11第九章--亲和纯化技术

选用大分子配基。
甘氨酸 小分子物质作为配基，载
体和配基间插入一个“手 臂”以消除空间障碍。
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（五）配基的类型
较小的有机分子或天然生物活性物质。 根据配基应用和性质:特殊配基和通用配基。 特殊配基（special ligand）
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1、特殊配基（specific ligand）：
指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的 配基。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、 激素－受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物 质作为配基都属于特殊性配基。
载体孔隙是配体向配基接近的通道。 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。
（五）微环境的影响
载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团。 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。
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六、 配基与间隔臂的连接
（一）含氮配基的连接 （二）含羧基配基的连接 （三）含巯基配基的连接 （四）含醛基、酮基、羟基配基的连接
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七、 亲和层析的吸附和洗脱
影响吸附的条件 亲和层析的洗脱 亲和吸附剂的再生
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（一）影响吸附的条件
亲和吸附剂及配体的性质 缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析流
速有关。
温度升高会使吸附作用减弱。 流速每小时低于10 ml/cm2。 层析柱用前必须充分平衡。 上样体积为柱床体积的5%。
（2）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物 活性物质。
（3）样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活 性物质解吸。
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基本过程
•固相化
+
吸附
+
+
冲洗
解吸
+
亲和层析的原理
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举例：抗原-抗体亲和层析
二、亲和层析载体
（一）亲和层析对载体的要求：
（1）充分功能化，与配基进行共价连接。 （2）有较好的理化稳定性和生物惰性。 （3）具有高度的水不溶性和亲水性。 （4）具有多孔的立体网状结构。 （5）应为大小均匀的刚性小球。
葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更 小，应用受到限制。
4、聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P
有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较 高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。 pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。
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5、多孔玻璃珠：
化学与物理稳定性较好，机械强度高。
缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质 有非特异性吸附，化学活性基团少。
指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分 子结合的配基，如各种凝集素（lectine）可以结合各种糖 蛋白、NADH作脱氢酶类的通用配基等。通用性配基对生物 大分子的专一性虽然不如特异性配基，但通过选择合适的 洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配基还具有 结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜 等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。
有大量可修饰的酰胺基。 酰胺基能被含氮化合物置换制备多种衍生物。
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（二）配基偶联的方法
叠氮化法 重氮化法 (含氨基载体) 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）
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叠氮化法
聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加1mol/L的亚硝酸， 反应液搅90s；
加入脂肪胺类配基，制得亲和吸附剂。
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重氮化法
ω-氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得 对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。
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复合亲和力
离子效应作用，又有疏水作用。 配体与配基有较强生物特异性。 用高浓度的盐和有机溶剂，以提高选择性。
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（二）亲和层析的洗脱
洗脱：
洗脱方法主要有三种： 非专一性洗脱 特殊洗脱 专一性洗脱
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1、非专一性洗脱 通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等
理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是使用较多的洗 脱方法。
用于小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。
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4、活化型亲和胶10和15
由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10的“手臂”长为10个碳原子，产生一些负电
荷，有利于碱性或中性蛋白偶联； Affi-Gel15为15个碳原子的“手臂”，产生一些正电荷，
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亲和势—KL（EL复合物的解离常数 ）
以酶和底物为例：
KL：解离常数
KL
E： 酶
Leabharlann Baidu
E+L
EL
L： 底物
EL：复合物
E0、L0：起始浓度，当L0》E0时， 分配比k
（二）配基的浓度
对亲和势比较低的时候（KL≥10-4mol/L），增 加配基浓度有利于吸附。
增加亲和柱的长度来提高吸附率。
配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。
四、载体的活化与偶联
糖类载体的活化与偶联 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物活化与偶联 用于固定化配基的凝胶衍生物
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（一）糖类载体活化与偶联
溴化氰活化法 高碘酸氧化法 环氧化法 甲苯磺酰氯法 双功能试剂法
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溴化氰活化法
载体如琼脂糖、葡聚糖等，在碱性条件下用溴 化氰处理，可引入活泼的“亚氨基碳酸”中间 体。
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2、琼脂糖凝胶
琼 脂 糖 浓 度 有 2% 、 4% 、 6% ， 商 品 为 Sepharose 2B、4B和6B（Pharmacia）。
保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功 能基团，结构疏松孔径大，流速快。
Sepharose CL,稳定性明显增加，能在pH3~14 中应用。
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3、葡聚糖凝胶：
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甲苯磺酰氯法
在无水丙酮中进行。
优点：①活化反应迅速； ②偶联条件温和； ③偶联效率高。
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双功能试剂法
双功能试剂是同一分子中具有两个反应活性基团 的化学试剂，常作为连接两个分子的“桥梁”。
二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐 优点：反应速度快、条件温和，能与氨基、糖类、
酚、醇类等偶联。
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聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法
第九章 亲和纯化技术
1
亲和纯化技术概念
