荧光分析法.ppt

续前 荧光分析法分类：根据光源不同进行分类
激发光源
紫外－可见光
X射线
原子特征谱线
荧光分析法
分子荧光法（Molecular Fluorometry) X射线荧光法（X-ray Fluorometry) 原子荧光法（Atomic Fluorometry)
荧光分析法与可见紫外吸收光谱比较
相同点 本质
不同点 灵敏度 选择性
荧光光谱的特点（重点）
（1）斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发波长。 原因：无辐射跃迁能量损失，包括振动弛豫和内部能量转换等
（2） 荧光发射光谱的形状与激发波长无关 原因：电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产 生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能 级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如图)。
③溶剂粘度σ ↑ ，φf↑，F↑
续前
给电子基团
3、pH影响 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
4、荧光熄灭的影响 荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度 降低或熄灭的现象。引起荧光熄灭的物质为荧光熄灭剂
常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化 合物、重氮化合物、羰基化合物。
ν=4
ν=3 ν=2 ν=1 ν=0
ΔEΔΔ4EE3 2 ΔE1
S0
蒽的能级跃迁图
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11.2.3 分子结构与荧光的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构：结构中有共轭π→ π*产生的K带，
能吸收紫外-可见光
（2）具有一定的荧光效率（）： 荧光效率（）：
发射的光量子数
吸收的光量子数
磷光
续前 1、振动弛豫（vibrational relexation）
过程：从电子激发态的某一振动能级以非辐射跃迁的方式， 回到同一电子激发态的最低振动能级的过程为振动驰豫
特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁；时 间约10-12秒。
或
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续前 2、内部能量转换（internal conversion) 过程：当两个电子的能级非常靠近，以致其振动能级有重叠 时，电子常常由高电子能级以非辐射跃迁方式转移至低 电子能级，这种过程称为内部能量转换 特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有 重叠；时间约10-1～10-13秒。
或
续前
注：
处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量 转换，均回到第一激发态的最低振动能级
过程：振动弛豫→内部能量交换→振动弛豫
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续前 3、体系间跨越（intersystem crossing)
过程：处于激发态的电子自旋方向发生改变，而使电子能级的 多重性发生变化的过程
特点：激发单重态与激发三重态振动能级重叠时，产生体系间
激发光谱 激发光谱
荧荧光光光光谱 谱
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续前 5、磷光（phosporescence）
过程：电子由三重态的第一激发态最低振动能级跃迁到基态的 任一振动能级而发射的光量子为磷光
特点：发生在激发三重态最低振动能级与基态之间。分子在三 重态的最低振动能级上可以存活一段时间，发射时间约 为10-4～10 s。
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续前
苯
λex=205nm λem=278nm Φf=0.11
萘
286nm 321nm 0.29
蒽
356nm 404nm 0.36
联苯φf=0.2
芴φf=1.0
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11.2.4 影响荧光强度的外界因素
1、温度：低温，φ f↑。 原因：温度T↑，分子运动加快， 磁撞几率↑无辐射跃迁↑
2、溶剂： ①溶剂介电常数↑，极性↑，n→π *,Δ E↑,φ f↓，λ ↓ π →π * Δ E↓,φ f↑，λ ↑ ②溶剂含重原子或溶解氧（CBr4等)，体系间跨越↑。 使φf↓，甚至熄灭。
续前
跃迁类型的比较
跃迁类型 基态→激发单重态S*
所需能量
大
自旋方向 跃迁几率
不变 接近于1
基态→激发三重态T* 小 改变
10－6（光学禁阻）
续前
二、荧光的产生
处于激发态的分子返回到基态共有以下几种途径：
回基态途径
无辐射跃迁
1
2 36
振动 弛豫
内部能 量转换转换
辐射跃迁
45
荧光
物质发射某一波长荧光所得的光谱。 方法：固定发射光波长λ em，依次改变激发波长λex，测
