新手Western blot步骤及注意事项

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Westernblot实验步骤及注意事项

Westernblot实验步骤及注意事项

Westernblot实验步骤及注意事项adminWesternblot 实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA),PMSF(每克组织30μl,10 mg/ml PMSF),利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃4. 加入PMSF(每克组织30μl,10 mg/ml PMSF),冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度),并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳(浓缩胶20mA,分离胶35mA)12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟)13. 膜用丽春红染色,胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。

1)转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜,将硝酸纤维素膜铺在凝胶上,用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。

2)在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸(预先用转移缓冲液浸湿),将凝胶夹在中间,保持湿润和没有气泡。

3)将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中,凝胶面向阴极。

4)将上述装置放入缓冲液槽中,并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。

5)按照厂家所示接通电源开始电泳转移。

6)转移结束后,取出薄膜和凝胶,弃去凝胶。

2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色,直至分子量标准显现时取出,记录下标准位置。

3. 用100ml水洗涤纤维素膜,必要时可用脱色缓冲液。

4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。

5. 室温下,用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。

6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中,尽可能不留空气。

蛋白印迹——western-blot-实验流程及注意事项

蛋白印迹——western-blot-实验流程及注意事项

蛋白印迹——Western blot实验流程及注意事项各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。

此外,特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。

Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。

这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上,然后用特异性配体进行检测。

特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。

印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法(如蛋白氨基端序列分析等)鉴定蛋白的一个重要步骤。

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。

催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。

化学聚合以过硫酸铵(AP)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。

在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。

浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。

WesternBlot(步骤简略,但注意事项经验总结基本原理很全面)

WesternBlot(步骤简略,但注意事项经验总结基本原理很全面)

Western Blot(步骤简略,但注意事项、经验总结、基本原理很全面)1、丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺,应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g,N,N-亚甲叉双丙稀酰胺1g,加H2O至100ml。

)储于棕色瓶,4℃避光保存。

严格核实PH不得超过7.0,因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。

使用期不得超过两个月,隔几个月须重新配制。

如有沉淀,可以过滤。

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS,1mlH2O去离子水配制,室温保存。

3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合,加水稀释到100ml终体积。

过滤后4°C保存。

4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中,用约48ml 1mol/L HCL 调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。

过滤后4°C保存。

这两种缓冲液必须使用Tris碱制备,再用HCL调节PH值,而不用T ris.CL。

5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。

PH 太低时,聚合反应受到抑制。

AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。

去离子水配制数ml,临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液:称取1g过硫酸铵,加超纯水溶解并定容至10ml,分装到1.5ml微量离心管中,冻存。

7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样,一般为20-25ul,总蛋白量100μg。

8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris,188g甘氨酸,10gSDS,用蒸馏水溶解至1000ml,临用前稀释10倍。

PH8.39、转移缓冲液:2.9g甘氨酸、5.8gT ris碱、0.37g SDS(可不加),200ml甲醇(临用前加),加水至总量1L。

WesternBlot(WB)操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查

WesternBlot(WB)操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查

WesternBlot(WB)操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查Western Blot(WB)操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查第一部分 WB操作中需要注意事项一、蛋白样品的准备1、样品质量所抽取样品的蛋白含量,蛋白变性是否充分等等,还有,蛋白样品的PH值是否在7~8之间。

这会直接影响到样品浓缩的效果。

此外,蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。

2、细胞水平要做WB,多少细胞提的蛋白够做WB一般5×106就足够3、小分子量蛋白10KD需要的注意点1)可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜,转膜时间缩短,另外可采用Tricine-SDS-PAGE 体系2)也可以选择PSQ膜,同时缩短转移时间。

也可以将两张膜叠在一起,再转移。

其他按步骤即可4、大分子量蛋白200KD需要的注意点1)做200kd蛋白的WB时要注意,分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小心2)转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)3)转膜液中甲醇含量可适当降低,推荐使用湿装转膜效率更高二、制胶1、凝胶质量不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高,分离胶的PH值应在8.8左右,而浓缩胶的PH应在6.8左右,最好不要差过0.5个PH单位,因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件,也是保证能充分压缩样品的前提。

因此,制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。

2、在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象1)加水时不能对着胶冲,要沿着玻璃板缓慢流行2)加水满后一定要保证上方水平面是平齐的3)加胶要避免气泡,也要避免加胶太慢而提前凝固等现象4)有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下三、加样1、点样样品尽量不要与电泳液混合,这样能提高浓缩的效果,因为电泳液PH值为8.3,而样品为7.5,混合后会影响到样品的PH值,进而影响浓缩效果。

