胡萝卜2013愈伤组织悬浮培养体系的建立和再分化的诱导PPT
胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究
山西师范大学学报(自然科学版)第18卷第2期Journal of Shanxi Teacher c s University Vol.18No.2 2004年6月Natural Science Edition June2004文章编号:1009-4490(2004)02-0071-06胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究尹文兵,李丽娟,黄勤妮,李艳红(首都师范大学生物系,北京100037)摘要:分别以胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层为外植体诱导出愈伤组织,并建立细胞悬浮系.实验结果表明:胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体;诱导松散型愈伤组织的最佳激素浓度配比是1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT;细胞悬浮培养细胞最佳起始密度为1.125@104个/mL~2.325@104个/50mL时,7d~9d为对数生长期;继代培养4代~5代时,可得到稳定的悬浮细胞系.关键词:胡萝卜;组织培养;细胞悬浮培养;松散型愈伤组织;生长曲线中图分类号:S631.2文献标识码:A胡萝卜(Daucus carota L.),属于十字花科植物,是一种十分重要的蔬菜作物,由于其营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培.中国是农业大国,胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用.因此,加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要[1].近些年来,随着生物技术与分子生物学技术的快速发展,作为生物技术研究的理想材料,许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究.我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展,特别是在组织培养、原生质体融合[2]、遗传转化及再生等方面.但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多,因此继续深入研究还是很有必要的.本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨,为其次生代谢产物A-胡萝卜素、B-胡萝卜素的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础.1材料和方法1.1材料来源胡萝卜种子由中国农科院蔬菜所提供.1.2方法收稿日期:2004-03-22作者简介:尹文兵(1979)),男,山西安泽人,首都师范大学在读硕士研究生,主要从事功能基因组学方面的研究.72山西师范大学学报(自然科学版)2004年1.2.1胡萝卜愈伤组织的诱导(1)以胡萝卜子叶和下胚轴为外植体诱导[2].将胡萝卜种子搓去种毛,然后在75%的酒精中消毒5min,无菌水冲洗一遍后,用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍,再用无菌水浸泡30min,最后用无菌水漂洗一遍,接种在无激素的MS培养基上.10d左右种子开始萌发,待两片子叶伸展,而心叶刚刚显露时,将幼苗的下胚轴和子叶切成0.3c m 左右的小段,接种在附加植物激素1.0mg/L2,4-D,1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT,2.0mg/L 2,4-D,2.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT的MS培养基的三角瓶中,培养30天左右,即可诱导出愈伤组织.继代培养时,将老的和生长不良的愈伤组织去掉,将大的健康的愈伤组织切至0.5c m,再放于含0.1mg/L2,4-D的MS培养基(pH5.7)上继续培养.诱导和继代培养均在黑暗条件下进行,培养温度为25e,继代培养时间为3周~4周更换一次培养基.观察并记录继代过程中愈伤组织状态的变化.(2)以胡萝卜直根形成层为外植体诱导.用清水洗净胡萝卜直根,用小刀削去表皮和顶部,将其在75%的酒精中消毒5min,再用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍,再用无菌水浸泡30min,最后用无菌水漂洗一遍.消毒好的胡萝卜直根,切去下边的2/ 3部分,留下部分用消毒好的小刀,沿截面横切成厚度1mm左右的小圆片,然后将小圆片的韧皮部和木质部切去,留下形成层,再切成长3mm,宽1.5mm,高1mm的小长块,接种在(1)中的诱导培养基上,获得愈伤后进行继代培养,培养环境条件与(1)相同.1.2.2胡萝卜细胞悬浮系的建立[3]用镊子夹取在固体继代培养基上继代20d左右的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的愈伤,接种在含0.3mg/L2,4-D的液体培养基(pH5.7)中,每100mL的三角瓶中加入液体培养基50mL,摇床转速为110r/min,温度为25e,黑暗培养.