荧光强度F，以F-λ ex作图得荧光物质的激发光谱。 发射光谱：（荧光光谱）固定激发光波长λ ex，依次改变发射
波长λ em，测荧光强度F，以F-λ em作图得荧光光谱。
激发光谱与荧光光谱上的λmax是定性定量的依据
22 多重性 M 1
三重态：两电子自旋方向相同， 自旋量子数分别为 1 和 1
22
triplet state 总自旋量子数 S 1 1 1
22 多重性 M 3
续前 基态单重态S0
能
π*
量
激发单重态S*
π* π*
激发三重态T
π
π
π
A
B
C
单重态和三重态电子分布
A：基态单重态 B：激发单重态 C：激发三重态
• 基本理论：溶液荧光光谱的特征；物质发射荧光的条件；荧光 定量分析的依据、条件及方法
• 熟悉：影响荧光强度的因素（分子结构和外界条件）
了解
• 荧光分析仪器
（1）光电荧光计
高压 汞灯
将不需要
低荧光的玻
的光滤去
璃或石英制
成，四面透
第
一
透 镜
滤 光
光。 样 品 池
片
高压Hg灯， 产生线光谱
电表 光电荧光计光路图
第二滤光片
光电 管
只让荧光
照射到检 测器上
续前 （2）荧光分光光度计
氙灯
样品 池
检测器
荧光分光光度计光路图
•固定激发波长λex ，扫描荧光光谱，找荧光光谱λmax 。 •固定荧光光谱λmax，扫描激发光谱，找激发光谱λmax 。 •固定激发光谱λmax 。扫描荧光光谱，找荧光光谱λmax 。
荧光 分子光谱 发射光谱 10-8~10-10g/ml
高
可见紫外 分子光谱 吸收光谱 10-5~10-7g/ml
一般
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11.2 基本原理
11.2.1 分子荧光光谱的产生 11.2.2 激发光谱与发射光谱 11.2.3 分子结构与荧光的关系 11.2.4 影响荧光强度的外部因素
11.2.1 分子荧光光谱的产生
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱(b)
激发320nm
激发350nm
荧光448nm
荧光光谱
瑞利光320nm
散射光谱
拉曼光360nm
瑞利光350nm 拉曼光400nm
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11.3 荧光定量分析
1、荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光干扰。
受激后，可在各个方向发 射荧光，在透过光的方向 不易测定F。
荧光效率只能为0～1 荧光效率低的物质可能有强的紫外吸收，但所吸收的能量
以无辐射跃迁的方式释放，不出现荧光发射；
2.分子结构对荧光的关系 （1）跃迁类型：
→ *是强吸收带，电子跃迁几率大，荧光效率高； n → *是弱吸收带，电子跃迁几率小，产生的荧光极弱；
（2）共轭效应：
提高 → *共轭度，有利于增加荧光效率，并产生红移
入射光 I0
透射光 I
2、荧光强度与浓度关系：（稀溶液）
F 荧光
荧光强度F与溶液吸收光能的程度以及溶液中荧光物质的量子
效率有关。
若荧光物质浓度很小，满足Ecl<0.05时，荧光强度与荧光物质
浓度成正比
F = k (I0 - I)=KC
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11.4 荧光分析技术及应用
1、荧光仪器简介：
四个部分：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。
续前
（3）荧光光电计与荧光分光光度计的比较
激发光源 激发单色器 发射单色器
检测器
样品池
光电荧光计 荧光分光光度计
汞灯
氙灯
第一滤光片
光栅
第二滤光片
光栅
光电倍增管
石英、玻璃池（低荧光的玻璃）
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小结： 掌握
• 基本概念：荧光、振动弛豫、内部能量转换、外部能量转换、 体系间跨越及磷光；激发光谱与荧光光谱
的跨越（S1*→T1 ）。 结果：这种跨越会导致荧光强度减弱，甚至熄灭。
续前 影响体系间跨越几率增大的因素：
含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。 原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运 动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反 转的发生。
在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生几率。
或
续前
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11.2.2 激发光谱与发射（荧光）光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
激发光（谱二：）（与激吸发收光光谱谱类与似荧）表光示光不谱同激发波长的辐射引起
续前 6、外部能量转换（external conversion)
过程：如果分子在溶液中被激发，激发分子之间、分子与溶剂 之间会发生碰撞而失去能量，这种非辐射跃迁的过程称 为外部能量转换
特点：发生在激发态的最低振动能级和基态之间；所需时间约 为10-7～10-9秒。
结果：导致荧光或磷光减弱，甚至熄灭
（3）刚性共平面结构：
刚性共平面结构，电子共轭性增加，荧光强度增大。