叶绿素荧光是光合作用研究的探针

3、反映PSII光化学效率的荧光参数
● Fv/Fm：是重要的荧光参数之一，名称很多，有：最大
原初光化学产量；PSII最大潜在量子产量；开放的 PSII反 应中心量子效率等 ；我们习惯上称其为“ PSII 最大光化 学效率”。其值恒小于1。
Fv/Fm是暗适应下PSⅡ反应中心完全开放时的最大光化学 效率。反映PSⅡ反应中心最大光能转换效率。
荧光猝灭－任何使荧光产额低于其最大值的过程。 光化学猝灭－由光化学反应引起的荧光产额的降低，它 依赖于氧化态QA的存在。
非光化学猝灭－由非光化学过程如热耗散过程引起的荧 光产额的降低。 非光化学猝灭涉及三个不同的机理：
qE －－ 依赖类囊体膜内外的质子浓度差，暗豫驰的半 时间 T1/2小于1分钟； qT － － 依赖状态 1 向状态 2 的转换，增加向 PSI 的能量 分配；
●Fm’：光适应下最大荧光产量。是在光照条件下照 以饱和脉冲光后测得。 (此时存在非光化学猝灭，即 qNP>0；PSⅡ反应中心又全部关闭qP＝0) ●Fo’：光适应下的最小荧光产量。在测定前照射弱 远红光 (7mmolm-2s-1 ； l>700nm) 测 得 。目的 是激活 PSI ，加速由 PSII 向 PSI 的电子传递，产生“基础荧 光猝灭”(qo) ●Fv：暗适应下最大可变荧光 (Fv=Fm-Fo) 。 ●Fv’: 光适应下最大可变荧光 (Fv’=Fm’-Fo’)。
Brewster(1834)在观察一束太阳光通过 月桂叶片的乙醇提取液时，在反射光方 向看到的是红色，而不是绿色。
1852 年， Stokes 认为这是一种光发射 现象，命名为荧光（fluorescence）。
二．叶绿素荧光的来源及其量子产量
光合机构吸收的光能有三个可能的去处： 1.光化学反应（光合作用、光呼吸、氮代谢） 2. 放热，又称非辐射能量耗散 3. 发射荧光 这三者之间存在此消彼长的竞争关系，所以可以通过 荧光的变化探测光合作用的变化。 通常色素分子是处于能量的最低状态－基态，吸收一 个光量子后，会引起原子结构内电子分布的重新排列。其 中一个低能的电子获得能量而成为激发态。
Фf＝Kf/Kf来自百度文库Kh+Kt+Kq+Kp
在以上各种去激途径中，Фf受Kp的影响最大。
在弱光下，PSII原初电子受体QA处于完全氧化状态（即 PSII反应中心开放），这时： Kp>>Kf+Kh+Kq+Kt
则所吸收的光量子90％以上用于光化学反应，结果得最 小的Фf（约0.6%）
在饱和光下 , 当 QA 完全还原时 ( 即 PSII 反 应中心关闭)，此时 Kp→0 ，其 Фf 最大（约 3 ％，肉眼难以 观测到）。由此可见，植物体内荧光去激 途径仅占总去激途径的一小部分。在溶液 中，Фf 可达30％。
●Fv’/Fm’：光适应下PSⅡ最大光化学效 率。它反映有热耗散存在时，开放的PSⅡ反 应中心的光化学效率。 ● φ PSⅡ=(Fm’-Fs)/Fm’ ： PSⅡ实际 光化学效率。它反映在照光下PSⅡ反应中心 部分关闭的情况下的实际光化学效率。
● ETR (或Prate) = φ PSⅡ× PFDa ×0.5 ： 表观光合电子传递速率(PFDa为实际吸收的 光量子，一般设定为入射PFD的0.84；0.5为 假设光能在两个光系统中各分配50%)
叶绿素荧光动力学研究得到广泛应用的原因
1、包含着光合作用过程的丰富信息 ●光能的吸收与转换 ●能量的传递与分配 ●反应中心的状态 ●过剩光能及其耗散 ●光合作用光抑制与光破坏……等等
2、可以对光合器官进行“无损伤探查”，获得 “原位” 的（in situ）信息。 3、近年来测定仪器的性能和自动化程度越来越高，操 作步骤越也来越简便。
低温荧光
在77K（－196度，液氮中）小，与温度有关的酶反 应和电子传递能力对荧光水平的影响被避免，因此只 有原初光化学反应被反映出来。 77K荧光是测定 PSII光化学效率（ Fv/Fm)的一个重 要工具，健康植物叶片的Fv/Fm值为0.832。 77K 荧光常用于研究两个光系统之间的能量分配。 PSI 在 735nm 处的荧光增加往往是 PSII 向 PSI 增加分配 的结果。