每隔7d继代一次,连续培养4代~5代后逐渐形成稳定的细胞系.细胞悬浮培养液体培养基成分与愈伤组织继代培养的培养基相同,但不加琼脂.每隔1d在倒置显微镜下观察细胞形态、分散程度并照相,进行细胞计数,以建立细胞数生长曲线.1.2.3细胞悬浮生长曲线的测定取0.5g悬浮培养物,接入新鲜液体培养基中,进行振荡培养,每隔1d取样1次,共培养13d,连续做3次平行实验.1.2.4悬浮细胞数目的测定用血球计数板法[1]对胡萝卜悬浮细胞计数,全部操作在无菌环境下进行,每个结果为4次平行实验的平均值.细胞数按下面公式计算:1mL悬浮液中的总细胞数=A/5@25@ 104@B,A为5个中方格总细胞数,B为稀释倍数.2结果与讨论2.1外植体对愈伤组织状态的影响有文献报道,不同外植体的脱分化能力不同,诱导出愈伤组织的频率和愈伤组织的状态也不同.在胡萝卜愈伤组织诱导时,本实验采用三种外植体:胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层.经过30d观察发现,三种外植体经过培养均诱导获得了愈伤组织.结果如下:以子叶为外植体的大约有2/3诱导获得了愈伤组织,多数愈伤组织呈浅黄色,生长旺盛,质地松散,含水量大,分散性好,但也有一些状态不好,色泽发暗,选取好的可作为细胞悬浮培养的材料;以下胚轴为外植体几乎所有都获得了愈伤组织,并且愈伤组织生长旺盛,呈黄色,比较疏松,分散性好,适宜于细胞悬浮培养;而以直根形成层为外植体获得的愈伤组织不多,色泽较暗,有些带褐色,愈伤组织生长缓慢,质地较硬,分散度差,不适宜于细胞悬浮培养.因此,可认为胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体.2.2 激素对愈伤组织状态的影响不同的激素及激素浓度直接影响着愈伤组织的状态、质地和分散性,而这些因素又是松散愈伤组织的关键,也是进行细胞悬浮培养的必要前提.因此,本实验诱导胡萝卜愈伤组织及继代培养设计了4种激素组合[见1.2.1(1)],通过多次继代培养发现,1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT 组合诱导出的胚性愈伤组织(见图1)生长旺盛、呈黄色米粒状分散性好、质地松软、含水量小,有利于细胞悬浮培养,而半胚性愈伤不适合进行细胞悬浮培养.其他3种组合中,2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT 诱导出的愈伤组织也比较疏松,而另两种诱导出的愈伤组织质地比较坚实,有褐化现象.可见,2,4-D 与KT 的结合有利于疏松愈伤组织的诱导.图1 胡萝卜松散型愈伤组织 左图:胚性愈伤 右图:半胚性愈伤Fig.1 The imcompact calli.of Daucus carota L Left:embrogenic callus Ri ght:semiembrogenic callus2.3 继代次数与细胞状态之间的关系在细胞悬浮培养的过程中,需要不断地进行继代,来筛选出良好的、较稳定的细胞系.继代过程中,细胞悬浮液的颜色、细胞的形态、大小、数量不断在发生着变化.第1、2次继代时,细胞悬浮液为白色或浅黄色,混浊,有许多大颗粒,倒置显微镜下观察,细胞多数成团,保持较旺盛的分裂能力,单细胞大多呈长形、梭形、不规则形(见图2),细胞个体较大;3、4次继代时,细胞悬浮液变为黄色,比较粘稠,颗粒大小分布均匀,倒置显微镜下观察,分裂的细胞团增多,有的细胞团明显可见有20个~30个球形细胞组成,单细胞数目增多,而且大多呈球形;5次继代时,细胞悬浮液(见图3)呈透明的黄色,澄清,呈油状流动,颗粒分布很均匀,直径大多在0.5m m~1mm,倒置显微镜下观察,细胞团和单细胞很多,大多呈球形(见图4),大小均匀;6、7次继代以上时,悬浮液变得比较澄清,呈浅黄色,悬浮颗粒大小均匀,倒置显微镜下观察,细胞大多成团,可以清楚的看出细胞呈球形,比较均匀,73 第2期 尹文兵,等:胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究也有单细胞,但是不多,这可能与细胞聚集成团的特性有关.图2 不规则细胞(10@) 图3 黄色的细胞悬浮液Fig.2 Irregular cell (10@)Fig.3 Yellow cell suspension因此,继代培养过程中,随着继代次数的增多,细胞悬浮液由无色或浅黄色变为黄色,由混浊变为澄清、透明,颗粒大小由不均匀到均匀,最终直径在0.5mm~1mm,倒置显微镜下观察,单细胞由长形、梭形、不规则形变为规则的球形,细胞系逐渐趋于稳定.随后,我们又从筛选出来的细胞系将细胞接种到不含激素的MS 培养基上,7d 后长出新的愈伤组织,30d 后长出胡萝卜全苗并转入蛭石成活(图5),说明以细胞系转化为新的愈伤组织生成再生植株是成功的.图4 球形细胞(40@) 图5 再生植株Fi g.4Global cell (40@) Fig.5Plant regeneration2.4 细胞起始密度对细胞悬浮培养的影响在细胞悬浮培养时,细胞生长需要一个最低生长密度,低于此密度,细胞生长速率降低或根本不生长[4].适宜的起始密度可以缩短细胞系筛选的时间,起始密度过大过小不仅会影响细胞系筛选的时间而且不利于稳定细胞系的建立.同时,细胞的起始密度对细胞培74山西师范大学学报(自然科学版) 2004年养周期也有影响.为此,本实验设计了4个密度梯度:0.4@104个/50mL,1.125@104个/50mL,2.325@104个/50mL,8.875@104个/50mL.培养13d,细胞状态随天数的变化见表1。