Westernblot实验操作详细步骤

Westernblot实验操作详细步骤

Westernblot实验操作详细步骤1.样本制备:a.收集细胞或组织样本并加入提取缓冲液,破碎细胞或组织以释放蛋白质。

b.用超声波破碎机或搅拌器处理样本,使其彻底破碎。

c.避免加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白质的降解。

2.蛋白质分离:a.将样本加入离心管中,并用高速离心分离细胞碎片和细胞核。

b.收集上清液,其中包含溶解的蛋白质。

3.蛋白质浓度测定:a. 使用BCA或Bradford等方法测定提取的蛋白质浓度。

b.根据需要调整蛋白质浓度,以确保每个样本使用相同的蛋白质量。

4.准备SDS-凝胶:a.准备解聚凝胶和浓缩凝胶以进行垂直电泳。

b.根据需要选择合适的胶百分比和凝胶组装器。

c.制备足够的凝胶和凝胶缓冲液。

5.蛋白质电泳:a.将蛋白质样本加入加载缓冲液,并在煮沸过程中使其变性。

b.将蛋白质样本加载至凝胶槽中。

c.根据需要在凝胶中加入预定分子量标记物,以便于蛋白质分子量的确定。

d.以恒定电流进行电泳,直到预定分子量标记物到达所需位置。

6.蛋白质转膜:a.选择合适的膜材料(例如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素)。

b.用蛋白质转膜装置将凝胶上的蛋白质转移到膜上。

c.确保膜与凝胶完全贴合,并尽量避免气泡的产生。

7.阻塞和抗体孵育:a.将膜放入含有5%非脂奶粉或1%牛血清蛋白的TBST缓冲液中进行阻塞。

b.在蛋白质靶向抗体中稀释贮存液,并使用适当的稀释倍数进行孵育。

c.将膜和抗体一起放入摇床或孵育箱中,在适当的温度下进行孵育。

8.洗涤:a.用TBST缓冲液洗涤膜以去除未结合的抗体。

b.进行3至5次洗涤,每次洗涤持续5到10分钟。

9.二次抗体孵育:a.将膜放入稀释过的二抗溶液中进行孵育。

b.孵育时间和温度根据抗体种类和需求进行调整。

10.再洗涤:a.用TBST缓冲液进行大约3至5次洗涤。

b.确保彻底洗涤以去除未结合的二抗。

11.信号检测:a.使用化学发光或荧光探针对膜上的蛋白质进行检测。

b.按照探针供应商的说明进行操作。

westernblot法

westernblot法

Western blot,也称为蛋白质印迹或免疫印迹,是一种常用的生物化学技术,用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。

下面是Western blot的基本步骤和注意事项:一、实验步骤蛋白样品制备:从细胞或组织中提取蛋白质样品,常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。

蛋白定量:使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量,以便后续的Western blot分析。

凝胶电泳:将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离,根据蛋白质的大小和电荷进行分离。

转膜:将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上,以便进行后续的免疫检测。

免疫检测:使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测,抗体与目标蛋白质结合后,通过显色反应呈现阳性结果。

数据分析:对免疫检测结果进行定量和定性分析,如条带大小、灰度值等。

二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程,确保实验的正确性和可行性。

蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆,以获得更纯的蛋白质样品。

在进行Western blot分析前,要对蛋白质样品进行定量,以保证实验结果的准确性。

在转膜过程中,要选择合适的转移缓冲液和转移时间,以保证蛋白质样品的完整转移。

在免疫检测过程中,要选择合适的抗体和显色试剂,以保证免疫检测结果的特异性。

在数据分析过程中,要选择合适的分析方法和软件,以保证数据分析的准确性和可靠性。

总之,Western blot是一种常用的生物化学技术,在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。

在进行Western blot实验时,要严格遵守实验步骤和注意事项,以保证实验结果的准确性和可靠性。

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白(根据蛋白分子的大小,煮沸时间可适当变化,一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白,而不是分解,一般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的,只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。

蛋白样品变性后与SDS充分结合,SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的,100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳)。

(3)电泳i.清洗玻璃板:一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

(操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。

)(2)配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时,可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。

Western blot(蛋白印迹法)详细步骤

Western blot(蛋白印迹法)详细步骤

Western blot(蛋白印迹法)详细步骤一、组织的研磨准备:研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤:①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎,取出组织,在研钵中盛满液氮,用力敲碎组织,研磨。

②研磨过程中一旦液氮干了,立即加入液氮,保持研磨在液氮中进行,直至组织呈干粉状。

③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。

④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存,待所有组织都研磨结束后装入自封袋,于-80℃保存。

