兽药的常用含量测定法及注意事项

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色谱柱的维护
1.最好使用预柱保护分析柱； 2.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的 pH范围； 3.避免流动相组成及极性的剧烈变化； 4.样品要采用0.22或0.45μm滤膜过滤，流动相采用0.45μm滤膜过 滤并脱气； 5.每次做完分析，要进行冲洗：分析用流动相中若无酸、碱、盐类物质， 建议用90％甲醇冲洗30～60min； 如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，要先用10％甲醇冲洗1 小时左右，再梯度走到90％甲醇冲洗30～60min（若用多元泵）。 若长时间不用该色谱柱，要冲洗好后，用纯甲醇或乙腈封存； 6.若流动相中用到离子对试剂，更应该好好冲洗，且该色谱柱最好作为 专用，不能再做其它物质分析用； 7.普通C18柱尽量避免在40℃以上的温度下分析； 8.压力升高是需要更换预柱的信号。
A样 M 对 稀释倍数 含量% 100% A对 M 对 规格
b.吸收系数法 ：
含量%=
A 稀释倍数 含量 100% 1% M 样 规格 E1cm
c.标准曲线法： 借助电脑的Excel电子表格计算
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6.注意事项
（1）空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。如有浑浊，应预
0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 分钟 14.00
峰1 - 14.523
AU
16.00
18.00
峰2 - 17.772
20.00
22.00
24.00
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（二）基本原理
待分离物质在两相间进行分配时，在固定相中溶解度较 小的组分，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定相中溶 解度较大的组分，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达 到分离的目的。 依固定相与流动相极性的不同，分为正相色谱和反相色谱 1.正相色谱法 流动相极性小于固定相
2 - 1 3 .3 5 3
20.0
15.0
1 - 9 .4 8 0
10.0
5.0
0.0
-5.0 0.0
m in
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
16.0
18.0
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1.理论板数(N) ： 说明分离过程， 色谱柱的塔板数越多，柱效越高 2.分离度(R)：应大于1.5 3.重复性：相对标准偏差应不大于 2.0% 4.拖尾因子(T) ：应为0.95-1.05
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三 、色谱分析法
色谱法的分离过程：是被分离组分在互不相溶的两相间
分配平衡的过程，由于混合物中各组分的分配系数不同， 或被吸附剂吸附能力的不同，则被流动相携带移动的速度 也不同，达到分离的目的。
液相色谱法：以液体为流动相Baidu Nhomakorabea气相色谱法：以气体为流动相
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Ⅰ高效液相色谱法
高效液相色谱法：采用高压输液泵将规定的流动相泵
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兽药的常用含量测定法 及注意事项
湖北省兽药监察所 陈向丹 158889311@qq.com
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含量测定定义

含量测定是指用规定的方法测定药物 中有效成分的含量。常用的含量测定 方法有化学分析法、仪器分析法、生 物学方法等。
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容量分析
化学分析法
重量分析
含量测定
紫外分光光度法
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沉淀滴定法：以沉淀反应为基础，多以硝酸银为
滴定液，也称银量法。按所用指示剂的不同分为 铬酸钾指示剂法 铁铵矾指示剂法 吸附指示剂法
非水滴定法：在非水溶剂（有机溶剂与不含水的
无机溶剂）中进行滴定分析的方法。 非水碱量法：是以冰醋酸为溶剂，高氯酸为滴定液， 结晶紫为指示剂，测定弱碱性药物及其盐类 非水酸量法：是在碱性溶液中，以甲醇钠为滴定液， 麝香草酚蓝为指示剂，二甲基甲酰胺等为溶剂， 滴定弱酸性药物
入装有填充剂的色谱柱将待测组分进行分离测定的色谱方 法。
化学键合相色谱：最广泛的
将固定相的官能团键合在载体上，形成的固定相 ，一般属于 分配色谱法，不易流失
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（一）基本概念：
