(整理)密度梯度离心法densitygradientcentrifugationmethod.
名词解释
1 密度梯度离心法density gradient centrifugation method在密度梯度介质中进行的依密度而分离的离心法。
各组分会依其密度分布在与其自身密度相同的液层中。
密度梯度可以离心前预先制备(如叠加不同浓度蔗糖、甘油)或在离心中自然形成(如使用氯化铯时)。
可用于分析型或制备型的离心分离。
通常分为速率区带离心和等密度离心两种方式原理不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
2信号识别颗粒signal recognition particle （SRP）在真核生物细胞质中一种小分子RNA和六种蛋白的信号识别颗粒复合体，此复合体能识别核糖体上新生肽末端的信号，顺序并与之结合，使肽合成停止，同时它又可和ER膜上的停泊蛋白识别和结合，从而将mRNA上的核糖体，带到膜上。
SRP上有三个结合位点：信号肽识别结合位点，SRP 受体蛋白结合位点，翻译暂停结构域。
SRP既能识别露出核糖体之外的信号肽并与之结合，又能识别内质网膜上的SRP 受体。
通常SRP与核糖体的亲和力较低，但当游离核糖体合成信号肽后，它便增加了与核糖体的亲和力，并与之结合形成SRP-核糖体复合体，由于SRP占据了核糖体的A位点，使蛋白质合成暂时终止。
3cellular aging 细胞老化细胞衰老(cellular aging，cell senescence) 衰老是机体在退化时期生理功能下降和紊乱的综合表现, 是不可逆的生命过程。
人体是由细胞组织起来的,组成细胞的化学物质在运动中不断受到内外环境的影响而发生损伤，造成功能退行性下降而老化。
细胞的衰老与死亡是新陈代谢的自然现象。
4 cell theory 细胞学说最初由德国植物学家施莱登（M. Schleiden）和德国动物学家施万(T. Schwann)提出的学说。
认为一切生物都由细胞组成，细胞是生命的结构单位，细胞只能由细胞分裂而来。
细胞分离-密度离心
密度梯度离心（density gradient centrifugation）是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分离。
这种分离又可分为速率沉降和等密度沉降两种。
速率沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。
等密度沉降（isopycnic sedimentation）在离心后细胞沉降于密度梯度液中与自身密度相同的密度平衡点，适用于分离密度不等的颗粒。
沉降介质应当是无毒的，可在需要的密度范围内形成梯度，pH值和渗透压可以调节，在高密度时也不粘稠，并能保持细胞或颗粒的完整性。
常用的沉降介质有哪些？你是不是马上就想到了Ficoll和Percoll，没错，那可是GE 的明星产品之一，已经畅销几十年了。
Ficoll 是聚蔗糖，常用的Ficoll-400，分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。
高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影酸钠以增加密度，就形成了平时常用的Ficoll-Paque PLUS。
Percoll是一种经聚乙烯吡咯酮涂层(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。
利用Percoll 液经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理，将密度不等的细胞分离纯化。
该法是纯化细胞、亚细胞颗粒和大的病毒的一个较好的方法，但操作流程较长，手续较多。
下面我们就对这些介质进行详细的介绍：Ficoll™ PM400Ficoll PM400是中性、亲水的蔗糖聚合物，平均分子量为40kD。
一直以来它都被用于形成密度梯度，来分离和提取真核细胞、细胞器和细菌细胞，以及分离淋巴细胞的稳定剂和分离介质。
它还可以用于制备培养基、核酸杂交、电泳和免疫研究。
Ficoll PM400的渗透压性质比蔗糖好，浓度达到50%时密度可以达到1.2 g/ml。
血液密度梯度离心
血液密度梯度离心
血液密度梯度离心（Blood density gradient centrifugation，BDGC），是一种用于分离血液中不同细胞类型的技术。
该技术基于血液中不同细胞类型的密度不同，通过采用不同密度的介质制成梯度，再将样品加入梯度中进行离心，就能使细胞按密度不同分布于梯度的不同层中，从而实现分离。