胡萝卜组织培养
②外植体接种。 把消毒好的胡萝卜直根放入无菌培养皿中，用消毒好的 小刀沿截面将其横切成厚度1mm 左右的小圆片，然后 将小圆片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，再将形 成层切成大约长5mm、宽5mm、高1mm 的小长块。具 体操作方法:把消毒好的胡萝卜直根放于无菌培养皿中， 用小刀将其切成2 ～ 3cm 的小段，用灭过菌的打孔器沿 着形成层穿入胡萝卜中，取得一段含有形成层的2 ～ 3cm 的圆柱体，然后用无菌解剖刀片将其切成厚1mm 的小薄片，将切好的胡萝卜外植体接种在MS + 2mg /L 2，4 － D +1. 5mg /L KT 的固体培养基上( 如图1 b) ， 放于黑暗处25℃条件下进行暗培养，50d 后长出淡黄色 愈伤。
组织培养实验室模式布局
三、实验步骤ຫໍສະໝຸດ (1) 胡萝卜愈伤组织的诱导 ①外植体消毒。用清水洗干净胡萝卜直根， 用小刀给其削去表皮，并切成小段放入烧 杯中。先用70% 酒精对胡萝卜直根消毒 5min，用无菌吸水纸吸干，再用10% 的次 氯酸钠溶液消毒10min，放入无菌水中漂洗 2 ～ 3 次，用无菌吸水纸吸干待用。
(2) 胡萝卜愈伤组织悬浮 体系的建立 用镊子夹取在固体培养 基上的胚性愈伤组织即 分散性好、疏松的愈伤 用解剖刀切碎，接种在 MS+ 0. 3mg /L 2，4 － D + 3%蔗糖的液体培 养基( pH5. 8 ) 中，每 100mL 的三角瓶中加 入MS 液体培养基50mL， 摇床转速为110r / min， 温度为25℃，黑暗培 养3 ～ 5d。
(3) 胡萝卜愈伤分化 将胡萝卜悬浮细胞 和愈伤转接在不添 加激素的MS 固体培 养基中，25℃条件 下光培养。30d 左右 愈伤长出胚状体， 40d 后长出小绿芽， 接着生根长出绿叶 片。
实验2-3 胡萝卜愈伤组织继代培养基的配制
（2）植物材料的表面灭菌和接种
①操作人员洗手消毒
②装材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒
③将待消毒的材料浸入75％的酒精中10秒， 取出用无菌水冲洗干净。 ④倒入消毒剂（ 0.1%HgCl2 ）并计时
⑤到预定时间（20分钟）后倒出消毒液并 用无菌水清洗干净。
⑥将材料切块后接种到诱导培养基上。
6 实验流程
（1）准备工作
① 外植体表面灭菌前的准备工作 a 接种室的清洁和消毒； b 超净工作台的开机和消毒；
c 消毒溶液、无菌水、装等的准备。
② 实验材料的准备
a 准备新鲜健康的胡萝卜肉质直根作实验 材料；
b 实验材料的修整、刷洗、冲洗； c 用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自来水 冲净。
（2）胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制
配方：MS基本培养基＋ 2mg/L NAA＋ 0.1mg/L 6-BA＋200mg/L水解酪蛋白＋ 0.7 ％琼脂＋3％蔗糖 配制流程：同胡萝卜愈伤组织诱导培养基 的配制
作业
详细写出胡萝卜愈伤组织诱导培养的操作 步骤。
实验2-2 胡萝卜愈伤组织的诱导
1 实验目的
通过本次实验，使同学能够熟练掌握外植 体的表面消毒技术和无菌操作技术。 2 实验原理 将胡萝卜的贮藏根（根的变态）表面消毒 后切割成小块接种于愈伤组织诱导培养基 上，诱导外植体脱分化产生愈伤组织。
3 主要实验用具和仪器
用具：酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、 枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养 皿、酒精灯等。 仪器：超净工作台、恒温培养箱 4 药品和试剂 胡萝卜愈伤组织诱导培养基、无菌水、75 ％酒精、0.1%HgCl2。 5 实验材料：胡萝卜肉质直根
第五章愈伤组织的培养ppt课件
（一）体细胞胚状体的概念及其特点
1、定义：
离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过 程所形成的体细胞胚或胚状体。
2、体细胞胚的结构与发育特点：
（1）与器官发生形成个体的途径相比： （2）与合子胚相比
2、体细胞胚的结构与发育特点
第五章 愈伤组织的培养
第一节 愈伤组织的诱导和分化 第二节 愈伤组织中的形态发生 第三节 人工种子
教学目的：
掌握愈伤组织诱导与形态发生的基本知识， 熟悉人工种子的制作技术，了解愈伤组织的 增殖方式及其状态的调控技术。
教学重点：
1、愈伤组织的诱导； 2、愈伤组织器官的形成； 3、体细胞胚胎发生； 4、人工种子。
①体细胞胚人工种子； ②非体细胞胚人工种子。
三、人工种子的优点：
①在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快 速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种性， 又可以使之具有实生苗的复壮效应；