1.色谱图：信号---时间曲线 2.基线：无样品时，用流动相冲洗检测出的流出曲线，一般平行于时间 轴 3.噪声：基线信号的波动 4.漂移：基线随时间的变化 5.色谱峰： 6.拖尾因子：衡量色谱峰的对称性， 应为0.95-1.05 7.峰宽： 8.半峰宽 9.标准偏差 10.峰面积 11.保留时间 12.理论塔板数（柱效）：表示色谱柱的分离效率
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2.滴定液的配制和标定
基准物质：能用来直接配制标准溶液的化学
试剂
滴定度：每毫升标准溶液相当于被测物质的
质量（g或mg），以符号T表示
直接法（不需标定） 间接法（标定）：先将其配制成近似于所
需浓度的溶液，然后利用基准物质或另一 种标准溶液来确定其准确浓度。
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标定：用基准物质或标准溶液准确测定滴定
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二、 分光光度法
分光光度法: 是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范 围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和 定量分析的方法。 光是电磁波,常用的波长范围为： (1)200～400nm----紫外光区； (2)400～760nm----可见光区； (3)760～2500nm（12800cm-1～4000cm-1） ----近红外光区 （4）2.5～25μm（按波数计为4000cm-1～ 400cm-1）----红外光区。
液浓度的过程。
校正因子（F）：表示滴定液准确浓度与标
示浓度的比值。其范围应在1.05～0.95之 间，超出该范围应加入适当的溶质或溶剂 予以调整，并重新标定。
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标定注意事项 ：
a.操作中所用的天平、滴定管、容量瓶和移液管均应校正合格的。 b.标定工作应在室温（10℃～30℃）下进行，并记录标定时的温度。 c.根据滴定液的消耗量选用适宜的滴定管，盛装滴定液前，先用少量滴 定液淋洗三次，盛装滴定液后，应用小烧杯盖住管口。 d.标定中的空白试验，是指在不加供试品或以等量溶剂代替供试液的情 况下，按同法滴定所得的结果。 e.标定工作应由初标者和复标者在相同条件下各做3份平行试验，3份平 行试验结果的相对标准偏差（RSD）不得大于0.1%；初标者的平均值 和复标者的平均值的相对标准偏差（RSD）也不得大于0.15%；最后结 果按初、复标二者的平均值计算，取4位有效数字。 f.配制后的滴定液按药典规定的贮藏条件储存，并在瓶外贴上标签，注 明滴定液名称、标示浓度、真实浓度或F值、配制和标定日期、标定 时的温度、配制者、标定者、复标者等。 g.当滴定液标定时间过长（一般不超过3个月）、或标定与使用时的温 度超过10℃时，应加温度补偿值或重新进行标定，。 h.当滴定液出现浑浊或其他异常情况时，不得使用。倒出剩余的滴定液 不得再倒回原瓶，避免污染。
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（三）固定相和流动相
1.固定相
常用化学键合相，分极性和非极性键合相，如 十八烷基硅烷键合硅胶（C18或ODS）和辛基硅烷键合 硅胶（C8）为最常用的非极性键合相，用于反相色谱法； 氨基和氰基硅烷键合相为常用的极性键合相，用于正 相色谱法。 有机溶剂+水混合
2.流动相
一般为色谱纯试剂，经0.45um的微孔滤膜过滤，需脱气处 理
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紫外-可见分光光度法
物质吸收紫外和可见光区的电磁波产生的吸收 光谱 进行定性和定量分析的方法 1.基本原理：朗伯─比耳定律
1 A Ig ECL T
A为吸收度； T为透光率； L为液层厚度，单位为cm ； E为吸收系数，常用的是百分吸收系数()，其物理意义为当 溶液浓度为1％(g/ml)，液层厚度为1cm时的吸收度值； C为100ml溶液中所含被测物质的量g（按干燥品或无水物 计算）
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（四）仪器的基本结构
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岛津液相色谱仪10AD
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岛津液相色谱仪20AD
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戴安液相色谱仪U3000
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安捷伦液相色谱仪1100系列
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沃特世液相色谱仪2690/2695
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1.色谱柱
柱管-不锈钢，填充硅胶 和化学键合固定相 内径4.6mm 长15cm、20cm和 25cm的三种， 如安捷伦色谱柱、迪马 色谱柱、迪马钻石柱、 大连依利特等。
一般用极性物质作固定相，非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相， 主要用于分离极性化合物，极性小的组分先流出，极性大的组分 后流出。
