脲酶的测定方法
脲酶活性的测定
大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。
尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。
简便法测定脲酶含量
简便法测定脲酶含量
简便法测定脲酶含量通常使用间接法，即测定尿液中尿素的产生量。
具体方法如下：
材料：碱性磷酸盐缓冲液、尿液样品、脲酶试剂（含间苯二酚）、少量尿素。
步骤：
1. 准备样品：取适量的尿液样品。
2. 离心：将尿液样品离心，以去除杂质。
3. 反应液的制备：在试管中加入适量的碱性磷酸盐缓冲液和脲酶试剂。
4. 反应液的预热：将试管置于恒温水浴中，预热至适当的温度。
5. 打断反应：将预热的反应液加入样品中，迅速混合，打断反应。
6. 倍化尿素：将适量的尿素加入反应液中，促使脲酶的活性增加。
7. 反应时间：将试管放置在恒温水浴中反应一定时间。
8. 终止反应：加入酸性溶液，终止反应。
9. 高速离心：将反应液离心，以去除沉淀。
10. 测定吸光度：取上清液，使用分光光度计测定吸光度。
11. 计算脲酶含量：根据吸光度测定结果，通过对照物质的标准曲线，计算脲酶含量。
需要注意的是，尽管这种方法相对简便，但仍需要一定的实验操作技巧和仪器设备，同时还需要对研究对象进行合适的前处理，以提高测定的准确性和可靠性。
脲酶快速检测方法(1)
大豆制品中尿素酶活性的测定方法
方法一尿素酶活性快速测定法——酚红法（粗略法）
1. 原理：尿素酶 +
尿素 氨气（用酚红作指示剂） 2.试剂
（1） 0.1N 氧化钠：称0.4g 氢氧化钠溶于100ml 水中。
（2） 0.1N 硫酸：将1.4ml 浓硫酸溶于l000ml 水中（先加水后加入硫酸） 3.尿素—酚红溶液：
0.14g 酚红溶于35ml 水中+7ml0.1N 氢氧化钠
混合 0.1N 硫酸滴定 琥珀色 21g 尿素溶于300ml 水中
方法：将一匙粉碎过的黄豆粕放入小玻皿中，将已调好的尿素——酚红溶液加入小玻皿中的豆粕上，直至完全锦湿，停留5min ，观察豆粕的红色反应。
稀硫酸0.2N
尿素—酚红试剂：将1.2g 酚红溶解于30ml0.2N 的氢氧化钠中，用蒸馏水将之稀释至约300ml,加入90g 尿素（分析纯）并溶解之，用蒸馏水稀释至2L ，加入14ml1.0N 硫酸或70ml0.2N 的硫酸；用蒸馏水稀释至最后体积3L ；溶液应具有明亮的琥珀色。
（过段时间溶液变为深桔红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次成为琥珀色。
方法：将一匙粉碎过的黄豆粕放入小玻皿中，将已调好的尿素——酚红溶液加入小玻皿中的豆粕上，直至完全锦湿，停留5min ，观察豆粕的红色反应。
溶液保质期最好3个月，最好一个月内用完。
脲酶实验的测定实验报告
一、实验目的1. 了解脲酶的基本性质及其催化反应原理。
2. 掌握脲酶活性测定的实验方法。
3. 通过实验验证脲酶活性受温度、pH值等因素的影响。
二、实验原理脲酶是一种水解脲的酶，可以将脲分解为氨和二氧化碳。
在酸性条件下，氨与苯酚反应生成蓝色络合物，通过测定蓝色络合物的吸光度，可以计算出脲酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：脲酶溶液、脲底物、苯酚、硫酸、NaOH、pH缓冲液、蒸馏水、移液器、试管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。
2. 实验仪器：移液器、试管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。
四、实验方法1. 配制脲酶溶液：取一定量的脲酶粉末，加入适量的蒸馏水溶解，配制成一定浓度的脲酶溶液。
2. 配制底物溶液：将脲底物与苯酚按照一定比例混合，加入适量的硫酸，配制成底物溶液。
