测序三、实验方案 1.细菌总DNA的提取液氮速冻、干冰保存的细菌菌液：若本实验室可以提供该细菌生长的条件，则对菌液进行活化，培养至对数期时，对该细菌进行DNA提取；若本实验室不能提供该细菌的生长条件，则应要求客户提供尽可能多的样本，以保证需要的DNA 量。
细菌DNA采用试剂盒提取法。
取对数生长期的菌液，按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤进行操作。
提取完成后，对基因组DNA进行纯度和浓度的检测。
通过测定OD260/280，范围在之间则DNA较纯，使用Qubit对提取的DNA进行定量，确定提取的DNA浓度达到文库构建的量。
片段化采用Covaris System超声波打断仪，将待测DNA打断步骤：1）对待打断的DNA进行定量，将含量控制在100ng或者1μg2）打开Covaris M220安全盖，将Covaris AFA-grade Water充入水浴容器内，至液面到最高刻度线，软件界面显示为绿色3）将待打断DNA装入Ep LoBind管中，其中DNA为100ng 或1μg，加入Low TE至总体积为50mL4）将稀释的DNA转移至旋钮盖的Covaris管中，转移过程中不能将气泡带入，完成后旋紧盖子5）选择Ion_Torrent_200bp_50μL_ScrewCap_microTube，将对应的小管放入卡口，关上安全盖，点击软件界面“RUN”6）打断结束后，将混合液转移至一支新的离心管中3.末端修复及接头连接末端修复使用Ion Plus Fragment Kit进行，以100ng DNA量为例，各组分使用前瞬时离心2s 步骤：1）加入核酸酶free水至装有DNA片段的离心管中，至总体积为79μL 2）向体系中加入20μL 5×末端修复buffer，1μL末端修复酶，总体积为100μL 3）室温放置20min 片段纯化片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行步骤： 1）加入180μL Agencourt AMpure XP Reagent beads 于经过末端修复的离心管中，充分混匀，室温放置5min 2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清 4）重复第三步5）用20μL墙头小心吸去多余的液体6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min7）取下离心管，加入25μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的 EP管中 9）纯化的DNA片段用于下一步的接头连接4.接头连接、缺口修复和纯化片段两端的接头分别为barcode接头和P1接头接头连接在体系中加入 DNA 25μL 10×Ligase Buffer 10μL Ion P1 Adaptor 2μL Ion Xpress Barcode X+ 2μL dNTP Mix 2μL Nuclease-free water 49μL DNA Ligase 2μL Nick pair polymerase8μL Total 100μL将体系配置好后，放入PCR仪按照下面的温度进行1个循环扩增 25℃15min72℃5min 4℃hold 循环×1立即转移至一个新的离心管中纯化片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行步骤： 1）加入140μL Agencourt AMpure XP Reagent beads 于经过末端修复的离心管中，充分混匀，室温放置5min 2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清 4）重复第三步5）瞬时离心，用20μL墙头小心吸去多余的液体 6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min7）取下离心管，加入20μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的 EP管中5.文库片段筛选方案1E-Gel Agarose System采用E-Gel SizeSelect 2% Agarose Gel，在E-Gel电泳、成像系统中按照操作说明进行。
基因组文库、cDNA文库的构建和筛选
示差筛)
• 扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cD)得以实现的。
• 差别杂交对于因特殊处理而被诱发产生的mRNA 之cDNA克隆的分离，或是在细胞中具高表达效 率的mRNA之cDNA克隆的分离，无疑是一种有 效的方法，但对于低丰度的mRNA之cDNA克隆 的分离则有相当的困难。为了进一步提高差别杂 交的筛选效率，一种切实可行
点，因此可用 P2 噬菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重组体。在填充片段两端带有对称的多 克隆位点。
载体
• 质粒载体—用于基因组较小的生黏粒—45kb 细菌人工染色体（BAC）—350kb 酵母人工染色序列• 具有代表性的基因应该在最大限度上 覆盖所有的原初序列。
• 合适的酶切片段可由琼脂糖凝胶电泳
质粒载体
蓝白筛选
YAC载体
置换型载体
• 允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段 的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置换型载体克隆 外源片段的大小范围是 9-2cDNA内部， 在添加接头前先用EcoRⅠ甲基化酶甲基化。
• 最后用T4DNA连接酶连接。
cDNA末端的处理
• 末端转移酶—可以向cDNA末端加上与克隆 载体末端互补的尾部
末端转移酶 末端转移酶
与载体的连接
• 载体先用碱性磷酸酶去磷酸化以防止载体 自连接。
• T4DNA连接酶连接载体与c龙膜 上；膜上的DNA在碱性 条件下变性，解聚形成 单链；再通过烤膜或紫 外线照射，单链将与膜 紧密结合；再将膜置于 含有放射性标记的核酸 探针的溶液中保温，使 探针与其互补序列进行 杂交；杂交后充分洗去 未杂交的探针，然后可 由放射性自显影鉴定。
（1原）位原位杂杂交交筛筛选选
基因组DNA测序文库构建
基因组DNA测序文库构建1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。
对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。
对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。
2.用Qubit检测DNA样品浓度。
3.吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间，体积为130ul。
用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。
4.样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。
5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ulTE或Elution Buffer洗脱。
回收产物用Qubit测值。