②可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速 获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植 物更具有重要的实用意义；
③对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料 如三倍体、非整倍体、基因工程植物等，有可 能通过人工种子在短期内加大繁殖应用；
2、人工种子概念的发展：
（1）早期的人工种子：仅仅局限于由人工种皮包被 的体细胞。
体细胞人工种子的局限性：使其应用受限
• ①体细胞诱导在植物种类上的局限性； • ②体细胞胚在群体上的变异； • ③木本植物经过胚途径繁殖其幼年期较长等问题。
（2）人工种子概念的延伸（日本）：
认为使用适当方法包埋组织培养所获得的具有发育成 完整植株的分生组织（芽、愈伤组织、胚状体和生长 点等）、可取代天然种子播种的颗粒均为人工种子。
②成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞，这类细胞具有成 胚能力，因而，把这类细胞团又称为胚性细胞团。
胡萝卜愈伤组织悬浮培养体系的建立和再分化的诱导PPT课件
化的诱导
1
一、实验目的
• 学会建立胡萝卜细胞悬浮培养体系的方法 和相关操作。
• 通过胡萝卜悬浮培养生产胡萝卜素的整个 过程，了解利用植物细胞悬浮（大量）培 养技术生产有用次生代谢物这一个技术的 主要流程，技术体系和注意事项。
• 学会从愈伤组织诱导细胞再分化的原理和 方法。
撰写
7
污染源: 细菌,霉菌?现象?
• 观察
生 有污染 长 反 应 无污染
原因: 外植体?环境?操作?
不生长,发白或死亡
不生长,不死亡,也无愈伤形成 发生部位
愈伤形成 颜色质地 差异原因?
• 拍照
• 分析
8
形式
综合性的一篇论文 分开的三次实验报告
实
验
结构上的完整性
报
文字 术语的正确使用
告
内容
图片
不同污染源导致的污染 不同生长情况的图片 不同愈伤组织的图片
悬浮振荡培养1周或更长
称重,计算细胞鲜重的增加(?g )
收集细胞,分离-提取-纯化胡萝卜素,并测定含量
10
2. 再分化诱导
• 8人/组 • 2-3瓶/人
建立起来的无菌培养物
无菌条件下切割分开
接种在分化培养基上
适当条件下培养1-3周 培养反应的观察
11
3 胡萝卜素的分离提取和含量测定
悬浮细胞的收集
细胞分裂、 分化调节
培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT
0.5mg/L
单细胞或细胞细胞团块的获得
方法（机 械和酶法）
液体培养
细胞活力 细胞分裂和生长 分化和代谢调节
实验2-4 胡萝卜愈伤组织的继代培养
4.药品和试剂
愈伤组织继代培养基、75％酒精、MS培养基 和常用试剂母液、蒸馏水。
5.实验材料
处于脱分化进程中的外植体
6.实验流程
（1）胡萝卜愈伤组织的继代培养 ①准备工作
接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和 消毒；剪刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、 待用培养基等的准备；实验材料的准备（选 择装有无污染的已分化出愈伤组织的外植体 的三角瓶摆放于净工作台上）
②愈伤组织继代培养
将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污 染的外植体上产生的愈伤组织剥离转接到愈 伤组织继代诱导培养基上，放置在25 ℃全黑 暗条件下进行愈伤组织的增值培养，以获得 足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料。
（2）胡萝基本培养基 + 2.0mg/L NAA + 0.1mg/L6-BA + 200mg/L水解酪蛋白 + 3％ 蔗糖
配制流程： 配制 调节pH值
封口包扎
灭菌
实验2.4 胡萝卜愈伤组织的继代培养
1. 实验目的
通过本次实验，使同学熟练掌握愈伤组织继 代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范 无菌操作技术；设计和配制胡萝卜细胞悬浮 培养的培养基。
2.实验内容
（1）胡萝卜愈伤组织的继代培养 （2）胡萝卜细胞悬浮培养培养基的配制
3. 主要实验用具
胡萝卜愈伤组织诱导
胡萝卜愈伤组织的诱导摘要:以胡萝卜直根为外植体,进行植物组织培养，并探讨解决胡萝卜组织培养不易成功的因素。
先后进行了两次实验,研究了不同的植物生长调节剂(2,4-D、6-BA)对胡萝卜脱分化形成愈伤组织速度的影响。
实验结果表明在母液中加入2,4-D(2.2 mg/L)效果最好,优于加入6-BA(0.5mg/L)+ 2,4-D(1.0mg/L)。
关键词：胡萝卜；愈伤组织；激素一、引言19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。
1902年，德国植物学家哈伯兰特在细胞学说的基础上，大胆提出要在试管中人工培育植物。
他预言离体的植物细胞具有发育上的全能性，能够发育成为完整的植物体。
这种细胞全能性的理论是植物组织培养的理论基础。