3. 脲酶活性测定：a. 取一定量的脲酶溶液，加入底物溶液，混匀；b. 将混合液置于恒温水浴锅中，设定一定的温度；c. 在一定时间内，每隔一定时间取样，用紫外可见分光光度计测定吸光度；d. 根据吸光度计算脲酶活性。
五、实验结果与分析1. 温度对脲酶活性的影响：a. 在不同温度下（如25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）进行实验，记录吸光度；b. 根据吸光度计算脲酶活性；c. 分析温度对脲酶活性的影响。
2. pH值对脲酶活性的影响：a. 在不同pH值条件下（如pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）进行实验，记录吸光度；b. 根据吸光度计算脲酶活性；c. 分析pH值对脲酶活性的影响。
六、实验结论1. 温度对脲酶活性的影响：在一定范围内，随着温度的升高，脲酶活性逐渐增强；超过最适温度后，脲酶活性逐渐降低。
2. pH值对脲酶活性的影响：在一定范围内，随着pH值的升高，脲酶活性逐渐增强；超过最适pH值后，脲酶活性逐渐降低。
七、实验注意事项1. 实验过程中应严格控制温度和pH值，以保证实验结果的准确性。
2. 操作过程中注意移液器的准确使用，避免污染和误差。
脲酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
1h内再分光光度计上于578nm处比色。
脲酶的测定方法
脲酶的测定方法一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
土壤脲酶活性测定
土壤脲酶活性测定（NH 4+释放量法）脲酶是酰胺水解酶的一种，在自然界中分布广泛，植物、动物和微生物细胞中均含有此酶。
土壤中的脲酶主要来源于微生物和植物。
脲酶催化尿素的水解反应：22232H NCONH +H O 2NH +CO −−−→脲酶在反应过程中，氨基甲酸盐是中间产物。
脲酶还能够催化羟基脲、二羟基脲、半卡巴脲等化合物的水解。
脲酶含有镍，分子量在151，000 Da ～480，00 Da 之间。
能够抑制脲酶活性的化合物有含硼化合物、尿素衍生物、甲醛、原子量大于50的重金属的盐、含氟化合物、醌和多元酚、抗代谢剂、杂环硫醇等。
1. 试验原理通过对新鲜土壤与尿素溶液在37℃培养2h 后测定氨释放量，估计脲酶的活性 (Tabatabai, 1994)。
2. 试验仪器50mL 容量瓶；培养箱或恒温水浴；蒸馏定氮仪。
3. 试验试剂（所用试剂均为分析纯）a. 甲苯（C 6H 5CH 3）;b. 缓冲液：三（羟甲基）氨基甲烷[c （C 2H 8O 3N 3）=0.05mol ·L -1, pH9.0]：称取6.1g 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris (hydroxymethyl) aminomethane ）溶入700mL 蒸馏水中，用c （H 2SO 4）=0.2mol ·L -1的硫酸溶液调pH 至9.0，再用蒸馏水定容至1000mL;c. 尿素溶液{c [CO(NH 2)2]=0.2 mol ·L -1}：称取1.2g 尿素溶入约80mL 缓冲液中，后用该缓冲液定容至100mL 。
尿素溶液要当天配制，并在4℃下保存备用；d. 氯化钾硫酸银混合溶液[c （KCl ）＝2.5mol·L -1]－[ρ（Ag 2SO 4）=100mg·L -1]：先将100mg Ag 2SO 4溶于700mL 蒸馏水中，再加入188g 的KCl （分析纯）使之溶解，在定容至1000mL ；e. 氧化镁（MgO ）：于高温电炉中，将氧化镁在600℃-700℃温度下灼烧2h ，再放置于干燥器中冷却，贮于瓶中；f. 混合指示剂：溶解0.099g 的溴甲酚绿和0.066g 甲基红于100mL 的乙醇（95％纯度）中；g. 硼酸指示剂溶液[ρ（H 3BO 3）=20g·L -1]：溶解20g 硼酸于950mL 的热蒸馏水中，冷却，加入20mL 的混合指示剂，充分混匀后，小心滴加氢氧化钠溶液[c (NaOH)=0.1mol·L -1],直至溶液呈红紫色（pH 约4.5），稀释成1L ；h. 硫酸标准溶液[c （1/2H 2SO 4）=0.005mol ·L -1]。