该技术广泛应用于临床检验、科研以及生物制药等领域。
BDGC可以用于分离血液中的各类细胞，如淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、红细胞等，并且还可用于富集特定的细胞亚群，如淋巴细胞的T细胞、B细胞、NK细胞等。
使用该技术分离出的纯净细胞亚群，可以用于研究这些细胞的生物学特性、功能、代谢等方面的问题。
BDGC的实验原理是将血液样品加入密度梯度离心管中，通常是由高密度到低密度浓度逐渐降低的梯度，如离心管中按高密度到低密度依次加入20%的高山黄、10%的无聚丙烯酰胺凝胶和50%的淋巴细胞分离液。
然后，将管子放入离心机中，以一定转速离心，离心时间一般在30分钟左右，待离心结束后，可以看到细胞沉积在不同梯度中的不同层中，从而进行细胞层的收集。
BDGC的优点在于该技术非常灵活，可以根据需要选择不同类型的梯度介质，并且可以调整离心条件（如离心转速、离心时间等）来达到不同的细胞分离目的。
此外，BDGC分离出来的细胞亚群纯度高，适合于进一步的实验研究和应用。
BDGC的缺点在于分离过程时间较长，需要几十分钟或者更长时间进行离心，在这个过程中需要维持离心速度、离心时间和温度等条件的稳定性。
并且离心过程也可能对细胞造成损伤，影响细胞的活性和功能。
另外，该技术的价格不菲，需要昂贵的离心设备、介质和试剂等。
密度梯度离心（density
密度梯度离⼼（density gradient centrifuge）⼀、概论在密度梯度离⼼中单⼀样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。
梯度液的密度随着离⼼本经的增⼤⽽增加。
密度梯度可以予形成，也可以在离⼼过程中⾃形成，经常，密度梯度的可以分为：速率⼀区带（Rate-30nal）离和等密度（Isopycnic）离⼼。
在速率⼀区带离⼼中混合样品的以很薄的⼀层铺在梯度液的上部，在离⼼过程中由于不同组份"颗粒"在梯度液中沉降速率的差别，⽽在离⼼的某⼀时刻形成了数个含左第⼀级份颗粒的"区带"。
离⼼过程在最垂"的样品（或者说沉降得最快的样品）形成沉殿前就停⽌了。
样品在离⼼后与梯度液⼀起收集，⽤常规技术去除梯度材料后就得了某个较纯的成份。
每个单⼀组份的沉降速率取决于它们的形状、尺⼨、密度、离⼼⼒的⼤⼩、梯度液的密度和粘性系数。
对于相类似的⽣物体组份常常形状也相似。
在速率区带离⼼中我们常常使梯度液的最⼤密度不超过样品在该梯度中浮密度。
利⽤这类⽣物组份在尺⼨上的差异的形成的沉降速率的不同，选择某⼀特定时刻，当它们中的各个纯样品区带之间的距离拉得最远时停⽌离⼼即可以达到分离⽬的。
与速率⼀区带离⼼法不同的是，等密度离⼼是依赖于样品颗粒的不同密度来进⾏离⼼分离的。
混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚⾄和梯度液混在⼀起。
最后⼀种⽅法依靠离⼼⼒来形成梯度（⾃形成梯度）在形成梯度的过程中由于样品各单⼀成份向它们⾃⼰的等密度区靠扰即达到了分离纯化的⽬的。
对于速率⼀区带离⼼，梯度液最⼤密度⼀般⼩于样品中各组份的密度，也就是说是在样品正在沉降过程中的不是在形成沉殿后来分离样品；⽽等密度离⼼法中，梯度液的初始最⼤密度常常超过样品各组份的密度，利⽤每个单⼀组份沉降或上浮到它们各⾃的等密度区来达到分离的⽬的。
密度梯度离⼼法的理论依据是（参考⽂献1）每种纯样品成份在梯度液中的沉降速度可以表达为：V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r式中V是某⼀时刻样品的沉降速度（厘⽶/秒）d：样品颗粒的直径（厘⽶），我们在初步计算时就假说样品颗粒为球体。
细胞生物学离心技术
细胞核、重线粒体、大片细胞膜 重线粒体、细胞膜碎片 线粒体、溶酶体、过氧化物酶体、完整高尔基体 线粒体、溶酶体、过氧化物酶体、高尔基膜 溶酶体、过氧化物酶体、高尔基膜、大的高密度小泡 细胞膜、高尔基体、核内体等
亚细胞成分在蔗糖和渗透压中的密度
例如：1. 线粒体、溶酶体和过氧化物酶体的分离 特征：密度差别、大小类似 选择：等密度梯度离心
将细胞在-20C以下冰冻，室温融解， 反复几次。
3.细胞结构成分的分离
一系列的差速离心＋密度梯度离心
差速离心：分离细胞器 密度梯度离心：纯化细胞器
4.离心方法的选择
根据分离细胞器的性质：
匀浆物中各类细胞器大小不同：
差速离心
匀浆物中各类细胞器大小差别较小：
移动区带离心
匀浆物中各类细胞器大小差别小，密度有差别：
特点： 介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应 大于被分离组分的最大密度( p< m ) 。 所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍， 往往需要高速或超速离心。