1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。
植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。
植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
狭义是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
植物组织培养新技术在快繁脱毒、育种、种质资源保存、次生代谢物提取、基因转化等方面有着良好的前景以及研究热点。
在植物育种上的应用：单倍体育种，离体胚培养和体外受精，细胞融合，基因转化，培养细胞突变体、在植物脱毒和快速繁殖上、在人工种子和种质保存方面、在提取植物次生产物生产上、在植物免疫方面的皆能有其应用。
胡萝卜悬浮细胞系及高效再生系统的建立(范例)
胡萝卜悬浮细胞系及高效再生系统的建立摘要：以胡萝卜块根为材料诱导愈伤组织，并建立悬浮细胞系，然后将悬浮细胞和愈伤组织分别转入分化培养基进行分化培养。
结果表明，胡萝卜块根形成层愈伤组织诱导率为100%，最佳激素种类和用量为2，4-D 0.1mg/L；根据外观可将愈伤组织大致分为4种类型， I型是直接建立悬浮细胞系的良好来源，III型经继代培养后可用于悬浮细胞系的建立；静止法是胡萝卜悬浮细胞系简单而有效的继代方法；胡萝卜愈伤组织分化的最佳培养基是MS或B5基本培养基，MS培养基上的再生苗可直接生根，而B5培养基上的再生苗在原培养基上很难生根，需要转移到MS培养基上才能生根。
关键词：胡萝卜；愈伤组织；悬浮细胞系；继代；分化胡萝卜(Daucuscarota L.)属于伞形花科植物，是世界上最重要的蔬菜作物之一，栽培面积非常广泛，占蔬菜生产总量的3%，达1350万ｔ[1]。
胡萝卜块根营养丰富，富含糖和植物纤维等，特别是富含胡萝卜素，是一种重要的营养保健品，因此，对胡萝卜进行遗传育种研究已成为迫切需要。
植物悬浮细胞系可以用来分离原生质、制造人工种子、筛选突变体、生产次生代谢物质以及进行植物细胞代谢生理、生化特征等方面的研究。
另外，胡萝卜悬浮细胞系还是遗传转化的理想受体。
本试验通过建立一个成功的悬浮细胞系和再生体系，为胡萝卜在其他方面的研究奠定一定的基础。
1 材料与方法1.1 植物材料胡萝卜块根1.2 方法1.2.1 愈伤组织的诱导选用健康完整的胡萝卜直根清洗干净，用小刀切去底部和顶部，然后将其切成小段，浸泡于75%的乙醇中消毒5min，再用0.1%的升汞浸泡10min，然后用无菌水彻底漂洗，每次停留1~2 min。
用消毒过的小刀将已灭菌的胡萝卜块根两端和外层部分切去，再横切成厚度1ｍｍ左右的小圆片，然后将小圆片的韧皮部和木质部切除，并切成长约2ｍｍ，宽1.5ｍｍ的小长块，接种在诱导培养基上，25℃，暗培养。
第四章愈伤组织培养PPT课件
再转入生长素含量极低或没有的培养基上====胚 一、愈伤组织培养中的形态发生 其中以维管组织（特别是木质部）的分化最为常见。 在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程，每个步骤需要一种不同的培养基。 超过4％时则几乎完全为韧皮部； 体细胞胚胎发生的几个概念 二倍体细胞比单倍体细胞容易 愈伤组织的建立和增殖所需的是一种含有生长素的培养基，通常所用的生长素是2,4D，浓度范围0. 在组织培养的器官发生过程中，愈伤组织是一团无极性分化的细胞团，器官分化中芽或根分化只是具单极性，而胚状体在分化初期就 具胚根和胚芽两极，具明显的形态特征上的极性（Polarity）类似于合子发育中的种子结构。 2、影响维管组织分化的主要因素 幼年细胞和组织比成年的容易 赤霉素（GA3）抑制烟草、紫雪花（Plumbago indica）秋海棠（Begonia）及水稻的器官分化。
第四章愈伤组织培养
优选第四章愈伤组织培养
第一节 愈伤组织的诱导
郁李的愈伤组织
细胞的全能 性的体现
脱分化：一个已停止分裂的成 熟细胞转变为分生状态，并形 成未分化的愈伤组织的现象。
再分化 ：愈伤组织在一定的培养条
件下又可以经过胚胎发生形成双极性 的胚状体，或经过器官发生形成单极 性的芽或根，进而重新形成完整的植 株，这后一段过程一般称为再分化。
（一）诱导期（起动期）
诱导期又称起动期，指细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成 的起点。
Calrom root
Callus arising from vascular tissue
From embryo culture
Photo indicating where the
停止分裂的细胞发生生理 代谢变化而形成由不同形 态和功能的细胞组成的愈 伤组织。
实验2-4胡萝卜愈伤组织的继代培养
及时继代
愈伤组织在培养过程中会逐渐老化， 为保证实验的准确性，应及时进行继 代培养。
03
实验结果与分析
实验结果
实验观察记录
在继代培养过程中，胡萝卜愈伤组织表现出良好的生长状态，细 胞分裂活跃，质地松软，颜色鲜艳。
显微镜观察
通过显微镜观察，发现细胞分裂旺盛，细胞排列紧密，呈现出典型 的愈伤组织结构。
在未来的实验中，我们可以尝试优化 培养条件，如温度、光照、湿度等， 以提高愈伤组织的生长速度和质量。
此外，我们还可以进一步研究愈伤组织在继 代培养过程中的基因表达和分子机制，为植 物组织培养和基因工程领域的发展做出贡献 。
