单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应用单克隆抗体技术是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合

抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体B淋巴细胞antibody technique)同骨髓肿瘤细胞杂交，获：一种免疫学技术，将产生抗体的单个(monoclonal

得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。

1 单克隆抗体的优点与局限性：

1.1 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。

总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。

1.2 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。

2 单克隆抗体的制备：

单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。

单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。

2.1 抗原准备

抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。

2.2动物的选择与免疫

2.2.1 动物的选择纯BALB/c小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的

开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/c实验室均能饲养成活目小鼠。

2.2.2免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融

合前两月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml，0.2ml/点），3周后第二次免疫，剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml），3

宜，～500μg50剂量周加强免疫，3～2，天后采血测其效价）7～5（ip不加佐剂，剂量同一，周后第三次免疫，

取脾融合。天后 iv（静脉内注射)，3ip或～1以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

（融合1×10/0.5ml ip，3～2×10个细胞。初次免疫 1×10/0.5ml ip，23周后，777周后加强免疫

第二次免疫7，取脾融合。或iv前三天）1×10/0.5ml ip细胞融合2.3

细胞融合前准备2.3.1

样杂交融合率高，也便于接种杂交）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，（1

培养基。小牛血清的浓。骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如瘤在同一品系小鼠腹腔内产生DMEM量McAb645。当细胞处于对/ml生长的中期～5×10/ml为宜，最大浓度不得超过10度一般在10%～20%，细胞浓度以10

时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细54孔。10细胞/胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。饲养细胞的量为一般为2×10或细胞融合的步骤2.3.2

1的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗：10或1：5 ①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1）浓度。轻轻弹击离心管底，8min；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG次，离心，1200rpm，使细胞沉淀略松动。 90s。）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000 ②90s 6ml。4ml、5ml和、PEG作用，每隔2min分别加入1ml2ml、3ml、。③加37C预温的不完全培养液以终止 800rpm, 6min。④离心，选择培养液重悬。⑤充上清，用含20%小牛血清HAT

孔板。100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96 ⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加培养箱中培养。⑦将培养板置37℃、5%CO 2选择杂交瘤细胞及抗体检测2.4 处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG 2.4.1 HAT选择杂交瘤细胞由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌在HAT选择培养液中培养时，髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。选天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT天内，将有大量瘤细胞死亡，3～42 在用HAT选择培养1～周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞210天后应换用HT培养液，再维持择培养液维持7～～2筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体， 3天换一半培养液。