注意:1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头,在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。

2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。

3.每种样品都最好留有副管,备用。

二、裂解提蛋白准备:裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000:10=100:1若需要加入蛋白酶抑制剂,则比例一般为1:1000(即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂)步骤:①将RIPA和PMSF按比例混匀,加入到装有组织粉末的EP管中,一般加入300~500μl左右(浓度尽量高点)。

②盖好盖子,在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃,12000rpm离心10min,取上清液转移到新的离心管中,于-20℃保存。

注意:1.裂解液加入后用手指弹一下混匀,当加入量很少时,成粘稠状,有必要时应用枪头混匀。

三、BCA法测定蛋白浓度(BCA试剂盒)准备:BCA试剂盒(BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液)、酶标板、酶标仪、摇床步骤:①按1:15或1:30稀释待测样品,即取1μl样品+14μl水。

③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)根据样品数量配制BCA工作液。

④每个标准品孔加入200μl BCA工作液,样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液,充分混匀,在摇床上震荡30s,37℃放置30min,于492nm下测定OD值。

⑤标准曲线以蛋白含量(μg)为横坐标,吸光度为纵坐标,根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。

Western Blot 实验技术操作及注意事项,实验准备,样品制备,实验技巧

Western  Blot 实验技术操作及注意事项,实验准备,样品制备,实验技巧

常用的转移膜主要有PVDF膜( Polyvinylidene-
Fluoride)和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白质的结
合能力高,灵敏度高,不易破碎,同时也适用于再次标记
(PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中以增加膜的亲水性)。
✓其他注意事项
而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。
1. 从负极(黑板)到正极(透明板)方向依次:纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤
✓膜标记正反面 转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用
有色分子量 Marker或转膜后在膜上稍微剪断一个角(可 自由决定剪断方向),会有利于判断膜的方向。 ✓其他注意事项 1. 封闭时间不宜过长,封闭时间过长会抑制抗原抗体
反应及标记抗体的酶活性。 2. 注意避免让膜变干。
4.一抗反应
✓一抗的选择 抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别
1 × TBST缓冲液配制:TBS粉末,溶于2L蒸馏水中,再加入2mL TWEEN - 20。
9. Western Blot实用小技巧
9. Western Blot实用小技巧
谢谢大家
组织取绿豆粒大小(30~50 mg )组织,加入预冷的RIPA裂解液,按照质量 体积比1:10 比例加入RIPA 裂解液(PMSF和PIC 1:100 v/v )。然后予以组织匀 浆机处理,全程在冰上操作。匀浆结束后,将所有样本静置于冰上30 min,
上述裂解液离心,4 ℃ 12 000 rpm 离心 20 min 收集上清(即蛋白原液),避 免吸到沉淀。吸取10uL蛋白用于定量,剩余蛋白加入5 x loading buffer 进行充分 混匀(5 loading buffer和蛋白组织液比1:4),在98 ℃条件下加热10 min,然后进 行分装后保存于-20 ℃冰箱中。

westernblot实验步骤

westernblot实验步骤

westernblot实验步骤Western blot实验是一种常用的免疫学检测方法,适用于分析特定蛋白质的存在量、大小和结构等。

下面将介绍Western blot实验的主要步骤,以及注意事项。

1. SDS-PAGE凝胶电泳Western blot实验首先需要进行SDS-PAGE凝胶电泳。

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)是一种分离蛋白质的方法,可以根据蛋白质的大小将其分离离子定位在凝胶中相应的位置。