利用生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物 物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术（Affinity purification）
2
3
本章内容的重点
1、 掌握亲和层析的基本原理，亲和吸附剂的制备 要点包括载体和配基的选择及其它措施。 2、 熟悉亲和层析的基本操作，洗脱条件的控制及 提高分辨率的方法。 3、 了解亲和层析的用途。 4、 掌握亲和过滤、亲和萃取、亲和沉淀、亲和电 泳的有关概念。
改变洗脱剂的pH。 离子强度的分步和梯度变化。
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第一节 亲和层析(affinity Chromatography)
利用生物大分子物质具有与某些相应的分子 专一性可逆结合的特性而建立的层析技术。
适用于从成份复杂且杂质含量远大于目标物 的混合物中提纯目标物。
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特点
经过一次处理可得到高纯度活性物质 。 设备要求不高、操作简便、特异性强、分离速度
2、AH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B 含有6个碳原子的”手臂”的琼脂糖衍生物 AH-Sepharose 4B用于含有羧基的一类配基。 CH-Sepharose 4B能与含有一级氨基的配基偶
联。
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3、环氧活化型Sepharose 6B
由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体通过醚 链形成的衍生物。
分子配基更明显。
“手臂”，增加与载体相 连配基的活动度，减轻载 体的立体障碍。
常用的“手臂”多为烃链。
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（三）配基与载体的结合位点的影响
多肽或蛋白质等大分子配基须控制偶联反应条件， 使它以最少的功能基团与载体连接。
保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂具有 较大的亲和力。
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（四）载体孔径的影响
特点：特异性高、分离效果好。 缺点：配基不稳定，偶联时活性损失大，价格昂贵、
成本高。
通用配基（general ligand）
用于一类物质的分离提纯。
用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配基； 用ATP作激酶类亲和层析的通用配基； 用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时的通
用配基等。
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2、通用性配基（general ligand）：
快、分离效果好、分离条件温和。 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。
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亲和吸附剂：载体—配基
在亲和层析中起 可逆结合的特异 性物质称为配基 （Ligand）。
与配基结合的层 析介质称为载体 （Matrix）。
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一、亲和层析的原理
（1）配基固定化：配基与载体偶联，结合成具 有特异亲和性的分离介质。
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非专一性吸附 亲和层析中的非专一性吸附。
离子效应 疏水基团 复合亲和力
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离子效应
配基与载体-间隔臂的不完全 结合，将无关离子基团引入 吸附剂。
具有离子基团的亲和吸附剂 会影响蛋白质的洗脱行为。
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疏水基团
吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水 区相互吸引，形成非专一性吸附。
疏水基团： （1）长的烃链结构的“手臂”： （2）疏水性配基：
6、其它载体——壳聚糖
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壳聚糖(甲壳素和壳聚糖)
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三 、亲和配基
配基的选择 配基的浓度 配基偶联的位置 配基分子的大小 配基的类型
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（一）配基的选择
亲和层析配基的选用主要取决于分离对象。
1、配基与配体有足够大的亲和力 （亲和势） KL 在10-4～10-8之间。
2、配基与配体的结合应是专一的 。 3、配基应具有化学活性 。
在弱碱的条件下直接与含有游离脂肪族氨基或 芳香族氨基的配基偶联。
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方法
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缺点:
1、溴化氰活化法的载体和配基偶联后生成的异脲衍生物中 氨基通常会带一定的正电荷，从而使载体可能有阴离子离子 交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。
2、溴化氰活化的载体与配基结合不够稳定，尤其是当与 小配基结合时，可能会出现配基脱落现象。
配基浓度对亲和力的影响 空间障碍的影响 配基与载体的结合位点的影响 载体孔径的影响 微环境的影响
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（一）配基浓度对亲和力的影响
为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值 ≥10。
配基浓度与亲和对解离常数相关。 对于低亲和力系统，配基浓度提高。
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（二）空间障碍的影响
空间位阻。 对于分子大的配体以及小
理想的配基浓度为1-10μmol/L。
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（三）配基偶联的位置
配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。
AMP-Sepharose亲和柱。 腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对
脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 磷酸基接到载体上，对甘油醛-
3-磷酸脱氢酶有吸附力。
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（四）配基分子的大小
用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。
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碳二亚胺缩合法
碳二亚胺为羧 基活化剂。
反应中的脲衍 生物可用有机 溶剂洗涤除去。
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（三）用于固定化配基的凝胶衍生物
1、CNBr活化的Sepharose 4B
Sepharose 4B经CNBr活化，可偶联蛋白和核 酸类配基。
故有利于酸性蛋白的偶联。
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5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102
CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨
基。 Affi-Gel202具有10个原子的“手臂”，未端
具有羧基。
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五、 影响吸附亲和力的几个因素
KL
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（二）常用载体
纤维素 (cellulose) 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它载体——壳聚糖 (Chitosan)
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1、纤维素
纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的 渗入。
非特异性吸附力较强，空间位阻。
主要用于分离与核酸有关的物质。
亲和作用力
静电作用力 氢键 疏水作用力 金属配位键 弱共价键
蛋白质各结合部位及各结合作用力
5
技术要点
（1）寻找找与目标物专 一可逆结合的配基；
（2）将配基通过共价键 偶联到基质；
（3）配基与目标物吸附； （4）洗脱目标物。
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亲和纯化技术
亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳）
3、溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。
高碘酸氧化法
多糖载体与0.1mol/L的高碘酸钠氧化反应24小时 会产生醛；
在温和条件下，醛与赖氨酸上的ε-NH2生成西夫 碱，接着用硼氢化钠还原，生成稳定的烷基胺。
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环氧化法
碱性条件下，多糖载体与环氧氯丙烷作用生 成环氧化合物；
环氧化合物又与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。