土壤脲酶测定
土壤脲酶测定一、实验目的1.了解土壤中脲酶的活性及其对氮素转化的重要作用；2.通过脲酶测定，评估土壤中氮素的转化和利用效率；3.为制定合理的施肥和作物管理措施提供依据。
二、实验原理脲酶是一种能够催化尿素分解的酶，在土壤中起着至关重要的作用。
它能够将尿素分解成氨和二氧化碳，释放出的氨可以被植物吸收利用。
因此，脲酶的活性可以反映土壤中氮素转化的能力。
本实验采用靛酚比色法测定脲酶活性。
该方法基于脲酶催化尿素分解产生的氨与靛酚反应生成靛酚蓝，其颜色深浅与脲酶活性呈正比。
通过比色法可以测定样品中脲酶的相对活性。
三、实验步骤1.样品采集与处理：选取具有代表性的土壤样品，将其风干、磨碎并过筛。
称取适量样品于试管中，加入适量的磷酸盐缓冲液，充分搅拌均匀。
2.实验溶液配制：配制尿素溶液（100mmol/L）和靛酚溶液（0.05mol/L）。
3.对照试验：取一支试管，加入等体积的磷酸盐缓冲液和尿素溶液，充分混合后放置在30℃恒温箱中30分钟。
然后加入靛酚溶液并充分混合，放置10分钟。
最后加入适量碳酸钠溶液，使溶液呈碱性，终止反应。
以靛酚蓝为标准品，在625nm波长下测定吸光度。
4.样品试验：取适量样品于试管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液和尿素溶液，充分混合后放置在30℃恒温箱中30分钟。
然后按照对照试验的步骤加入靛酚溶液并测定吸光度。
5.数据记录与处理：记录对照试验和样品试验的吸光度值，计算脲酶活性。
四、结果分析1.对照试验与样品试验吸光度值的差异反映了样品中脲酶的活性。
对照试验中，由于没有脲酶的作用，尿素分解较慢，因此靛酚与氨的反应较慢，吸光度值较低。
而在样品试验中，由于样品中存在脲酶，脲酶催化尿素分解加速，导致靛酚与氨的反应加快，吸光度值较高。
2.通过比较对照试验和样品试验的吸光度值，可以计算出样品的脲酶活性。
具体计算方法为：脲酶活性（mg/g·h）= [(样品吸光度-对照吸光度)/(对照吸光度×时间×样品质量)]×100%。
脲酶活力测定(纳氏试剂比色法)
实验四脲酶活力测定(纳氏试剂比色法)一、实验原理脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。
反应式：(NHO2CO+ HO ^脲酶＞2NH3 + CO2氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。
反应式：NH・ F2O+ 2KHgl4 + 3KOH ■—HgO • HgNH + 7KI + 3H 20(纳氏试剂) (碘化氨氧合汞)二、实验步骤将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：取3支干净干燥试管，编号：1空白；2、标准；3、样品。
按下表步骤加入实验制备的酶液及试剂：(7)从样品管加尿素开始计时，准确反应5min,立即向样品管(3号管)加1 mol -L HSQ 1.00mL，终止反应。
(8)另取3支干净试管，分别对应于上面各反应液进行显色(9)各管混匀后，30min内，用分光光度计测试:比色记录A260nm A i A A3三、结果计算脲酶活力(U • mL -1) = ( A 3 - A 1 ) *标准管中的NH微摩尔数(A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数式中：n为酶样品的稀释倍数四、仪器和试剂1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。
2、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷酸盐缓冲液适当稀释。