在SDS-PAGE中,蛋白质会被特定化学物质SDS (十二烷基硫酸钠)包裹,其带负电荷的端口相互排斥,并使蛋白质在电场中沿着凝胶运行,根据大小排序在不同位置。

2.转移蛋白质到膜上SDS-PAGE电泳完毕后,需要将蛋白质迁移到聚丙烯腈或硝酸纤维素膜上。

转移可以采用湿式或半干燥式方法,膜的种类和转移缓冲液的浓度、pH值等因素都会影响转移效果。

3.蛋白质与抗体结合膜上的蛋白质需要与浓度足够的抗体进行结合,使其出现颜色。

抗体可以是多克隆或单克隆抗体,通常由动物免疫学制备而成。

在结合抗体之前,膜需要被阻断,以避免非特异性的背景信号。

4.识别蛋白质识别特定蛋白质需要使用标记有酶、荧光体或放射同位素等的二抗或底物。

蛋白质与特定抗体形成复合物后,可以使用二抗结合在蛋白质与一抗之间。

底物是标记于蛋白质特定抗体上的酶,在底物的作用下,可生成可见信号,如液态手套(ECL)。

注意事项:1.蛋白质的提取和纯化,提取方式会影响到实验结果,选择适当的提取方法是十分重要的。

2.涉及到蛋白质电泳和转移过程,准确控制电泳时间和电压,转移条件、时间以及温度都会影响转移效果和转移后的后续步骤。

3.在结合抗体前,必须阻断膜上的未被结合的蛋白质,减小背景信号。

通常使用酵素或乳清蛋白等物质进行阻断,以避免非特异性结合。

4.选择合适的底物,控制反应条件,避免过度堆积或实验时间不够导致底物显色偏低。

Western Blot 实验步骤及注意事项

Western Blot 实验步骤及注意事项

Western Blot 实验步骤及注意事项western blot的实验步骤及注意事项一、实验步骤1.缓冲液配制(1) Transfor Buffer: 2.9g Glycine, 5.8gTris, 0.37g SDS(可不加), 200ml Methanol(临用前加),ddH2O to 1L(2)10×TBS: 1 M Tris・HCl(pH 7.5)100 mL, 88 g NaCl, ddH2O to 1L (3)TBST: 1×TBS中加入1/1000的Tween (4)封闭液:脱脂奶粉5%(w/v),用TBST配制 2. SDS-PAGE电泳电压:积层胶电泳电压80V左右,分离胶电泳电压110V~120V 3.免疫印迹(1) SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳结束后,将胶放至转移缓冲液中浸泡15m in,切6张Whatman 3mm滤纸和1张PVDF膜,与凝胶大小相符合。

将PVDF膜事先用甲醇浸泡,再用转移缓冲液浸泡。

(2) 将凝胶及PVDF膜以“三明治”状(即3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸)逐层铺于转印仪上,凝胶一面连接阴极,100 V转移40 min(根据转移蛋白的分子量确定转移时间)。

(3) 将膜放入小盒中,加入5 mL封闭液,摇床上温育1 h。

(4) 以1/1000的比例,加入5 μL第一抗体,4 ℃温育过夜。

(5) TBST溶液洗膜10 min,轻倒,重复3次。

(6)加入 5 mL TBST溶液,以1/2000的比例,加入2.5 μL第二抗体,温育1 h。

(7) TBST溶液洗膜5min,轻倒,重复3次。

(8)加入2 mL显色底物温育3 min,将薄膜封入保鲜袋中,压平,尽可能不留空气,滤纸吸干显色底物。

放入夹板中。

(9)配制显影液和定影液。

暗室操作:将X光片放入夹板中,曝光5 s(根据荧光强度确定),然后放入显影液中,至出现明显的条带取出,水洗后放入定影液中,定影一段时间,取出用水冲洗干净。

western blot技术的原理方法注意事项

western blot技术的原理方法注意事项

western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术,其基本原理是蛋白质的印迹技术,即把蛋白质从复杂的样品中分离出来,并转移到固相支持物上,再与特异性抗体结合,通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。

二、方法1.样品处理:首先,需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。

根据样品性质,可以采用不同的提取方法,如细胞裂解液、组织匀浆液等。

2.凝胶电泳:将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中,通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。

3.免疫反应:将膜上的蛋白质与特异性抗体结合,形成抗原-抗体复合物。

4.显色反应:通过化学反应,使抗原-抗体复合物显色,便于观察和拍照。

5.电子显微镜观察:对于较小的样品,可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。

三、注意事项1.样品处理:提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度,避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。

2.凝胶电泳:分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行,以确保蛋白质能够完全分离。

同时,应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数,避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。

3.免疫反应:应注意抗体滴度的选择,确保抗体能够充分识别目标蛋白质。

同时,应避免使用过期或质量不佳的抗体。

4.显色反应:应注意显色试剂盒的质量和操作步骤,确保显色反应充分且颜色易于观察。

同时,应注意显色颜色的稳定性,避免因颜色不稳定影响结果判断。

5.电子显微镜观察:应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护,确保电子显微镜能够正确成像。

同时,应注意样品的制备和处理,确保样品能够被电子显微镜准确观察。

6.实验条件:实验过程中应注意调整实验条件,如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等,以确保实验结果的准确性和可靠性。

7.重复性:在进行Westernblot实验时,应注意重复性实验的开展,以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。

总之,Westernblot技术虽然复杂,但只要掌握了其原理和方法,并注意以上注意事项,就能够获得准确可靠的结果。

Western Blot 操作步骤(优化后)

Western Blot 操作步骤(优化后)

Western Blotting SOP一、SDS-PAGE1清洗玻璃板:一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗涤剂轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