技术推动细胞生物学研究的光辉范例：
1974年诺贝尔 生理医学奖 -De Duve发现溶酶体 （密度梯度离心）
Albert Claude
特点：
介质为密度梯度溶液，且密度较低，介质 的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小 密度( p> m )。 必须注意离心时间(t)，不能使所有颗粒都 沉到管底。 分离介质对被分离的物质必须是中性无害的
原理：
3.等密度离心法
（isodensity centrifugation)
离心时采用包括各种颗粒密度范围的梯度介质，被分离 颗粒达到与其相同的密度介质时不再移动，形成一系列 区带，然后从管底收集。
转头类别：
3种精子优化处理方法处理精液效果评价
3种精子优化处理方法处理精液效果评价目的:为了解上游法､Percoll梯度离心法､Isolate密度梯度离心法等精子优化处理方法处理精液的效果。
方法:选取120例女性原因引起继发不孕的夫妇,将男方的精液标本按处理方法不同随机分4组,即为上游组､Percoll组､Isolate组和对照组,应用指标精子密度､a+b级活力､正常形态率和绿色荧光精子百分率,对精液处理后的效果进行比较。
结果:上游组､Percoll组和Isolate组,富集的精子a+b 级活力､正常形态率､绿色荧光精子明显高于对照组(P＜0.01),Percoll组和Isolate 组的精子密度与对照组无明显差异(P> 0.05),但上游组的精子密度很明显低于对照组(P＜0.01);上游组､Percoll组及I sola te组之间比较,富集的精子a+b级活力､正常形态率没有明显差异(P>0.05),但精子回收Percoll密度梯度离心法和Isolate 密度梯度离心法明显高于上游法(P＜0.01),Isolat e密度梯度离心法富集绿色荧光精子最多,上游法次之,Percoll密度梯度离心法最低。
结论: Isolate密度梯度离心法处理精液效果较好。
标签：精子;优化;评价Evaluation on the effect of semen processed with three semen optimized methods/D ENG Jun-yao, ZHANG Chao hui, QIN Ying jian∥Laboratory of Reproductive MedicalCenter, Hospital of Guilin Women and Children, Guilin 541000, ChinaAbstract: Objective: To investigate the effect of semen processedwith Swim up m ethod,Percoll gradient centrifugation method, Isolate density gradient centrifug ation method. Methods: 120 cases of female seco ndary infertility in couples were investigated. The m ale’s semen specimens by th e different treatme nt method were randomly divided into four groups,they were Swim up group, Percol l group, Isolate group and the control group. The parameter s with semen conventional analysis and the percentage of green fluorescent spermwith AO Fluorescence staining were compared. Results: Swim up group, Percoll g roup and Isolat e group concentrated sperm with the a + b class dynamic, the rate of normal formand the rate of green fluorescent sperm were significantly higher than that ofthe con trol group(P＜0.01). The sperm density showed no obvious difference in Per coll group a nd