罗氏实时荧光定量PCR仪

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分子信标（Molecular Beacon Probe）
独特的颈环结构，由非特异的颈和特异的环组成， 探针的5’端标记荧光分子，3’端 标记一个吸收或淬灭 荧光的分子 。自身环化时仪器检测不到荧光，在PCR 反应的退火阶段，探针因与模板链杂交而打开，使5’ 端荧光分子与3’端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器 就会检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产 物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增 强来计算PCR扩增产物的增加量。
两种石英玻璃毛 光学性好，反应体系小，节约试剂成本,适合 细管体系 (20ul 和 多种用途。
100ul)
检测光路范围
530nm, 555nm, 610nm, 640nm, 六个波长，并解决相关荧光素荧光干扰问题 670nm, 710nm.
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LightCycler 软件 4.0
更先进的自动定量方法 全新的相对定量软件 全自动熔点曲线分组 全自动熔点温度提示 简化数据和用户管理
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定量PCR技术的产生
1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染 料法插至双链DNA，经改装的带有冷CCD的PCR 仪检测样品的荧光强度
PCR循环 = 双链DNA = 染料 = 荧光
后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I 取代EB
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荧光定量实时PCR与普通PCR的比较
实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时 地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期
降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提 高了PCR反应的特异性
增加定量的精确性 全程监控，准确的算法进行定量
结果分析更加快捷方便，无需跑胶
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罗氏产品介绍以及与 同类产品之间的对比
实时荧光定量PCR 仪
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一、实时荧光定量PCR的原理
荧光定量 PCR
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对 结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。
荧光定量 PCR仪
荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的 PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。
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PCR领域最聪明的革新 – LightCycler荧光定量PCR 系统
超高速 实时在线监测 高灵敏 范围广 开放性 六个荧光通道 最小化 灵活性 闭管分析
30至40分钟完成PCR过程 收集每一循环的数据并立即显示于联机电脑上 在一个基因组当量中可检测出单基因拷贝 可检测10－1010拷贝线性范围，无需稀释样品 全开放，成为国内外试剂厂家的首选开发平台 轻易实现内标、内对照或多重PCR 定量反应体积降至10－20ul，费用低廉 支持水解探针、杂交探针及 SYBR Green I 消除污染风险
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杂交探针（HybProbe）检测模式
设计与检测区互补的分别带有不同染料标记的一对 寡核苷酸（既杂交探针），在与扩增的DNA片断杂交 时，两种染料互相接近。其中供体荧光染料受外来光 源激发后，将能量传递给附近的受体染料，既发生荧 光共振能量转移（FRET），从而释放出受体染料分子 的发射波长荧光信号。荧光信号的强度和DNA的产量 成正比。其他非特异性产物由于不会与探针杂交，因 而不产生信号干扰。
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LightCycler 结构分析
激发光源
Rodenstock-LED （发光二极管） 冷光源，免维护，开机可以马上进行操作。
检测系统 加热方式 反应体系
光学倍增管 (PMT)
空气加热
灵敏度高，宽检验范围,背景低，无边缘效应
管间差小，热传导速率20℃/秒，温控变化准确 （0.05-20℃/秒）。
实现快速PCR
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光学结构
特点：
1、免维护的LED冷光源，寿命长达2万小时以上
2、光学倍增管（Rodenstock ）
3、多达6通道（LC2.0）和3通道（LC1.5）实时检
测
优点：
1、毛细管光学特性将光线散射、衍射降至最低，
避免LED 功率低的问题
2、免维护，带自动检验功能
3、轻易实现内标、内对照及多重PCR
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Lightcycler 的分析模式
适用于所有的通用探针及染料分析模式： SYBR Green I（荧光染料） TaqMan（水解探针） Molecular beacon（分子信标） Lightcycler上开发独有的分析模式： Hybridization Probe Format（杂交探针） SimpleProbe （单探针）
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SYBR-Green I 检测模式
SYBR Green I能选择性地与双链DNA结合，在 外界光源激发下产生强烈荧光。在PCR过程中， SYBR Green I可与新合成地双链DNA结合，产生地 荧光信号强度与双链DNA含量成正比，荧光检测在 每一循环的延期后进行。 SYBR Green I与非特异性 双链DNA（如引物二聚体）结合产生的干扰可通过 融解曲线分析而得到解决。
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水解探针（Taqman ）检测模式
同时标记有荧光发光分子和荧光淬灭分子的一条 探针在激发光作用下，发光分子所产生的荧光可被淬 灭分子吸收，因而检测不到荧光。在PCR延伸时，因 Taq酶具有的5，－3，核酸外切酶活性，可降解荧光探 针，使荧光发光分子与荧光淬灭分子分开，在外界光 源激发下即可发出荧光，荧光强度与PCR扩增产物量 有关。
可容纳32个样品的 卡盘
将荧光仪定位的 分档器发动机
光学倍增管 7
Lightcycler 2.0 结构分析
空气加热系统
光
LED激发光源
纤
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PMT
检 测 系 统
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热力学结构
特点： 1、空气加热 2、毛细管反应体系
优点: 1、升降温速度快（0.05 ℃ -20℃/秒）， 2、体系均一，不存在边缘现象 3、把反应体系缩小到0-20ul，节省试剂成本
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一、LC1.5和LC2.0
LightCycler荧光定量PCR系统
LC1.5
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LC2.0
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Lightcycler 1.5 结构分析
以空气加热及 冷却迅速改变 温度
加热线圈
将样品置于 光学仪上的 分档器发动 机
热室
风扇 滤器 免维护的 LED可光编源辑ppt
带பைடு நூலகம்极高表面积/ 容量比例的密封 20l毛细管