用前用酒精干燥。

2灌胶与上样:(1)、玻璃板对齐,放好胶条,然后垂直卡在架子上准备灌胶。

(操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。

)(2)、配分离胶:加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时,可用枪吸取胶沿玻璃注入,待胶面升到中间线偏高时即可。

然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快。

(灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速度。

操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢,否则胶会被冲变型。

)(3)、当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了(约30min)。

胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

(4)、配5%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。

待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

(5)、去掉胶条并用水冲洗一下加样孔和胶底部,以去除未聚合的丙烯酰胺,将其放入电泳槽中。

(小玻璃板面向内,大玻璃板面向外。

若只跑一块胶,那槽另一边要垫一块玻璃板。

)(6)、蛋白的溶液体积即为上样量。

取出上样样品至0.5ml离心管中,加入一份4×SDS和3份蛋白样品。

上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。

(在缓冲液中加样。

)(7)、加足够的电泳液后开始准备上样。

(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。

)用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。

将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。

(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。

加入下一个样品时要换枪头以免交叉污染。

维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项

维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项

维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项WesternBlot实验方法及注意事项实验原理:WesternBlot印迹方法,又称为免疫印记,是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对不同分子量的蛋白质进行分离,并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物(NC膜或PVDF膜)上,用抗靶蛋白的非标记抗体(一抗)与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合,再与经辣根过氧化物酶标记(偶联)的二抗结合,最后用ECL超敏发光液试剂检测。

如果转印膜上含有靶蛋白,经X光片曝光、显影后,则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。

实验材料:分离胶及积层胶溶液、水饱和异丁醇、1×Tris?Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物、1×SDS电泳缓冲液、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件、0.75mm封边垫片、0.75mm样品梳子、50μl微量加样器、恒流电源常用试剂:1)30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml 水中,加热至37℃溶解之,补加水至终体积为100ml。

0.45μm 微孔滤膜过滤除菌,查证该溶液pH应不大于7.0,置棕色瓶中保存。

小心:丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收,其作用具有累积性。

称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。

可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能含有少量未聚合材料。

2)4×Tris?Cl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L),用1mol/L调节pH 至8.8,补加H2O至体积500ml。

用0.45μm滤膜过滤溶液,再加入2g SDS[0.4%(w/v)],于4℃可保存1月。

3)4×Tris?Cl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L),用1mol/L调节pH 至6.8,补加H2O至体积100ml。

western blot02-------biotnt wb一般操作流程及注意事项

western blot02-------biotnt wb一般操作流程及注意事项

Western blotting一般操作流程及注意事项Biotnt技术中心1.检查仪器及试剂检查各仪器是否完好可用,各试剂是否在使用期限内,各耗材是否准备充分。

2. 样本前处理及蛋白定量将保存好的样本(注意避免反复冻融)取出,用剪刀和镊子将其剪成实验所需大小,置于离心管中,在管壁上标识样本名称,注意取不同样本时的取样工具要在PBS中清洗,避免交叉污染,在天平上称量样品重量,记录,根据所称重量加入5倍体积的单去污裂解液,用电动匀浆机进行匀浆,在匀浆不同样本时要在PBS中清洗,避免交叉污染,匀浆后在离心机中12000转离心15分钟,取上清液测定蛋白浓度,(注意要尽快测蛋白浓度防止降解),测定用BCA试剂盒,做法依说明书所示。

3. 蛋白变性将测好蛋白浓度的样本进行均一化处理,按照测量蛋白浓度的结果,以样本中最小蛋白含量为参照值,拉平所有样本蛋白浓度,计算在16ul体系下需要加的样本和补足的缓冲液的体积数,(若需要多次试验则准备160ul体系的各体积数),置于90℃金属浴中15分钟。

变性结束后,及时保存好样本,供后续试验使用。

4. 电泳4.1配胶将配胶用的玻璃板置于有洗涤剂的清水中(每周一换)用棉条轻轻擦拭(不可用布,防止划伤玻璃),洗好后用清水冲干净,标准是在玻璃板面上有凝聚的水珠而非大滩的水渍,在操作台上铺一层纸巾,将两块玻璃板放在纸巾上,互相结合面朝上,用吹风机吹干板上水珠,若有残留,用纸巾将水珠点干,避免大面积擦拭划伤玻璃。

手持已经干燥的玻璃板,注意手持玻璃板边缘,将其重合好后,置于制胶器中,用楔子固定,注意观察两玻璃底面与制胶器底部是否水平,缝合良好,将做好的制胶器置于制胶架上,(制胶架擦拭干净),固定时将两侧的固定轴同时往里挤压,然后双手同时顺时针转动至所需标的角度上(1.0mm的胶转至1.0mm刻度以此类推),听到双手转至咔的一声,固定结束。