我们可以通过添加植物激素或其他生 长因子来调节愈伤组织的生长和分化， 以实现更好的实验效果。
2. 制备培养基
按照MS培养基配方，添加适量的植物生长调节剂和糖， 搅拌均匀后倒入培养容器中，待培养基凝固。
3. 接种外植体
将准备好的外植体放置在培养基上，确保外植体与培养 基接触良好。
4. 培养条件
将培养容器放置在恒温、恒湿、无菌的环境中，保持适 宜的温度和光照条件。
5. 继代培养
经过一段时间的培养后，观察愈伤组织的生长情况，当 愈伤组织长满培养基时，将其切割成小块，重新接种到 新的培养基上，进行继代培养。
薄壁细胞团。
通过将愈伤组织进行继代培养， 可以保持其生长和分化能力，并 对其进行遗传转化、次生代谢产
物生产等方面的研究。
实验采用的培养基通常含有植物 生长调节剂、无机盐、维生素等 成分，以促进愈伤组织的生长和
分化。
实验背景
植物细胞培养技术是近年来发展迅速的生物技术领域之一，在农业生产、生物医药、 工业生产等方面具有广泛的应用前景。
胡萝卜愈伤组织培养及继代培养
实验课程名称：胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞
悬浮及体细胞胚胎发生培养实验
教师：
开课学期：2013至2014学年第二学期
填报时间：2013年6月日Байду номын сангаас
实验序号
实验二
实验名称
胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞
悬浮及体细胞胚胎发生培养实验
实验时间
2013年3月-6月
实验室
（4）植物组织培养的优点：
①研究材料来源单一，无性系遗传背景一致；
②经济方便效率高；
③条件可控误差小；
④生长快周期短重复性强；
⑤可周年试验或生产。
（5）组织培养实验室布局的总体要求：
便于隔离，便于操作，便于灭菌，便于观察。
（6）组培上常用的灭菌方法有物理和化学法。
常用的物理方法有：
物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等。
愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。诱导愈伤组织常用的生长素是2，4-D，IAA和NAA，常用的细胞分裂素是KT和6-BA。
愈伤组织形成的过程分为3个时期：诱导期、分裂期、分化期（形成期）。愈伤组织的生长是发生在不与琼脂培养基接触的表面。
（3）调节培养基的酸碱性至PH5.8。由于培养基的PH值直接影响到培养
（4）胡萝卜愈伤组织的继代培养所需设备：
①仪器设备：
酒精棉球、小块纱布、已灭菌培养皿和滤纸、枪状镊子、眼科手术剪、手术刀、酒精灯、100ml三角瓶、500或1000ml搪瓷杯、50ml量筒、1ml、2ml、5ml、10ml吸管、精密pH试纸（5.4~7.0）、封口膜、橡皮圈、药勺、称量纸等。
植物组织培养植物组织培养技术愈伤组织的分化与再分化脱分化及形态发生分析PPT课件
•（二）培养基
4 物理性质：固体或液体状态、渗透压等。
——对形态发生有明显的影响。
➢ 培养基状态：
第一阶段诱导形成愈伤组织——固体培养基 第二阶段细胞和胚状体的增殖——液体培养基 第三阶段胚状体发育成可移植植株——固体培养基
➢ 培养基渗透压：
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• 形成期(分化期)：是指外植体经过诱导期和分
裂期后形成了无序结构的愈伤组织进行分化并形成器官的 时期。
主要特征如下：
• 1、细胞的平均大小相对稳定。
• 2、细胞分裂由原来局限在组织外缘分裂转为组织 内部较深层局部细胞的分裂。
• 3、形成分生组织结节。瘤状或片状的拟分生组织。分生组织
• 特点： • 1、细胞大小没有多大变化，外观无明显特征； • 2、细胞内物质代谢旺盛，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。
• 诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状况和 外部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜 的菊芋块茎则只要22h，但菊芋块茎经过5个月的贮 藏后，诱导期则须延长到40h以上。
• 不同激素的效果是不同的:如NAA对生根的作用比IAA和IBA的效 果好，但用IAA和IBA处理，产生的根比较健壮，而用 NAA处理，产生的根则较纤细。2，4-D往往利于愈伤组 织的诱导。
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愈伤分化
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•（二）培养基
• 2．无机营养元素 在植物组织培养，细胞的生长也要求满足植物
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优良的愈伤组织的 特点
• 1、高度的胚性或再分化能力——以便从这些愈 伤组织得到再生植物。
• 2、容易散碎——以便用这些愈伤组织建立优良 的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的 原生质体。
胡萝卜肉质根细胞的悬浮培养和不定芽的诱导(实验报告)
3)、材料：
胡萝卜肉质根愈伤组织
