儿童麻疹疫苗接种后远期抗体水平及Th1／Th2细胞因子分泌特征

儿童麻疹疫苗接种后远期抗体水平及Th1／Th2细胞因子分泌特征

目的通過检测儿童接种后远期血清抗体水平和T细胞亚群分泌细胞因子，评价其体液免疫持久性及其对细胞免疫功能的影响。方法2013年1月～2015年7月在深圳市龙岗区妇幼保健院儿童保健科体检的儿童，筛选麻疹疫苗接种的儿童32名，接种时间为3～10年，取外周血2 ml分离血清，用ELISA法检测麻疹抗体；根据麻疹抗体水平检测结果将所有受试者分组，即低应答组（9.00～19.99 IU/L）、中应答组（20.00～199.99 IU/L）和高应答组（200.00～320.00 IU/L）；将麻疹疫苗接种的32例儿童血液标本分离的外周血单个核细胞（PBMC）进行培养，培养中设计不加麻疹疫苗的对照组、加疫苗刺激的实验组。用细胞因子微球检测技术检测细胞培养上清液中Th1细胞因子TNF-α和Th2细胞因子IL-10。结果抗体阳性率为81.2%，抗体水平为（115.03±95.20）IU/L；高应答组抗体水平显著高于中应答组和低应答组（P＜0.05）；实验组和对照组因子水平的中位数分别2021.81 pg/ml（TNF-α）、2566.93 pg/ml（IL-10）和1481.72 pg/ml（TNF-α）、1861.89 pg/ml（IL-10），实验组的TNF-α和IL-10水平显著高于对照组（P＜0.05）。结论儿童麻疹疫苗接种后抗体阳性率较高，且接种后体内存在免疫记忆性T细胞，在接触抗原刺激后可介导细胞免疫应答。

[Abstract]Objective To detect the serum antibody level and cytokine secretion of T cell subsets in children after vaccination，and to evaluate the effect of humoral immunity and cellular immunity.Methods A total of 32 children with measles vaccination for 3-10 years were selected in Children′s Health Care Department of Longgang District Maternal and Child Health Care Hospital of Shenzhen from January 2013 to July 2015. 2 ml blood samplewas used for measure measles antibody titers by ELISA from isolated serum，who were divided into low response group （9.00-19.99 IU/L），middle response group （20.00-199.99 IU/L）and high response group （200.00-320.00 IU/L）according to the results of measles antibody levels.The peripheral blood mononuclear cells （PBMC）were isolated from the other 3 ml blood sample.The experimental group，stimulated by measles vaccine （3.0 μg/ml）and control group were set，without stimulation.Both groups were cultured and taken to detect TNF-α and IL-10 by Cytometric Bead Array （CBA）.Results The positive rate of antibody was 81.2%，of which the level was （115.03±95.20）IU/L.The antibody level in the high response group was significantly higher than those in the medium response group and low response group （P＜0.05）.The medians of factors in the experimental group and control group were respectively 2021.81 pg/ml （TNF-α），2566.93 pg/ml （IL-10）and 1481.72 pg/ml （TNF-α），1861.89 pg/ml （IL-10），and the TNF-α and IL-10 levels in the experimental group were significantly higher than those in the control group （P＜0.05）.Conclusion Thepositive rate of antibody is high in children after vaccination with measles vaccine，and there are immune memory T cells，which can mediate cell-mediated immune response when exposure to antigen stimulation.[Key words]Measles vaccine；Antibody；Cytokine；Long-term effect；Immunological memory

麻疹（measles vaccine，MV）是幼儿时期常见的急性呼吸道传染病，主要由麻疹病毒感染所致传染性极强。肺炎、脑炎等均是麻疹麻疹患儿常见并发症，也是导致病死率居高不下的主要原因。据统计，截止19世纪90年代，全球约有4000万麻疹病例，约有100万死亡，较麻疹疫苗接种前显著降低[1]。我国于2006年参考WHO建议，提出综合性消除麻疹策略，该策略中将儿童常规免疫干预作为基础，并鼓励强化麻疹疫苗免疫處理，旨在提高幼儿群体的机体抵抗能力[2]。此后我国麻疹发病率降至2012年的最低点接近4.5/100万，但从2013年开始又明显回升，至2015年的发病率接近38/100万，死亡人数也从2012年的8人升至2015年的32人[3]，未能达到世界卫生大会确定的目标，即截至2015麻疹发病率0.05），具有可比性。

1.2方法

1.2.1主要试剂与仪器麻疹病毒（MV Ab）ELISA试剂盒由深圳晶美生物科技公司提供；TNF-α CBA、IL-10 CBA试剂盒均由美国Becton Dickinson公司提供；胎牛血清、改良型RPMI-1640培养液均由宝生物（大连）公司提供；麻疹减毒活疫苗购自上海生物制品研究所；CO2培养箱购自美国RAD公司；流式细胞仪（FACS Calibur型）购置美国贝克曼库尔特公司。

1.2.2分组方法将麻疹疫苗接种的32例儿童血液标本分离的PBMC进行培养，培养中设计不加麻疹疫苗为对照组，加疫苗刺激为实验组。

1.2.3检测方法标本无菌采受试者静脉血5 ml，分装。其中2 ml自然凝固，并离心分离，取上清液用测麻疹抗体水平，所用方法为ELISA，分离血清后，参照说明书步骤测得标准品的OD值及样品OD值，然后计算出标准曲线回归方程，可将OD值代入上述方程中，从而得出样品浓度；另3 ml置于抗凝管中，于5 min 后加入3 ml D’Hank’s液。摇晃均匀后向其中加入2 ml淋巴细胞分离液，离心，并对淋巴细胞实施洗涤处理。加2 ml培养液，离心分离，取沉淀细胞，调整淋巴细胞，使其浓度达细胞数1×106/ml。将上述样品加入96孔培养板中，每孔样品量为100 μl。每组设置3个复孔，其中实验组加入浓度为3.0 μg/ml的麻疹疫苗；对照组则加等量无菌生理盐水，并于每孔中加入100 μl浓度为10%的培养液，置CO2培养箱中（浓度为5%），培养条件：37℃，50 h。取上述样品离心分离，转速为800 r/min，处理时间为5 min。用流式CBA法检测细胞因子操作步骤参照说明书制作标准品与待测样本，BD-FACS Calibur流式细胞仪检测细胞因子TNF-α、IL-10。收集完毕后，用FCAP Array v1.0软件绘制标准曲线并分析数据。

1.3观察指标

观察本组患儿血清麻疹抗体浓度、不同组间血清麻疹抗体水平高低检测结果、接种麻疹疫苗不同时间抗体水平结果、接种麻疹疫苗不同次数的抗体检测结果、实验组和对照组麻疹疫苗接种儿童TNF-α和IL-10水平检测结果。

1.4统计学方法