配置分离胶,按照试剂配置表,准备好相应的试剂,注意试剂的保存条件,配胶时要迅速,防止时间过长凝胶,若温度过低导致试剂沉淀,凝结,则需在37℃水浴中将其混合均匀,配好后,用900ul的枪在一面玻璃板上加5枪,注意加的时候要缓慢加,避免漏胶,避免混入气泡,然后用枪在板面各处滴加水滴压胶,至与板面水平,制好后等待20分钟以便凝胶,若温度过低,需要置于室温20℃环境中凝胶,或者延长凝胶时间。

Western-blot的原理、操作及注意事项

Western-blot的原理、操作及注意事项

Western blot的原理、操作及注意事项原理:通过电泳区分不同的组分,并转移至固相支持物,通过特异性试剂(抗体)作为探针,对靶物质进行检测,蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点,可检测到低至1~5ng(最低可到10-100pg)中等大小的靶蛋白。

一、抗原的选择和制备A:样品的制备1 组织:组织的处理方法:组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS,0℃研磨,加入5×STOP buffer,180W,6mins,0℃超声波破碎,5000rpm,5mins 离心,取上清。

加入β-ME(9.5ml加入0.5ml),溴酚蓝(9.5ml加入0.5ml)煮沸10min,分装后于-20℃保存,用时取出,直接溶解上样。

2 细胞:细胞的处理方法:离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer,收集,180W,6mins,0℃超声波破碎,5000rpm,5mins 离心,取上清。

加入β-ME(9.5ml加入0.5ml),溴酚蓝(9.5ml加入0.5ml)煮沸10min,分装后于-20℃保存,用时取出,直接溶解上样。

3 分泌蛋白的提取(特例):直接收集分泌液,加入β-ME、溴酚蓝制样。

B:蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法:双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。

在需要快速,但不很准确的测定中,常用此法。

硫铵不干扰显色,这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。

双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键,以及酪氨酸残基络合,形成紫蓝色络合物,此物在540nm波长处有最大吸收。

双缩脲法常用于0.5g/L~10g/L含量的蛋白质溶液测定。

干扰物有硫醇,以及具有肽性质缓冲液,如Tris、Good缓冲液等。

可用沉淀法除去干扰物,即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质,然后弃去上清液,再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。

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Western Blot操作步骤及注意事项【原理】Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

【试剂及配制】1、SDS-PAGE试剂:见试剂盒说明书。

2、电泳缓冲液Tris(分子量121.14)3.03g甘氨酸(分子量75.07) 18.77gSDS 1g蒸馏水定容至1000ml溶解后室温保存,可配制成10X电泳缓冲液进行保存(Tris、甘氨酸、SDS用量X10倍,蒸馏水定容至1000ml)。

电泳缓冲液使用2~3次后推荐更换。

3、转膜缓冲液湿转法48mmol/L Tris 2.375g39mmol/L 甘氨酸11.25g0.0375% SDS 0.375g加少部分蒸馏水溶解20% 甲醇200ml蒸馏水定容至1000ml溶解后室温保存,可配制成10X转膜缓冲液(不含甲醇)进行保存(Tris、甘氨酸、SDS用量X5倍,蒸馏水定容至500ml,或按10倍用量定容至1000ml等;用时取100ml,加入200ml 甲醇再加蒸馏水稀释至1000ml)。

使用转膜缓冲液时注意室内通风。

转膜缓冲液用于转膜一次后,建议更换新转移缓冲液,旧转移缓冲液可用于转膜前浸泡物品。

4、TBS缓冲液1mol/L Tris·HCl(pH7.5)10mlNaCl 8.8g蒸馏水定容至1000ml配制后室温保存,可配制成10XTBS缓冲液,使用时稀释10倍。

5、TBST缓冲液(洗膜液)20%Tween20 1.65mlTBS 700ml混匀后即可使用,现配现用,因含Tris缓冲液,其PH易受空气中二氧化碳影响,此外注意使用时不要直接接触到皮肤,其有致癌作用。

6、封闭液脱脂奶粉5gTBST 100ml【蛋白质样品制备】具体步骤参考RIPA试剂盒的说明书。

蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步,样品制备是关键步骤,要求尽可能的获得所有蛋白质,应注意以下问题:(1)为防止蛋白质在样品处理过程中出现细胞破碎所致酶类修饰和蛋白降解,制备过程应在冰上操作,并加入合适的酶抑制剂。