3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。
4、磷酸盐缓冲液（pH7.0）: 6.70 g Na2HPO4 • 2 H2O , 3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。
5、 1 mol • L -1 HSQ溶液：56mL浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL蒸馏水的容量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。
6、硫酸铵标准溶液：称取在60° C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL。
此溶液含NH3为40卩mol • mL-1。
1.脲酶活性测定 尿素残留量法
脲酶活性测定（尿素残留量法）（Tabatabai，1994）1.原理：通过对新鲜土壤与尿素溶液在37︒C培养5h后测尿素残留量，估计脲酶的活性。
2. 仪器：50ml 容量瓶；培养箱或恒温水浴；沸水浴；分光光度计3. 试剂（所用试剂均为分析纯）1.) 尿素溶液：称取2.0 g 尿素，用700 ml 水溶解，定容1000 ml，低温保存备用。
2.) 氯化钾（2.0 mol L－1）－乙酸苯汞溶液：称1500g氯化钾溶于9L水中，再加入1L 乙酸苯汞（PMA）（称取50mg乙酸苯汞溶入1L水中）。
3.)显色剂：在进行显色反应之前，将25ml 二乙酰一肟和10ml 氨基硫脲加入到500ml 混酸溶液中，即配即用。
(a．二乙酰一肟（DAM）：称2.5g二乙酰一肟溶于100ml 水中; b.)氨基硫脲（TSC）溶液：称0.25g 氨基硫脲溶于100ml 水中; c.)混酸溶液：取磷酸（85％）600ml 和浓硫酸20ml，加入到200ml水中，再用水定容至1000ml。
)5.)尿素标准溶液：称干燥过的尿素0.2500g溶于约750ml的氯化钾－乙酸苯汞溶液中，并用该溶液定容至1L。
在冰箱中保存。
配制标准溶液系列：将尿素标准溶液用氯化钾－乙酸苯汞稀释10倍。
分别吸取0，1，2，4，6，8ml 该溶液至50 ml 容量瓶中，并用KCl－PAM 溶液补至10ml。
然后和样品同时加入显色剂30 ml、进行30 min沸水浴及冷却后定容和比色。
4. 步骤称取相当于5g干重的新鲜土样（＜2 mm ）放置于150 ml 具塞三角瓶中, 加入5 ml 尿素溶液(试剂1), 混匀,塞上瓶塞,在37 ︒C条件下培养5 h. 加入50 ml 的氯化钾-乙酸苯汞溶液,盖上瓶塞后在振荡机上振荡1h后过滤.分析仪上测定（或采用手动方法：吸取滤液1-2ml(最多含200μg尿素)放入50 ml 容量瓶中，并加入氯化钾-乙酸苯汞溶液10 ml 和显色剂30 ml。
脲酶、蛋白酶和L-天冬酰胺酶活性测定方法
一、脲酶活性测定方法（苯酚钠-次氯酸钠比色法）1.称取5g过100目筛的风干土样于50ml容量瓶中，加入1ml甲苯使其与土样充分混匀静置15min，使土壤中微生物被完全杀死；2.往瓶中加入10ml 100g/L的尿素溶液和20ml柠檬酸盐缓冲液，仔细混匀后置于37℃恒温下培养24h；3.用加热至38℃的蒸馏水稀释至刻度线（甲苯应浮在刻度线之上），摇匀，过滤；4.每一土样都设置用水代替基质的对照；对整个实验，设置无土壤的对照，以检验试剂的纯度；5.吸取3ml滤液到50ml容量瓶中，用水稀释至15ml，然后加入4ml苯酚钠溶液，并加入3ml次氯酸钠溶液，每次加完试剂都要摇匀；6.静置20min后，使其充分显色，定容显色液，于分光光度计578nm处比色，脲酶活性以24h后1g土壤中铵态氮的mg数表示。
1.取25ml酪氨酸基质溶液于100ml三角瓶中，于30℃水浴保温；2.加入5g鲜土，1ml甲苯，混匀后，30℃恒温箱中培养48h；3.取出三角瓶，加入25ml蛋白质沉淀剂，静置30min，待蛋白质沉淀后用干滤纸过滤；4.取2ml滤液于试管中，加入0.55mol/L Na2CO35ml，33% Folin试剂1ml，立即振荡；5.将试管放入30℃恒温水浴中，显色30min；6.用分光光度计在波长680nm处测定光密度，由标准曲线查出酪氨酸含量。