qI － － 与 光 合 作 用 的 光 抑 制 有 关 ， 表 现 为 Fv/Fm 的下降。
叶绿素荧光分析方法示意图
荧光参数的意义
Fv/Fm
ΦPSII= (Fm’－Fs)/Fm’ Fv’/Fm’ P=ΦPSII ×PFD NPQ＝Fm/Fm’－1
最大光化学效率
PSⅡ实际光化学效率 PSⅡ最大天线转化效率 光化学反应速度 非光化学猝灭
在理论上，荧光量子产量（Фf）的定义为：
Фf=F/Ia F-----发射荧光量子总数
Ia-----吸收光量子总数
Фf 的大小取决于各种去激途径的竞争。
若 Kf 、 Kh 、 Kt 、 Kq 和 Kp 分别代表荧光、热耗散、激 发能传递、荧光猝灭和光化学反应的去激速度常数，则 Chl a荧光量子产量（Фf）与各种K的关系如下：
系数qP＝1，非光化学猝灭系数qNP＝0。一般认为，这部 分荧光是在天线中的激发能尚未被反应中心捕获之前，由
天线叶绿素发射出的。
当存在天线热耗散时，Fo会降低；当反应中心失活或
遭到破坏时，Fo会升高。已知过高的温度往往使PSII放氧
复合体脱离，反应中心失活，此时Fo会明显提高。因此， 可以用Fo随温度的变化动态来反映高温对光合器的危害， 并用来评价植物的抗热性。
qp=(Fm’－Fs)/(Fm’－F0) 光化学猝灭系数
qN=(Fm’－F0’)/(Fm－F0) 非光化学猝灭系数 D=1－Fv’/Fm’ 吸收光能通过热耗散消耗的部分
1、基础荧光参数 ●Fo：最小荧光产量，也称初始荧光产量或基础荧光产 量 。是对充分暗适应叶片（PSⅡ反应中心处于完全开放
状态）照以极弱的测量光后发出的荧光。此时光化学猝灭
调制荧光
用于测定荧光的光源被调制，也就是使用很高频率不 断开关的光源，而且检测器通过选择性放大仅仅检测这种 调制光激发的荧光，因此可以在背景光，特别是在田间很 强的太阳光存在的情况下测定相对的荧光产额。
荧光猝灭――使荧光产量从它的最大值（Fm）下降的各
种过程。分为两大类： 光化学猝灭（qP）, 代表被开放的PSII反应中心捕获并 转化为化学能的那部分能量。 非光化学猝灭（qN）, 代表各种非光化学去激过程所耗 散的能量。
叶绿素荧光是研究光合作用的探针
叶绿素荧光是研究光合作用的一个敏感的探针，叶 绿素荧光分析具有灵敏、简便，快速和对植物无破坏损 伤的特点。它既可以用于叶绿体、叶片，也可以遥感用 于群体、群落。它既是室内光合基础研究的先进工具， 也是室外自然条件下诊断植物体内光合机构运转状况、 分析植物对逆境响应机理的重要方法。 20世纪80年代以来，调制荧光仪，特别是便携式荧 光仪的商品化，使荧光分析在光合作用研究中得以广泛 应用。而且它在与光合作用紧密相关的植物学和农学等 许多学科的研究中也得到广泛的应用。
2、荧光猝灭参数
● qP =(Fm’-Fs)/(Fm’-Fo’) ：可变荧光的光化学猝灭
系数，它反映了PSⅡ反应中心的开放程度。 ● qNP =(Fm-Fm’)/(Fm-Fo’) ：可变荧光的非光化学猝 灭系数。它反映了PSⅡ反应中心关闭的程度。 ● NPQ =(Fm-Fm’)/Fm’ =Fm/Fm’-1 ：非光化学猝灭
调制式荧光仪测定原理
MR-经调制的弱测量光，2mmolm-2s-1，l＝583nm(绿光)；频率600Hz AR-作用光, 白光, 持续照射, ； SR-饱和脉冲光, 白光, 8500mmolm-2s-1, 照射0.5s FR-弱远红光，7-10mmolm-2s-1；l >700nm ； D-荧光检测器；A-信号放大器；SF-短波滤光片；LF-长波滤光片
●Fv/Fo： 是Fv/Fm的另一种表达形式，但从度量上，该
指标变化范围大，比Fv/Fm更易区别不同处理间的差别。 两个指标的意义基本相同。一般没有必要同时用Fv/Fm和 Fv/Fo来表示PSII最大光化学效率。
在非胁迫条件下，Fv/Fm的值很稳定， 据Bjorkman and Demmig对大量植物的测定， 其平均值为0.832+0.004，但在逆境条件下， Fv/Fm显著降低。正因为如此，所以Fv/Fm 的降低常作为发生光抑制或PSII遭受其他伤 害的指标。 在一些研究论文中，CO2同化的表观量子 效率的降低也常常作为光抑制的指标，但其 意义是不同的。