4．实验方法步骤及注意事项 实验步骤：
Ⅰ、胡萝卜愈伤组织的增殖培养 （1） 、准备工作 ①接种室的清洁和消毒；②超净工作台的开机和消毒；③解剖刀、镊子、已灭 菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；④实验材料的准备（选择无污染、愈伤组 织生长状态良好、色泽新鲜的材料摆放于净工作台上） 。 （2） 、愈伤组织增殖培养 将实验 1 建立的生长状态良好、色泽新鲜未褐化的胡萝卜肉质根愈伤组织转接 到愈伤组织增殖培养基上，放置在 25 ℃全黑暗条件下进行愈伤组织的增值培养[4]， 以获得足够数量、质地良好的愈伤组织，作为胡萝卜细胞悬浮培养的实验材料。 （3） 、培养结果 文字描述配合图片记录培养结果 Ⅱ、胡萝卜细胞悬浮培养培养基和不定芽分化培养基的配制 （1） 、胡萝卜细胞悬浮培养培养基和不定芽分化培养基的配方及体积 ①胡萝卜不定芽分化培养基 配方： MS＋0.1mg/L NAA ＋ 1mg/L 6-BA ＋ 0.7 ％琼脂＋3％蔗糖，pH5.8 配制体积：每小组配制 0.5L，用 50ml 三角瓶分装成 20 瓶，每人 2 瓶。 ②胡萝卜细胞悬浮培养培养基 配方： MS＋1mg/L 2,4-D ＋ 0.5mg/L 6-BA＋200mg/L 水解酪蛋白＋3％蔗糖，pH5.8 配制体积：每小组配制 0.5L，用 100ml 三角瓶分装成 20 瓶，每人 2 瓶。 （2） 、胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制 ①药品及用具的准备；②培养基配制；③调节培养基的酸碱性至 pH5.8；④培 养基的分装；⑤培养基的灭菌。 Ⅲ、胡萝卜细胞悬浮培养和不定芽分化 （1） 、准备工作 ①接种室的清洁和消毒；②超净工作台的开机和消毒；③解剖刀、镊子、已灭 菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；④实验材料的准备（选择无污染、愈伤组 织生长状态良好、色泽新鲜的材料摆放于净工作台上） （2） 、胡萝卜细胞的悬浮培养 将实验 3-1 建立的生长状态良好、色泽新鲜、结构松散、无污染的胡萝卜肉质
愈伤组织培养ppt课件
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分化期的主要表现：
细胞分裂部位和方向发生改变。 分化组织瘤状结构和维管组织的形成。 体积不再减小。 出现各种类型的细胞。
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二、愈伤组织的继代培养
愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营 养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累， 必须转移到新鲜培养基上培养，即继代培养。
一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织。 由外植体形成愈伤组织，标志着组织培养的开始。
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愈伤组织的形成条件
一个成熟的植物细胞经历了脱分化之后， 之所以还能再分化而形成完整的植株，是 因为这些细胞具有全能性。
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外植体的选择与灭菌 植株茎的切段、叶、根、花和种子，或把其中的某些组
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（一）外植体本身
1．遗传型 材料的基因型对愈伤组织的器官 分化有决定性的影响。
2．器官和部位 对有些植物而言，不同的器 官或组织所形成的愈伤组织，在生理上或形态 上存在明显差异。
3．年龄 年龄较幼的外植体，不仅易于诱导 形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。
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（二）培养基
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形态发生方式（二）
胚状体方式 指由培养细胞诱导分化出的 胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成 完整植株。
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四、愈伤组织形态发生的调控
影响因子： （一）外植体本身 （二）培养基 （三）培养环境
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可以从内外因两方面着手，改变诱导期长 短
外因：添加生长激素如2,4－D来刺激处于 静止状态的组织。
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细胞分裂、 分化调节
培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT
0.5mg/L
单细胞或细胞细胞团块的获得
方法（机 械和酶法）