1.称取5g鲜土（过10目）于50ml刻度试管中，加0.2ml甲苯和9ml Tris缓冲液，混匀后加入1ml 0.05mol/L L-天冬酰胺溶液，混匀，37℃下培养2h后，加入35ml KCl-Ag2SO4混合溶液，混合均匀，静置冷却至室温（约5min），用KCl-Ag2SO4混合溶液定容，混匀；2.吸取20ml L-天冬酰胺溶液前，加入KCl-Ag2SO4混合溶液。
脲酶km值的测定实验报告
脲酶km值的测定实验报告脲酶KM值的测定实验报告引言：脲酶是一种重要的酶类，广泛存在于生物体内，参与尿素代谢等关键生物化学反应。
了解和测定脲酶的KM值对于研究其催化活性和酶动力学特性具有重要意义。
本实验旨在通过测定脲酶对底物浓度的依赖关系，确定其KM值，并探讨其对底物亲和力的影响。
材料与方法：1. 实验仪器：分光光度计、试管、移液器等。
2. 实验试剂：脲酶提取液、尿素底物溶液、缓冲液等。
3. 实验步骤：a. 制备一系列尿素底物溶液，浓度分别为0.1 M、0.05 M、0.025 M、0.0125 M、0.00625 M。
b. 取一定体积的脲酶提取液，加入不同浓度的尿素底物溶液，使得最终反应体系中脲酶浓度一定。
c. 在一定温度下，将反应体系放置一段时间，使反应达到平衡。
d. 用分光光度计测定反应体系中底物的浓度变化，记录吸光度值。
e. 根据吸光度值和标准曲线，计算不同浓度底物的浓度。
f. 绘制脲酶底物浓度与吸光度值的曲线，并根据曲线拟合计算KM值。
结果与讨论：根据实验数据，我们绘制了脲酶底物浓度与吸光度值的曲线，并进行了拟合计算。
通过分析曲线，我们得到了脲酶的KM值为0.025 M。
这意味着在该浓度下，脲酶对底物的亲和力最强，催化效率最高。
脲酶的KM值是衡量酶与底物结合亲和力的重要参数。
KM值越小，表示酶对底物的亲和力越强，催化效率越高。
反之，KM值越大，表示酶对底物的亲和力越弱，催化效率越低。
在本实验中，我们选择了尿素作为脲酶的底物，并通过测定不同浓度底物的反应体系中底物浓度的变化，得到了一系列吸光度值。
通过计算和拟合，我们得到了脲酶的KM值。
脲酶的KM值的测定对于研究酶的催化机制和酶动力学特性具有重要意义。
通过测定不同条件下的KM值，我们可以了解到脲酶对底物的亲和力如何受到温度、pH值等环境因素的影响。
同时，通过比较不同酶的KM值，可以揭示不同酶的催化机制和底物特异性。
然而，本实验还存在一些限制。
脲酶生化实验报告
一、实验目的1. 了解脲酶的催化特性。
2. 掌握脲酶活性测定的原理和方法。
3. 分析不同条件下脲酶活性的变化。
二、实验原理脲酶是一种水解酶，能催化脲分解为氨和二氧化碳。
本实验通过测定不同条件下脲酶活性，探讨温度、pH值、抑制剂等因素对脲酶活性的影响。
三、实验材料1. 试剂：脲酶、尿素、NaOH、HCl、邻苯二甲酸氢钾、硫酸铜、碘化钾、淀粉、氯化钠等。
2. 仪器：分光光度计、恒温水浴锅、pH计、移液器、试管等。
四、实验步骤1. 脲酶活性测定(1) 准备脲酶工作液：取一定量的脲酶，用蒸馏水稀释至一定浓度。
(2) 配制脲酶反应体系：取一定量的脲酶工作液，加入尿素溶液，混合均匀。
(3) 加入指示剂：取少量淀粉溶液，加入反应体系中。
(4) 水浴加热：将反应体系置于恒温水浴锅中，保持一定温度。
(5) 定时取样：每隔一定时间，取少量反应液，加入碘化钾溶液，观察颜色变化。
(6) 记录结果：记录反应液颜色变化所需时间，根据标准曲线计算脲酶活性。
2. 温度对脲酶活性的影响(1) 设置不同温度：设置0℃、25℃、37℃、50℃、75℃等不同温度。
(2) 按照脲酶活性测定步骤进行实验。
(3) 记录结果：记录不同温度下脲酶活性。
3. pH值对脲酶活性的影响(1) 设置不同pH值：设置pH 3.0、5.0、7.0、9.0、11.0等不同pH值。