(2)样品建议分装成合适的量(比如分装出20ul检测蛋白质定量用),然后保存于-20°或-80℃中长期保存,但要注意不要反复冻融,因为会使蛋白的抗原特性发生改变。

(3)若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验,也就很难做出好的结果了。

除此之外loading buffer的作用也不容忽视,切莫使用不新鲜的上样缓冲液,同时在处理时也应注意将样品与loading buffer混合均匀。

(4)为确保蛋白浓度在合适范围内,应注意加入裂解液的量,适度稀释蛋白。

【蛋白质定量】具体步骤参考BCA试剂盒说明书。

BCA定量测吸光度后,用EXCEL作曲线,计算出不同样品蛋白含量(或大致估算出蛋白含量),再加入适量体积的loading buffer稀释样品至一定浓度(以确保等体积上样时不同样品蛋白质含量相似),上样前需将样品置于烧杯内,将烧杯置于石棉网上用加热器加至沸腾,在沸水中煮3~5min使蛋白充分变性。

之后样品可在4℃冰箱内短期保存或在-20℃冰箱内保存半个月至一个月,应避免反复冻融。

【SDS-PAGE电泳】1. 清洗玻璃板:蘸点洗洁精轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在架子上晾干(为省时间也可用吹风机吹干)。

若不继续使用,需用无水乙醇擦拭后晾干再妥善收起来,用保鲜膜包裹玻璃板封存。

梳子应用自来水洗干净后再用蒸馏水冲洗,临用前(用无水乙醇擦拭)晾干。

2. 灌胶与上样①玻璃板对齐后放入夹板固定卡紧(两块玻璃板的下缘不可有错位缝隙,若有明显的缝隙可能会导致漏胶)。

然后放置于做制胶器上根据玻璃板间隙宽度选择压的程度并准备灌胶(操作前建议先往玻璃板间灌水,检查是否漏)。

②按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置,试剂中AP和TEMED是促凝剂,在最后顺序加入,之后用1ml枪吹吸摇匀即可灌胶。

配制凝胶时要充分混匀,此外应保证试剂的新鲜,特别是过硫酸铵。

灌胶时掌握好速度,避免气泡产生(注意浓度越小的胶含水越多,凝固后胶体积缩小越多)。

分离胶加至小玻板2/3宽处,大约在插入梳子的下缘1cm 处,然后立即在胶上加水,液封后的胶凝的更快(灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速度。

操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢,否则胶会被冲变形)。

未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护。

③当水和胶之间有一条折射线时(或配胶后管内剩余的分离胶差不多凝了),说明胶已凝了。

再等几分钟觉得差不多的时候就可倒去胶上层水并用移液枪或吸水纸将水吸干。

聚合时间由AP以及TEMED决定,通常在10min左右,AP不新鲜会导致聚合变慢,气温较低时胶是会凝得慢一些,必要时可适当增加AP以及TEMED的量,但通常不会超过30min,若超过30min甚至更长仍未聚合,应检查配制的操作有无错误。

由于TEMED催化AP释放相关化学基团,再由AP释放的基团催化Acr/Bis聚合,所以如果AP不新鲜的话加再多的TEMED 效果也不佳,故已配制好的AP一般分装并-20℃保存。

④按说明书配浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶,如果液面上有气泡,则继续缓慢加浓缩胶使液面逸出同时将枪头朝一个方向将液面上方的气泡刮向角落,刮去气泡后将梳子插入浓缩胶中。

梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡产生,可先将梳子接触到液面,使其润湿,再插入,同时注意要水平插入。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

⑤趁浓缩胶聚合的时间里或在之前,可将样品从-20℃中取出置于-4℃解冻,若样品长时间未使用,加样时注意混匀。

⑥待到浓缩胶凝固后,往两胶间的内槽中加电泳液使其没过加样孔,之后两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出,即可开始加样。

加样前可用5ml注射器先冲洗一下加样孔,避免有碎胶等杂物存在于加样孔;若上样孔有变形,可用适当粗细的针头拨正。

一般在第一个孔加入marker,之后用适当量程的移液枪吸取适量样品加入所需加样的孔内,注意加样时从孔的上方缓慢伸入液面下孔内,用枪头时注意不要插得太用力太深,否则容易把玻璃板撑开,样品就落到胶和玻璃板之间的空隙了,此外加样时不要过快避免样品被冲出加样孔。

