临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法
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临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
过晚都可能会出现假阴性结果）
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。 在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊
血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。 RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
痰
痰属于分泌物 , 临床上常用作为结核杆菌 DNA 测定 标本。 痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时, 需对样本进行初步处理，即用 1 mol/L NaOH 或变 性剂液化。 如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标 本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀， 促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉 淀物即可用于核酸提取。 液化标本如不立即用于核酸提取 , 可保存于 -70℃ 下。
20000g室温离心5min取5ul用于PCR扩增
痰标本处理简单模式
试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50μg蛋白 酶K和0.05% Triton X-100
50ul痰 6000g离心10分钟，弃上清 加入裂解液50ul，60℃温育30min 90℃温育30min 加入Tris-HCl中和以上反应混合物 取5ul用于PCR检测
痰标本处理的基本模式
通用模式
简单模式
痰标本处理通用模式
（1）通用标本处理（Universal sample processing, USP） 溶液： 4-6 mol/L盐酸胍（GuHCl） 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5 25 mmol/L EDTA 0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl ） 0.1~0.2 mol/L β-巯基乙醇。 （2）0.05%Tween 80。 （3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20)
标本运送
样本一经采集，则应尽可能快的送至检测 实验室。 样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA 测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA 测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或 邮寄。 实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种 临床样本的运送条件作出相应的规定。
临床标本的处理和保存
一定体积的痰 1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s 10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min 5000g室温离心10-15min，弃上清 500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬
20000g室温离心10-15min，弃上清 加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min
棉拭子
在使用 PCR 方法检测性病病原体时 , 临 床标本一般为棉拭子 , 可将棉拭子置于 适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温 静置 5 ～ 10 分钟 , 待大块状物下沉后 , 取 上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。 如不立即用于核酸提取 , 则需保存于 70℃下.
脓液
脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核 杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本 的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心 ,沉淀用生理盐水 洗2～3次后,即可用于DNA提取。 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本 ,如过于粘 稠 , 则加入适量生理盐水 ,充分振荡后 , 静置 , 取上 清立即离心 , 沉淀用于 DNA 提取 ; 如为水样 , 则按 上述直接离心取沉淀即可。
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可 使用肝素。 全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
源自文库周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液 , 裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。 外周血单个核细胞如暂不提取核酸 , 可保存 于-70℃下.
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否
临床PCR检验操作中最易出问题的环节
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
过晚都可能会出现假阴性结果）
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。 在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊
血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。 RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
痰
痰属于分泌物 , 临床上常用作为结核杆菌 DNA 测定 标本。 痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时, 需对样本进行初步处理，即用 1 mol/L NaOH 或变 性剂液化。 如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标 本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀， 促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉 淀物即可用于核酸提取。 液化标本如不立即用于核酸提取 , 可保存于 -70℃ 下。
20000g室温离心5min取5ul用于PCR扩增
痰标本处理简单模式
试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50μg蛋白 酶K和0.05% Triton X-100
50ul痰 6000g离心10分钟，弃上清 加入裂解液50ul，60℃温育30min 90℃温育30min 加入Tris-HCl中和以上反应混合物 取5ul用于PCR检测
痰标本处理的基本模式
通用模式
简单模式
痰标本处理通用模式
（1）通用标本处理（Universal sample processing, USP） 溶液： 4-6 mol/L盐酸胍（GuHCl） 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5 25 mmol/L EDTA 0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl ） 0.1~0.2 mol/L β-巯基乙醇。 （2）0.05%Tween 80。 （3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20)
标本运送
样本一经采集，则应尽可能快的送至检测 实验室。 样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA 测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA 测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或 邮寄。 实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种 临床样本的运送条件作出相应的规定。
临床标本的处理和保存
一定体积的痰 1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s 10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min 5000g室温离心10-15min，弃上清 500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬
20000g室温离心10-15min，弃上清 加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min
棉拭子
在使用 PCR 方法检测性病病原体时 , 临 床标本一般为棉拭子 , 可将棉拭子置于 适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温 静置 5 ～ 10 分钟 , 待大块状物下沉后 , 取 上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。 如不立即用于核酸提取 , 则需保存于 70℃下.
脓液
脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核 杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本 的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心 ,沉淀用生理盐水 洗2～3次后,即可用于DNA提取。 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本 ,如过于粘 稠 , 则加入适量生理盐水 ,充分振荡后 , 静置 , 取上 清立即离心 , 沉淀用于 DNA 提取 ; 如为水样 , 则按 上述直接离心取沉淀即可。
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可 使用肝素。 全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
源自文库周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液 , 裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。 外周血单个核细胞如暂不提取核酸 , 可保存 于-70℃下.
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否
临床PCR检验操作中最易出问题的环节
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或