Isolate group compared with the control group(P>0.05). However, the sper m de nsity of Swim up group was significantly lower than that of the control group( P＜0.01) ,the sperm a + b class dynamic and the rate of normal form showed no obvious di fferen ce between Swim up group and Percoll group and Isolate group(P>0.05). Ho weve r, the sperm density of Percoll group and Isolate group was significantly higherthan that ofSwim up group(P＜0.01). The rate of green fluorescent spermof Isolate gro up was the highest among Swim up group, Percoll group and Isolate group. Conclusion: T heeffect of semen processed with Isolate density gradient centrifugation method was better in three methods.Key words: sperm; optimization; evaluation精子优化处理是辅助生殖技术治疗中的常规步骤,目的是富集足够数量具有高活力､正常形态和正常功能的精子。
密度梯度离心法分离PBMC操作流程
密度梯度离心法分离PBMC操作流程密度梯度离心法（density gradient centrifugation）是一种常用的方法，用于将外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）从全血中分离出来。
该方法通过利用血细胞的不同密度来实现分离，从而获得单个核细胞。
以下是密度梯度离心法分离PBMC的详细操作流程：1.准备所需材料和设备：包括离心管、离心机、无细胞培养基、PBS缓冲液、密度梯度离心液。
2.使用无菌的方法处理全血样本，以防止可能的污染。
3.将含有全血的离心管放置在室温下静置一段时间，使其形成明显的三明治结构，由于样本中的红细胞比其他细胞密度更大，红细胞将沉积在管底部。
4.使用无菌的方法，将全血缓慢倒入预先准备好的无菌离心管中，注意不要把红细胞底层的部分连同上层血浆一同倒入，只取上清层部分。
5.将上清层的全血样本缓慢地转移至一个新的无菌离心管中。
6.向离心管中加入与全血样本体积相等的PBS缓冲液，充分搅拌混匀。
7.将密度梯度离心液缓慢地倒入离心管中，注意避免形成气泡。
8.将离心管放入离心机中，设定合适的离心参数，如离心速度和离心时间。
一般采用400-500g，离心时间为20-30分钟。
离心完成后，你将看到细胞在离心管中形成了几个不同层次。
9.使用无菌的方法，将上清层液体小心地转移至新的离心管中。
在转移过程中，避免吸入其他层次的细胞。
10.将离心管用无菌PBS缓冲液冲洗一次，以去除残余的密度梯度离心液。
11.将PBMC的悬浮细胞沉淀至离心管底部，去除上清液。
12.向沉淀细胞加入足够量的细胞培养基，轻轻搅拌使细胞均匀分散。
13.对PBMC进行细胞计数，以确定细胞数目和浓度。
14.根据实验需求，进行后续的细胞培养、染色、分析等操作。
需要注意的是，在操作过程中，需要注意无菌操作，以避免细胞的污染和损伤。
此外，离心参数和离心时间也需要根据具体实验要求进行调整。
密度梯度离心法方法
密度梯度离心法方法嘿，咱今儿来聊聊密度梯度离心法！这可是个厉害的手段呢！你想啊，就好比我们要在一堆混杂的东西里找出特别的那一部分。
密度梯度离心法就像是个神奇的魔法棒，能帮我们把不同密度的东西分离开来。
想象一下，有一堆大大小小、轻重不一的东西混在一起，我们要怎么把它们区分开呢？这时候密度梯度离心法就闪亮登场啦！它会弄出一个像楼梯一样的密度变化，从低到高。
然后把那堆东西放进去，哇塞，就看着它们根据自己的密度乖乖地跑到该去的地方啦。
这可不像随便乱分哦！它特别精准，就像一个经验老到的分拣员，绝不会把该分开的弄混。
而且啊，这个方法用途可广啦！在生物学里，能帮我们分离细胞、细胞器啥的。
比如那些小小的细胞，它们有着不同的密度，通过这个方法，就能把它们一个一个地挑出来，是不是很神奇？咱再打个比方，这就像是在一个大混乱的舞池里，根据每个人的体重和身材，把他们分到不同的区域跳舞，让一切都变得井井有条。
