双荧光报告基因分析

双荧光报告基因分析

实验目的：

研究转录因子的活性和调控元件的活性。

实验原理：

通过将感兴趣的目的基因转录调控元件构建到带荧光素酶（firefly luciferase）的表达载体，如pGL3，构建成报告基因质粒，使这段DNA序列调控luciferase的转录。然后将报告基因质粒转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，并加入底物荧光素后（luciferin），luciferase可以催化荧光素发出荧光，从而可以通过测量荧光值的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。为避免由于质粒转细胞时效率的差异而带来的误差，可以同时转入Renilla荧光素酶的报告基因质粒作为内参，即双荧光报告系统。该实验可以用于研究转录因子对promoter或enhancer序列的调控，也可以用于研究受体活性，细胞内信号通路，或者microRNA对基因表达的调控。

实验过程：

1．质粒构建

1.1载体的选择常用的载体有pGL3系列，包括pGL3-basic(附图1a)，pGL3-promoter(附图1b)，pGL3-enhancer(附图1c)。如果要研究的序列是promoter，可选择将目的片段插入pGL3-enhancer载体；若要研究的序列是enhancer，则可选择pGL-promoter载体。

1.2抽提基因组DNA，并以基因组DNA为模板PCR，克隆目的片段，通过合适的酶切，插入载体，构建报告基因表达质粒。

2．转染

将报告基因质粒和作为内参的Renilla以及待研究的转录因子的表达质粒共转染

细胞，并根据需要刺激或处理细胞，24h-48h后收细胞。在共转染时，由于内参质粒Renilla有很强的promoter/enhancer，因此报告基因质粒:Renilla转染量一般为10：1到50：1。

3．Luciferase活性的测定（以promega的双荧光报告试剂盒为例）

3.1 细胞裂解

试剂盒中提供的裂解液为5X PLB（passive lysis buffer），使用前取1体积的PLB，加4体积的dH2O混匀。去掉细胞培养液，用PBS洗一遍以去掉残留的培液，加入1X PLB。并将培养板于摇床上室温摇15min，使细胞充分裂解。将细胞裂解液转移至ep管，12000g X 30sX 4℃离心。上清中即含有firefly luciferas 和Renilla luciferase，用于测定酶活性；而沉淀为核蛋白，可用于western blot检测转录因子的表达。

3.2LAR II 和Stop&Glo

LAR II（luciferase assay reagent）是firefly luciferase 的底物，在使用新的KIT时，将LAR II 溶解在LA II buffer中，并分装保存。

Stop&Glo 是Renilla luciferase 的底物，同时能终止LAR II的反应。在试剂盒中提供的是50X Stop&Glo substrate 以及Stop&Glo buffer。可以一次将substrate 与buffer混匀，然后分装保存，也可以每次使用前取1体积的substrate，加入50体积的buffer。

3.3测定

在指形管中加入40 μl 的LAR II，10 μl细胞裂解液，用枪头上下打匀2-3次，于发光仪中测量，读数，即为firefly luciferase的值。每管依次测量完后，加入40μl Stop&Glo，再次测量读数，即为Renilla luciferase的值。

3.4数据的处理

先计算出每管的firefly luciferase/ Renilla luciferase 的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组或转染组的相对luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控的活性。

实验相关试剂：

Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, E1910 or E1960)

保存条件：

5XPLB -20℃

LAR II分装后于-70℃避光保存

Stop&Glo分装后于-70℃避光保存

注意事项：

为保证荧光素酶检测试剂的稳定性，可以采取适当分装后避光保存的方法，以避免反复冻融和长时间暴露于室温。

为取得最佳测定效果，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制在相同时间内。样品和测定试剂混合后，再进行测定。测定时间通常为10秒，根据情况也可以测定更长或更短时间，但是同一批样品最好使用相同的测定时间。

由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定。

附录：pGL3图谱

图1a 图1b

图1c