6.修平和磷酸化100ul体系DNA 1ug5 X T4 polymerase buffer 20ulBSA (5mg/ml) 2ulATP (100mm) 1uldNTP（10mm）10ulT4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ulKlenow（10U/ul）1ulT4 PNK (10U/ ul) 1.5ul22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。
纯化后Qubit测值。
7.加‘A’100ul体系DNA 0.5-2.5ug10 X klenow buffer 10uldATP(10mm) 1-3ulKlenow(exon-)（5U/ul）1-3ul37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。
纯化后Qubit测值。
8.连接头200ul体系10 X T4 DNA ligase buffer 20ulPEG4000 30ulATP(100mm) 2ulDNA X接头 YT4 DNA ligase 1.5-2ul加水至 200ulDNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序通常包括以下步骤：
1. DNA提取：从样品（比如细胞、组织、血液等）中提取DNA，并对其进行质量控制。
2. DNA片段化：将DNA样品通过不同的方式（比如随机切割、酶切等）分解成小片段，一般为200-800bp。
3. 处理DNA片段：对DNA片段进行多个步骤的处理，包括末端修复、加上适配器、文库大小筛选等。
4. PCR扩增：使用PCR技术通过适配器扩增DNA片段，以获得足够多的文库。
5. 纯化文库：对PCR扩增产生的文库进行纯化，以去除杂质。
6. 测序：利用高通量测序技术对文库进行测序，生成原始测序数据。
7. 数据处理：对原始测序数据进行序列质控、序列拼接、比对等处理，最终生成基因组序列。
常用的基因组文库构建程序有：TruSeq DNA Sample Preparation Kit（Illumina）、Nextera DNA Flex Library Prep Kit（Illumina）、KAPA HyperPlus Library Preparation Kit （Roche）等。
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基因组DNA测序文库构建
1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含
RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。
对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。
对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。
2.用Qubit检测DNA样品浓度。
3.吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间，
体积为130ul。
用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。
4.样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。
5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ul
TE或Elution Buffer洗脱。
回收产物用Qubit测值。
6.修平和磷酸化
100ul体系
DNA 1ug
5 X T4 polymerase buffer 20ul
BSA (5mg/ml) 2ul
ATP (100mm) 1ul
dNTP（10mm）10ul
T4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ul
Klenow（10U/ul）1ul
T4 PNK (10U/ ul) 1.5ul
22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。
纯化后Qubit测值。
7.加‘A’
100ul体系
DNA 0.5-2.5ug
10 X klenow buffer 10ul
dATP(10mm) 1-3ul
Klenow(exon-)（5U/ul）1-3ul
37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。
纯化后Qubit测值。
8.连接头
200ul体系
10 X T4 DNA ligase buffer 20ul
PEG4000 30ul
ATP(100mm) 2ul
DNA X
接头 Y
T4 DNA ligase 1.5-2ul
加水至 200ul
DNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。
9.连接产物用柱式法纯化后，跑琼脂糖胶切割目的区域回收。
10.PCR扩增
10 X TagE buffer 5ul
Mg2+ 4ul
dNTP(10mm) 1ul
lib-PCR-F 0.5ul
lib-PCR-R 0.5ul
tagE 0.5ul
DNA 5ul
ddH2O 33.5ul
11.琼脂糖胶回收。
12.Qubit测值，总量足够的情况下，取3ul跑胶检测。
13.附录
T4 DNA Polymerase由于同时具有5'→3'DNA聚合酶活性和3'→5'DNA外切酶活性，可以用于将5'端突出末端补平或3'端突出末端削平。
T4 DNA Polymerase的3'→5'DNA外切酶活性对于单链DNA要比双链DNA活性更高，即单链DNA要比双链DNA 中的非配对链部分更容易被T4 DNA Polymerase所消化。
T4 DNA Polymerase的3'→5'外切酶活性比Klenow Fragment要高约200倍。
DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段) 是 E. coli DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物，具有 DNA 聚合酶活性和3' →5' 核酸外切酶活性，但缺失了5' →3' 核酸外切酶活性。
Klenow 既保留了全酶的高保真性，又不会降解 DNA 5' 末端。
注意：由于该酶具有3' →5' 核酸外切酶活性，升高反应温度、加入过量的酶、未加入 dNTP 或反应时间过长均会导致 DNA 末端碱基被切除形成凹陷。
T4 多聚核苷酸激酶能够催化磷酸在 ATP 的γ-位和寡核苷酸链 (双链或单链DNA 或 RNA) 的 5′-羟基末端以及 3′-单磷酸核苷间进行转移和交换，1 个Richardson 单位，指 37℃条件下，30 分钟内1 U催化 1 nmol 酸不溶性 [32P] 掺入所需要的酶量。
Klenow 片段（3´→5´exo- ）是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物。
它保留了 DNA 聚合酶活性，但失去了5´→3´ 外切核酸酶活性。
该酶经突变（D355A, E357A）去除了其3´→5´ 的外切核酸酶活性(1) 。
1 单位指在37°C条件下，30 分钟内能使
10 nmol 的 dNTPs 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。
注意：Klenow 片段（3´→5´exo
-）因去除了3´→ 5´ 外切酶的活性，故不适宜用于生成平末端的反应。
当用于双脱氧法 DNA 序列测定时(3) ，建议用1 unit/5 μl 反应体系。