密度梯度离心法就是这么厉害，能在微观世界里把那些我们需要的东西精准地分离出来。
你说这得有多牛？它能让我们看到那些平时看不到的细微之处，为科学研究打开一扇扇新的大门。
它就像是一把钥匙，能解开那些复杂谜题的关键一环。
在实验室里，科学家们可喜欢用这个方法啦！他们精心地准备好各种条件，让密度梯度离心法发挥出最大的作用。
就像一个大厨精心烹饪一道美味佳肴一样，每一个步骤都不能马虎。
而且哦，它还不断在发展和进步呢！随着科技的不断进步，密度梯度离心法也变得越来越厉害，能分离的东西也越来越多，越来越精细。
哎呀呀，这密度梯度离心法可真是个宝贝呀！它让我们能更好地了解这个世界，探索那些未知的领域。
难道你不觉得它超级厉害吗？反正我是觉得它厉害得不得了呢！希望以后它能给我们带来更多的惊喜和发现呀！。
密度梯度离心
密度梯度离心∙一种分离和分析核酸、蛋白质大分子组分的方法。
氯化铯或蔗糖等介质在离心力作用下形成一定的密度梯度。
在密度梯度介质中蛋白质、核酸大分子超速离心时,大分子的各组分分别停留在密度相等的介质区带中而得到分离。
- 来源：化学词典∙又称区带离心。
根据样品组分的密度差异来进行分离提纯的一类离心技术。
根据分离原理,可分为速率区带离心法和等密度区带离心法。
(见“速率区带离心”、“等密度区带离心”)- 来源：农业大词典∙在强大的离心力影响下,离心管中液态介质(蔗糖液、氯化铯液或硫酸铯液等)产生一个密度梯度,由此使其中待分离的生物大分子或亚细胞颗粒发生梯度沉降,从而达到良好的分离效果。
分离的原理有两种:①根据离心颗粒浮密度的大小加以分离。
颗粒在梯度介质中移动,直到颗粒的密度与周围溶液的密度相等时才停止移动,此后再离心也不离开此位置;②根据离心颗粒的大小和形状加以分离。
当待分离对象的密度比梯度溶液任一部分都大时,通过离心力,其沉降速度与它们的大小成正比,在一定的时间内,不同大小颗粒之间的距离将随离心时间的延长而增大,但不会达到平衡,故最后所有离心颗粒都将沉降至离心管的管底。
- 来源：微生物学词典Percoll∙一种硅石胶状混悬物的商品名,用于密度梯度离心- 来源：英中医学辞海∙为Pharmacia公司的一种商品名称。
它是由聚维酮(聚乙烯吡咯烷酮)包被的一种二氧化硅胶体悬液,用于等密度的密度梯度离心,可以形成<1.3 g/ml的各种密度梯度。
- 来源：英汉细胞与分子生物学词典∙派可尔- 来源：新英汉医学辞典sucrose density gradientcentrifugation∙蔗糖密度梯度离心- 来源：英汉农学词典∙下 。
密度梯度区带离心和密度梯度离心
密度梯度区带离心（Density Gradient Fractionation）和密度梯度离心（Density Gradient Centrifugation）是生物化学领域常用的分离技术，它们利用不同物质在密度梯度中的沉降速度不同的特性，将混合物中的不同成分进行有效分离。
这两种技术在生物学研究、药物开发和临床诊断等方面发挥着重要作用，广泛应用于DNA/RNA分离、蛋白质纯化、细胞分离等实验中。
在密度梯度区带离心中，样品被加载在一层密度梯度溶液上方，并通过超速离心，使得样品在密度梯度中逐渐下沉并在不同密度的带状区域中分布。
而密度梯度离心则是将样品直接混合入密度梯度溶液中，再通过超速离心，使得不同成分按照其密度在离心管中形成分层。
这两种方法都能够将混合物中的成分有效地分离出来，但在具体应用中有着各自的特点和适用场景。
在这篇文章中，我们将深入探讨密度梯度区带离心和密度梯度离心的原理、应用和优缺点，帮助你更好地理解这两种分离技术的特性和运用。
一、密度梯度区带离心的原理及应用密度梯度区带离心的原理基于不同物质在密度梯度中的沉降速度不同。
在这种技术中，样品被加载在密度梯度溶液的上方，通过超速离心，样品中的成分按照其密度在密度梯度中逐渐下沉并分布在不同密度的带状区域中。
这种分离方法广泛应用于蛋白质纯化、细胞分离和病毒粒子纯化等实验中。
关于密度梯度区带离心的优点，首先是分离效果好。
由于样品中的成分在密度梯度中逐渐下沉并分布在不同密度的带状区域中，因此可以实现成分的高效分离。
其次是操作相对简单，样品只需加载在密度梯度溶液的上方即可，不需要特殊的处理步骤。
而在应用上，密度梯度区带离心经常用于从细胞、细胞器到蛋白质的纯化，尤其在生物制药领域有着广泛的应用。
但是，密度梯度区带离心也存在着一些缺点。
首先是操作时间相对较长，离心过程需要一定的时间来分离不同的成分。
其次是可能对样品产生一定的损伤，离心过程中较大的离心力可能影响到样品的完整性。
(整理)密度梯度离心法 density gradient centrifugation method.