2.反相色谱法
流动相极性大于固定相
一般用非极性物质作固定相，极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动 相，主要用于分离非极性或弱极性化合物，极性大的组分先流出， 极性小的组分后流出。
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4.吸光度的测定 《中国药典》2010版对吸光度的测定做了 以下要求：
（1）溶剂： （2）空白试验校正： （3）测定波长的检查 （4）供试品溶液的浓度： 应考虑使吸光度在0.3～0.7范围内 （5）狭缝宽度的选择
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含量测定规定波长处应有最大吸收
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5.应用
含量测定： a.对照品比较法：
仪器分析法
高效液相色谱法 气相色谱法
效价测定（生物学法）
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一 、容量分析法（滴定法）
1.滴定分析：是将一种已知准确浓度的标准溶液
滴加到被溶液中，直到化学反应完全为止，根据 标准溶液的浓度和体积求得被测组份含量的一种 方法。 在进行滴定分析时： 一方面要会配制滴定剂溶液并能准确 测定其浓度 另一方面要准确测量滴定过程中所 消耗滴定剂的体积
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⑴滴定：将滴定液从滴定管滴加到被测物质溶液中 的过程 ⑵化学计量点 ：滴加的标准溶液与待测物质按照一 定的化学反应式定量反应完全之点 ⑶滴定终点 ：在滴定过程中，指示剂正好发生颜色 变化的转变点。 ⑷指示剂：能够指示终点变化的试剂。 ⑸滴定误差：滴定终点与化学计量点不一定恰好符 合，它们之间存在着很小的差别，由此引起测定 结果的误差称为滴定误差。 （6）标准溶液 已知准确浓度的溶液（mol/L）
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3.滴定的分类
按反应方式分类： 直接滴定法：滴定液与被测物质直接反应 V F T 100% 含量%= W 1000 间接滴定法：包括剩余滴定和置换滴定
(V0 V ) F T 100% 含量%= W 1000
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按反应类型分： 酸碱滴定：在水溶液中以酸碱中和反应来测定物质含量的
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德国耶拿S100紫外分光光度仪
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岛津UV2600紫外分光光度仪
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2.仪器的基本结构
光源 单色器 吸收池 检测器 数据记录处理
光源：200～400nm为紫外光区（氘灯）、400～850nm 为可见光区 （钨灯）
3.仪器的校正和检定
（1）波长的准确度 （2）吸收度的准确度 （3）杂散光的检查
先过滤，并弃去初滤液。 （2）测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白 对照，采用1cm的石英吸收池。 （3）在测定时或改测其它检品时，应用待测溶液冲洗吸收池3～4次， 用干净绸布或擦镜纸擦净吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面 磨损），放入样品室每次方向应一致。 （4）取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上 油污。使用完后及时用测定溶剂冲净，再用纯化水冲净，用干净绸布 或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防尘保存。若吸收池内外 壁沾污，用脱脂棉缠在细玻璃棒上蘸上乙醇，轻轻擦试，再用纯化水 冲净。 （5）务必注意经常保持硅胶的干燥，目的是保护光学元件和光电放大 器系统不致受潮损坏而影响仪器的正常工作。 （6）仪器经过搬动请及时检查并纠正波长精度，并应经常校准波长精 度。
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2.检测器
常用紫外检测器 其次有二极管阵列检测器(DAD) 荧光检测器 示差折光检测器 蒸发光散射检侧器 电化学检测器和质谱检测器等
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（五） 系统适用性试验
定义：指用规定的对照品对色谱系统进行试验， 应符合要求。 包括理论板数 分离度 重复性 拖尾因子等
30.0 20130325 #2 mA U x t UV _V IS_1 WV L:242 nm 25.0
方法
配位（络合）滴定法：以形成稳定配合物的配位反应为
基础的滴定分析法。 用于金属离子的测定 采用金属指示剂（如铬黑T），如EDTA（乙二胺四醋酸二钠）
氧化还原滴定法：
碘量法：如碘滴定液、硫代硫酸钠滴定液、淀粉指示剂 铈量法：以硫酸铈[Ce（S04）2]作为滴定液 、邻二氮菲作 指示剂 亚硝酸钠滴定法： 溴量法 ：Na2S2O3滴定液 、Br2滴定液