液体培养
细胞活力 细胞分裂和生长 分化和代谢调节
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做今天实验之前:
►前面实验的观察和数据收集 ------胡萝卜愈伤组织的诱导和生长反
应的观察 ►植物细胞工程实验部分实验报告的
胡萝卜愈伤组织悬浮培养体系 的建立和胡萝卜愈伤组织再分
化的诱导
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一、实验目的
• 学会建立胡萝卜细胞悬浮培养体系的方法 和相关操作。
• 通过胡萝卜悬浮培养生产胡萝卜素的整个 过程，了解利用植物细胞悬浮（大量）培 养技术生产有用次生代谢物这一个技术的 主要流程，技术体系和注意事项。
• 学会从愈伤组织诱导细胞再分化的原理和 方法。
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二、实验原理
植物细胞的悬浮培养
• 胡萝卜愈伤组织经过多次继代，在细胞分裂， 细胞形态和分化方面会产生各种变化，合理 调节培养基中激素的种类和浓度配比，可以 诱导疏松性愈伤组织的产生。
• 利用愈伤组织获得单细胞或者小细胞团块， 可以建议细胞悬浮（大量）培养的初代培养 体系，并在此基础之上进行培养物的继代和 保持，进行有用次生代谢物的生产。
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个人观点供参考，欢迎讨论！
撰写
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污染源: 细菌,霉菌?现象?
Hale Waihona Puke • 观察生 有污染 长 反 应 无污染
原因: 外植体?环境?操作?
不生长,发白或死亡
不生长,不死亡,也无愈伤形成 发生部位
愈伤形成 颜色质地 差异原因?
• 拍照
• 分析
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形式
综合性的一篇论文 分开的三次实验报告
实
验
结构上的完整性
报
文字 术语的正确使用
告
内容
图片
不同污染源导致的污染 不同生长情况的图片 不同愈伤组织的图片
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由固体培养转向液体 培养，对细胞而言有 什么差别？
细胞悬浮培养的目的 和所需要的条件？
一个好的培养体系具 备什么样的特征？ 4
愈伤组织再分化的诱导
• 培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT
0.2mg/L
• 培养条件： ？
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三 实验操作
1.悬浮培养体系的建立
外植体
无菌 脱分化
愈伤诱导 愈伤继代
甲醇萃取 β-胡萝卜素
乙醚纯化 β-胡萝卜素 β-胡萝卜素含量的测定
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悬浮细胞的收集
用纱布/滤纸过滤培养液收集细胞
待溶液完全过滤后称纱布/滤纸和细胞的重量
将细胞转移入圆底烧瓶后再次称纱布/滤纸重量 计算细胞鲜重
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甲醇萃取 β-胡萝卜素
将收集好的细胞放入圆底烧瓶中 每克试样加10ml含10%KOH的甲醇溶液 水浴上加热(64.8度以上)避光回流30min
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乙醚纯化
上清液（约10ml）放入分液漏斗 加入150ml乙醚振荡摇匀，静止分层
去除下层甲醇，保留上层乙醚溶液
倒入蒸馏瓶，蒸去乙醚，
残留物用4-5ml己烷溶解
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含量的测定
在波长452nm下测定吸光值A452。
• 己烷中的β-胡萝卜素在波长452nm 下的摩尔消光系数ε1cm1%=2500 ，即溶液的OD452为0.25时每ml含 β-胡萝卜素1μg。
数据
存活率 污染率
分析讨论 污染原因的分析 实验结果的分析
思考和讨论
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具体操作：
1.悬浮培养 选择疏松性愈伤组织
• 8人/组 • 2瓶悬浮培养基/组 • 约1g 细胞/瓶
无菌条件下将愈伤组织的细胞轻轻地剥离和分开
单细胞或小细胞团块
接种入已预先称重的液体培养基,接种后再次称重,获得细胞的鲜重(1g 左右)
悬浮振荡培养1周或更长
称重,计算细胞鲜重的增加(?g )
收集细胞,分离-提取-纯化胡萝卜素,并测定含量
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2. 再分化诱导
• 8人/组 • 2-3瓶/人
建立起来的无菌培养物
无菌条件下切割分开
接种在分化培养基上
适当条件下培养1-3周 培养反应的观察
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3 胡萝卜素的分离提取和含量测定
悬浮细胞的收集