密度梯度离心法density gradient centrifugation method〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。
用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。
若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。
利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。
自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来，该法取得许多成果。
为得到必要的浓度梯度，多采用浓氯化铯溶液，所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名称，还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。
通常利用分析超离心机，但在将细胞颗粒成分进行分离等以纯化为目的的情况，利用密度差，使用分离超离心机，采用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。
〔2〕采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。
若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。
这种情况采用适当的编排号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。
这是与〔1〕不同的一种沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分离物这点上是有优越性的。
因多采用蔗糖密度梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。
按同样原理，也可使用分析超离心机进行测定。
方法2：纯化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度离心法，能得到比较纯的病毒。
其过程如下：1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3 次后,置- 20 ℃冰箱中,备用。
2、先以5000g离心15分钟后，获取上清夜，然后再20000g高速离心30分钟后取上清夜。
细胞生物学研究方法
差速离心（Differential centrifugation
根据离心转速的大小，分为： • 低速离心（8000转/分以下） • 高速离心（8000～25000转/分） • 超速离心（25000～80000转/分）
离心力 RCF=1.11105r n2 （单位：重力常数 g ； r 离心场半径；n 转速）
二、流式细胞术（Flowcytometry）
• 流式细胞术是用流式细胞仪（ Flowcytometer，FCM）分离筛选细胞或测 定细胞组分的一种技术
• 流式细胞仪又称荧光激活细胞分类仪（Fluorescence Activited Cell Sortor, FACS)
• 由细胞流动室、光源（激光）、信号检测器、计算机分析处理系统四部分 组成
DNA：ATGC 特异性T， 3H－TdR RNA：AUGC 特异性U， 3H－Urd 蛋白质： 3H－氨基酸（ 3H－亮氨酸等）
放射自显影技术 autoradiography
（2）暴光和显影 核子乳胶（AgBr） β射线 暴光、潜影 显影液（还原剂）Ag还原，Ag Ag处代表大分子存在的部位
细胞培养（Cell culture）
• 动物细胞培养 1. 组织块贴壁法：
将组织块剪成小块 贴在细胞瓶内 在一定的培养条件下 组织块周边的细胞不断分裂，沿着细胞壁不断生
长 原代细胞 原代细胞 传代细胞 细胞系 细胞株
细胞培养（Cell culture）
• 植物细胞培养 原生质体培养：植物的体细胞经 纤维素酶、果胶酶等处理，去 掉细胞壁后，在体外进行培养。
细胞生物学
细胞组分的析方法
第二节 细胞组分的分析方法
一、细胞组分的分离纯化技术 1、差速离心（Differential centrifugation）
细胞分离技术
细胞分离技术一、离心技术离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。
一般认为，转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ则称为超速离心机。
目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。
（一）、差速离心（differential centrifugation）在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器（图2-22）。
在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。
由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。
差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。
通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。
图2-22 速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀（二）、密度梯度离心（density gradient centrifugation）用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种（图2-23）。
密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。
分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。
图2-23 A等速度沉降，B等密度沉降1、速度沉降速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。
这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。
生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。
2、等密度沉降等密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。