特别是在植物抗性生理、植物生态学、 作物生理学以及藻类学的研究中取得了众 多研究成果。 从应用方面，叶绿素荧光，特别是叶 绿素荧光动力学，已经在鉴定植物的各种 抗性、筛选抗除草剂植物、检测环境污染 及植物对污染的反应、作物增产潜力苗期 预测、甚至植物遥感和营养缺乏症等许多 领域得到应用。
一．叶绿素荧光的发现：
四. 荧光动力学技术在逆境生理研究中
的应用
叶绿素荧光动力学特性包含着丰富的信 息。在理论上，可以用来研究光合作用过 程能量吸收、传递与转换的机理。但对于 植物生理生态学研究者而言，主要兴趣集
中在光合作用的 能量利用效率 、 过剩光能
导致的光合作用 光抑制 、 光破坏 ，以及 光破坏防御机制等方面。
三、叶绿素荧光诱导动力学及其测量
叶绿素荧光诱导现象是 1931 年由德国 Kautsky 首先发 现的，所以又称Kautsky效应。叶绿素荧光诱导动力学是 指当暗适应的绿色植物材料转到光下时，其体内叶绿素 荧光强度会产生有规律的随时间的变化（图）。
有几个特征性的点，分别被命名为O、I、D、P、S、 M和T。 在照光的第一秒钟内，荧光水平从O上升到P, 这一段被 称为快相；在接下来的几分钟内，荧光从P下降到T，这 一段被称为慢相；快相与 PSII 的原初过程有关，慢相则 主要与类囊体膜上和间质中的一些反应过程有关。
●Fm：最大荧光产量(Maximal
fluorescence)，
是PSⅡ反应中心完全关闭时的荧光产量。此时 光化学和非光化学荧光猝灭均为0 (qP＝0， qNP＝0)。 Fm可反映通过PSⅡ的电子传递最大潜力。通 常叶片经暗适应至少20min后照以饱和脉冲光 后测得。
●Fs:
稳态荧光产量。即在光照下，光-暗反 应达到动态平衡时的荧光产量。
热耗散
激发能
光化学反应 形成同化力
CO2固定 光呼吸 Mehler 反应 N代谢
荧光
从 Chl b到Chl a的传递效率几乎达100％，故检测不
出Chl b的荧光。植物体内发射的荧光大部分来自PSII 天线色素系统(Chlorophyll-a fluorescence) , 而PSI色素 系统基本不发射荧光。实际上，荧光发射出的光能在 数量上是很少的，还不到吸收总光能的3％。
叶绿素荧光诱导动力学曲线
非调制式荧光仪：
可把荧光诱导动力学曲线划分为： O 点（原 点）→I（偏转）→D（小坑）→P（最高峰） → S （半稳态） → M （次峰） → T （终点）这 几相（phase）。 其中从 O→P 相为快速上升阶段（约 1 － 2 秒）， 从P→S相为荧光慢速下降（猝灭）阶段（4－ 5分钟）。
Fig.1 Responses of Fv/Fm to chilling treatment and subsequent recovery. Subsequent recovery was conducted under 25 C and 100 m mol m-2 s-1 PFD. ▲, chilling treatment under low irradiance; , chilling treatment in the dark. Each point represents the mean SD of 5 measurements on separate leaves.
经过暗适应后的叶片从黑暗中转入光下，叶片的荧光产 量随时间而发生的动态变化，称为 Kautsky 效应，荧光 的这种动态变化所描绘出的曲线即Kautsky 曲线。
●完整的 Kautsky 曲线可分为两部分，从开始照光到荧 光产量达到最大值时的荧光上升部分，所用时间很短， 只需0.5-2.0s，称为快速荧光动力学曲线；此后，荧光产 量降低，并逐渐达到一个稳恒值，时间大致需要8-10min， 称为慢速荧光动力学曲线。 ●荧光产量降低是荧光猝灭 (Quench) 的结果。所谓荧光 猝灭，是指叶绿素吸收光量子后的部分激发能通过光化 学途径或以热的方式散失，从而使荧光发射量减少的现 象。