⑦浓缩胶配好后也可先不加样,保鲜膜封好后于4℃保存,1~3天内使用。

3、电泳从制胶器上取下凝好的胶板,将胶板置入电泳槽中,加入电泳液,注意电泳槽内的电泳液不要加太满,应低于内槽里的电泳液面水平2cm左右。

电泳时间和电压没有标准,按照实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作。

当电泳至marker及样品被压成一条直线并即将进入分离胶或marker有分离趋势时即可转换电压,电泳至溴酚蓝刚跑出或即将跑出即可终止电泳,进行转膜。

为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接转膜。

电泳时可将电泳槽至于冰水中浸泡,避免电泳时温度过热影响目前转换电压:80V转至120V。

时间不确定。

【湿法转膜】1、在电泳结束前20min左右开始准备转膜所需要的东西。

先准备一个托盘,在其内倒入适量转移缓冲液,随后将电泳槽夹板、海绵放入其中浸泡,同时准备好洁净的培养皿(或其它容器)。

2、为了防止在没有电场的情况下蛋白条带的扩散,转膜操作要尽快。

3、取出玻璃板,用硬卡片将玻璃板撬开,翘的时候动作要适度力度适中,注意玻板比较脆弱。

撬开玻板后,将浓缩胶轻轻刮去,避免刮破分离胶,随后按照需要切胶(为避免胶干可加些转移缓冲液在胶上),保留下需要的部分(表面一般为长方形),用尺子量出长宽并记录,随后将膜放入托盘内。

按照长宽剪取两块厚滤纸和一块PVDF膜(先剪好两块滤纸,再根据滤纸大小剪膜,使膜比滤纸稍微大一点点,避免转膜时滤纸过大相互接触而引起短路)。

滤纸剪好后,放入托盘内转移缓冲液中泡10min左右;膜剪好后,放入盛有甲醇的培养皿中泡1~2min(活化膜上的正电基团,使其更容易与带负电的蛋白质结合),随后将膜转入盛有蒸馏水的培养皿中泡至其沉底(3min左右),最后将膜放入盛有转移缓冲液的培养皿中浸泡待用。

4、打开夹板,将夹板的黑色面(代表阴极)朝下放置,在黑色面上放置一块海绵,再将一块滤纸放在海绵上,随后将胶小心铺在滤纸上,用硬卡片轻轻刮一刮赶气泡,随后镊子夹取PVDF膜铺在胶上,硬卡片刮一刮,之后再铺一层滤纸,最后铺上一层海绵,将夹板阳极透明面盖上夹紧(注意铺完最后一块海绵时不能使滤纸胶膜的相对位置移动,若有移动则需重新操作)(形成阴极黑色面—海绵—厚滤纸—胶—膜—滤纸—海绵—阳极透明面层次,注意赶气泡,注意阴阳极),随后插入电泳槽中。

滤纸在浸泡后容易胀大,若大于膜,则需用剪刀再做修整,此外,铺滤纸之前可捏一捏滤纸,确保滤纸全部被浸透而无气泡。

将膜铺于胶上时,为避免产生气泡,可通过多加转移缓冲液使胶被浸没(或者镊子夹住膜的一端,使膜与胶呈一定夹角缓慢放置)。

5、将夹板固定好后插入电泳槽内,向电泳槽中加转移缓冲液,转移缓冲液应浸没夹板,盖好电泳槽盖子,随后将电泳槽置于冰水中浸泡即可开始转膜。

转膜条件:电流200mA 时间1h20min(电压适当调高些,否则无法达到电流200mA的条件),时间可依据蛋白分子量大小及转膜情况做适当调整。

【免疫杂交反应及显影】1、预先准备盛有TBST的平皿,转膜结束后,取出PVDF膜,在靠近marker的一侧上方或下方剪一个小三角,以区分膜的正反面(以贴近胶的那一面称为膜的正面),同时注意镊子夹取膜的时候尽量夹膜的边角。

若未见marker条带,可将膜在20%甲醇中泡一下,随后对着白透射光线看,若蛋白转在膜上则可依稀看到透明的蛋白条带,用于观察电泳效果和转膜效果。

2、将膜正面朝下放入盛有PBST的平皿中,摇床摇洗3次,每次5min,转速80r/min。

3、随后将膜夹入盛有封闭液的平皿内,此时可将膜的正面朝上,摇床摇动封闭2h,转速80r/min(封闭是为了封闭膜上的蛋白吸附位置,这样抗体才能够特异结合到目的蛋白上)。

4、封闭完毕后,将膜正面朝下放入盛有PBST的平皿中,摇床摇洗2次,每次5min,转速80r/min。

5、摇洗后,将膜正面朝下置于盛有一抗的一抗孵育盒中(若一抗足够最好正面朝上),摇床震荡孵育15min(80r/min),随即放入4℃冰箱中静置过夜孵育。

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