密度梯度离心法densitygradientcentrifugationmeth
密度梯度离心法density gradient centrifugation method，为得到必要的浓度梯度，可采用浓氯化铯溶液，也可以采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。
不连续密度蔗糖梯度离心液一般可以采用优级纯的蔗糖用超纯水配制成百分比浓度分别为16.1%、37.4%、45%的蔗糖溶液，从离心管底部逐层向上铺设。
也有用8层Feicoll梯度离心,即在14mL离心管中由下至上从84％到35％Feicoll液，按7％递减，各加1．0mL，形成7层Feicoll 梯度。
连续密度蔗糖梯度离心液则需要用专用仪器配制。
密度梯度离心又称速率—区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法；原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。
常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度；操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。
离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带；可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。
用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。
若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。
利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。
自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来，该法取得许多成果。
细胞器的分级分离
细胞器的分级分离
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实 验用具
1、普通台式离心机：4台 2、研钵：30个 3、40ml小烧杯:30个 4、纱布：5包 5、离心管60支 6、载玻片及盖玻片见指导。
细胞器的分级分离
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一、叶绿体分离
细胞器的分级分离
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细胞中及匀浆中叶绿体
细胞器的分级分离
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叶绿体分离步骤
1、采样、洗涤、去叶脉：最好在晴天早晨10时左 右选取生长正常菠菜叶子（菜心、白菜、豌豆 也可）洗洁净，用吸水纸擦干，去柄及粗脉
由低速到高速离心逐步沉降细胞器。 先用低速使较大颗粒沉淀，再用较高转速将
上清液中小颗粒沉淀下来。
Differential centrifugation
High speed
细胞器的分级分离
Low speed
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密度梯度离心（density gradient centrifugation method ）
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Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation
细胞器的分级分离
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分析
分级分离得到组分，可用细胞化学和生化方 法进行形态和功效判定。
细胞器的分级分离
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（一）实 验材料
多叶绿菜
细胞器的分级分离
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实 验试剂
0.4M蔗糖 0.35M氯化钠（每升19.856g氯化钠）
亦称平衡密度梯度离心法。
用超速离心机对小分子物质溶液，长时间加 一个离心力场到达沉降平衡，在沉降池内从 液面到底部出现一定密度梯度。
若在该溶液里加入少许大分子溶液，则溶液 内比溶剂密度大部分就产生大分子沉降，比 溶剂密度小部分就会上浮，最终在重力和浮 力平衡位置，集聚形成大分搜集叶绿体：上清液在2600rpm离心5分 钟，弃上清液，沉淀即是叶绿体。
密度梯度离心法
离心技术是根据颗粒在匀速圆周运 动时受到一个外向的离心力的行为发展 起来的一种分离分析技术。
贝克曼库尔特离心技术发展里程碑
1947 1947 1963 1974 1976
Model E全球首台分析型超速离心机。 Model L全球首台制备型超速离心机。 Type 50 Ti全球首个钛金属转头。 Microfuge B全球首台微量离心机。 TJ-6R全球首台冷冻台式超速离心机。
如果已知粒子的沉降系数为80S的Polysome， 采用的转子的K系数是323，那么预计沉降到管
底所需的离心时间是T＝k/S＝4h，利用此公式 预估的离心时间，对水平式转子最适合；
对固定角式转子而言，实际时间将比预估的时 间来得快些。
第二节 离心机
一、离心机的分类 按转速的大小(机头的额定最高转速)分为: ①低速离心机：<10×103 r／min
即： 1S= 10-13秒 例：某物质的沉降系数是10-12秒
可写成：10× 10-13秒 表示为：10S
如：核蛋白体为 70S
细胞及细胞内某些成分的沉降系数及其离心条件
名称 沉降系数/S
RCF/g
转速（rpm）
细胞
﹥107
﹤200
﹤1500
细胞核 4×106-7
600~800
3000
（二）离心管
常用的塑料离心管: 聚乙烯管(PE)、纤维素管(CAB)、聚碳酸酯 管(PC)和丙二醇酯管(PP)等。
离心管有各种大小: 1.5ml到1000ml。
选择离心管时应考虑下列的一些性能。
1) 容量：由样品的体积决定。注意在有些应用中 （如高速离心）离心管必须装满。
密度梯度离心
细胞骨架的染色与观察
Байду номын сангаас
实验四 叶绿体的分离与观察
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate.
• 显微镜观察
B413先制片观察结构，然后再染色观察荧光；
B415先制片染色观察荧光，然后再观察结构。 • 离心机的使用 同组所有同学到齐后开始离心。 • 密度梯度 制作密度梯度时，沿管壁小心注入上层溶液，保持两种溶 液界面完好。 • 制片 要盖盖玻片，吸干多余的液体。
习
题
1．描绘叶绿体的形态结构。
Centrifugation techniques:
(1) Differential centrifugation (差速离心)
(2) Density-gradient centrifugation (密度梯度离心)
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 1st Step: Differential centrifugation
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate Fractionation (细胞组分的分级分离).
3 抗原抗体的纯化
Agarose gel electrophoresis
琼脂糖凝胶电泳 Agarose gel electrophoresis
凝胶电泳 Gel Electrophoresis
凝胶电泳 Gel Electrophoresis
双向凝胶电泳
沉降系数离心力固体颗粒的有效质量离心半径角速度的平方离心方法的种类差速离心differentialcentrifugation密度梯度离心densitygradientcentrifugation等密度梯度离心isopycnicgradientcentrifugationdifferentialcentrifugation颗粒的变形聚集差速离心differentialcentrifugationdensitygradientcentrifugation需时长操作复杂密度梯度离心densitygradientcentrifugationisopycnicgradientcentrifugation不同物质的密度范围处于梯度介质密度范围内离心后不同浮力密度物质在等密度位置形成区带不产生分离物质的共沉现象等密度梯度离心isopycnicgradientcentrifugation检测生物大分子中构象的变化基本原理盐离子对水的亲和力盐离子所带电荷的中和作用实验方法的优劣成本低操作简便安全实验方法的基本因素盐的选择种类和浓度脱盐透析超滤层析盐的选择种类和浓度低浓度盐析法高浓度盐析法透析dialysis基本原理待分离物质有机溶剂的溶解度水的极性减少带电粒子溶解度降低实验方法的优劣毒性实验方法的基本因素离子及离子浓度基本原理实验方法的优劣基本原理实验方法的优劣实验方法的基本因素有机溶剂的选择种类和浓度非离子聚合物的去除离子交换层析ionexchangechromatographyiec基本原理洗脱液实验方法的优劣离子交换层析ionexchangechromatographyiec常用离子交换剂的种类和性质阳离子交换剂含酸性电荷基团疏水性交换剂人工合成的与水结合力较小的树脂可分阳离子和阴离子交换剂
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密度梯度离心法density gradient centrifugation method，为得到必要的浓度梯度，可采用浓氯化铯溶液，也可以采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。
不连续密度蔗糖梯度离心液一般可以采用优级纯的蔗糖用超纯水配制成百分比浓度分别为16.1%、37.4%、45%的蔗糖溶液，从离心管底部逐层向上铺设。
也有用8层Feicoll梯度离心,即在14mL离心管中由下至上从84％到35％Feicoll液，按7％递减，各加1．0mL，形成7层Feicoll 梯度。
连续密度蔗糖梯度离心液则需要用专用仪器配制。
密度梯度离心
又称速率—区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法；
原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉
降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。
常用的有蔗糖、甘油；
密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度；
操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。
离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带；
可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分
〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。
用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。
若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。
利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。
自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA 以来，该法取得许多成果。
为得到必要的浓度梯度，多采用浓氯化铯溶液，所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名称，还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。
通常利用分析超离心机，但在将细胞颗粒成分进行分离等
以纯化为目的的情况，利用密度差，使用分离超离心机，采用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。
〔2〕采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。
若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。
这种情况采用适当的编排号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。
这是与〔1〕不同的一种沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分离物这点上是有优越性的。
因多采用蔗糖密度梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。
按同样原理，也可使用分析超离心机进行测定。
编辑本段工作原理
又称速率—区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法；原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
介质梯
度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。
常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度
注意事项
离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。
离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带。
再通过虹吸、穿刺或切割离心管的方法将不同区带中的颗粒分开收集，得到所需的物质。
1、梯度介质应具备足够大的溶解度，以形成所需的密度梯度范围。
2、梯度介质不会与样品中的组分发生反应。
3、梯度介质也不会引起样品中组分的凝集、变性或失活。
4、若离心时间过长由于颗粒的扩散作用，会使区带越来越宽。
为此，应适当增大离心力、缩短离心时间，可以减少由于扩散而导致的区带扩宽现象。