(2) 按照脲酶活性测定步骤进行实验。
(3) 记录结果：记录不同pH值下脲酶活性。
4. 抑制剂对脲酶活性的影响(1) 设置不同抑制剂浓度：设置0.1%、0.5%、1.0%、2.0%等不同抑制剂浓度。
(2) 按照脲酶活性测定步骤进行实验。
(3) 记录结果：记录不同抑制剂浓度下脲酶活性。
五、实验结果与分析1. 脲酶活性测定结果根据标准曲线计算得到脲酶活性，结果如下表所示：| 时间（min） | 脲酶活性（U/mL） || :--------: | :--------------: || 0 | 0.00 || 5 | 0.25 || 10 | 0.50 || 15 | 0.75 || 20 | 1.00 |2. 温度对脲酶活性的影响不同温度下脲酶活性如下表所示：| 温度（℃） | 脲酶活性（U/mL） || :--------: | :--------------: || 0 | 0.10 || 25 | 0.60 || 37 | 1.20 || 50 | 0.40 || 75 | 0.20 |结果表明，脲酶活性在37℃时最高，随温度升高或降低，脲酶活性逐渐降低。
脲酶km测定实验报告
脲酶km测定实验报告脲酶是一种重要的酶类，它在蛋白质代谢中起着关键的作用。
了解脲酶的特性对于进一步研究蛋白质代谢，以及相关疾病的发生机制具有重要意义。
本实验旨在通过测定脲酶对底物浓度的依赖关系，测定脲酶的Michaelis-Menten常数（Km）。
实验所用的脲酶是从动物肝脏中提取的。
实验过程中，首先需要准备一系列不同浓度的底物（尿素）。
然后分别取不同浓度的底物进行反应，其中每个反应混合液的体积为5 mL，并加入相同量的提取物。
反应温度为37C，反应时间为10分钟。
测定完所有的反应后，将反应混合液转移到离心管中，进行离心。
随后，使用紫外分光光度计测定每个离心管中的底物浓度。
通过对不同底物浓度下的反应速率进行测定，建立反应速率和底物浓度的关系曲线。
利用Michaelis-Menten方程，可以通过线性回归得到Vmax和Km的数值。
根据实验数据计算得到，底物浓度为10 mM时，反应速率最高，为0.5 mmol/min。
经过数据处理，利用Michaelis-Menten方程进行线性回归，得到Vmax为0.6 mmol/min，Km为5 mM。
通过对实验结果的分析，可以得出以下几点结论：首先，脲酶的催化作用对底物浓度有一定依赖性。
当底物浓度低于Km值时，反应速率较慢，当底物浓度达到Km值时，反应速率达到最大值。
超过Km值后，反应速率开始减慢。
其次，Vmax是酶催化过程中的最大速率，它受限于脲酶的催化效率以及酶的浓度。
Km则代表了底物与酶的结合亲和力，值越小代表结合越紧密。
最后，通过测定脲酶的Km值，可以帮助我们了解脲酶的特性，进一步研究脲酶在蛋白质代谢中的作用机制。
此外，对于药物研发领域来说，Km值也是一个重要的参数，它可以用于评估药物与脲酶的结合亲和力，从而为药物设计提供参考。
总结起来，本实验通过测定脲酶的反应速率和底物浓度的关系，成功确定了脲酶的Km值，进一步揭示了脲酶的特性和功能。
这为我们深入研究脲酶的作用机制以及开发相关药物提供了重要的基础。
脲酶值的测定实验报告
脲酶值的测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定样品中的脲酶值，以评估样品中脲酶的活性水平，为相关研究和应用提供数据支持。
二、实验原理脲酶能够催化尿素水解生成氨和二氧化碳。
通过检测反应过程中产生的氨量，可以间接反映脲酶的活性。
通常采用苯酚次氯酸钠比色法来测定氨的含量，从而计算出脲酶值。
三、实验材料与设备1、实验材料尿素溶液（浓度为 10%）苯酚溶液（5g/L）次氯酸钠溶液（活性氯含量大于 52%）氢氧化钠溶液（10mol/L）氯化铵标准溶液（100μg/mL）待测样品2、实验设备分光光度计恒温水浴锅移液器容量瓶（100mL、500mL 等）具塞刻度试管（10mL、25mL 等）四、实验步骤1、标准曲线的绘制分别吸取 0、1、2、3、4、5mL 氯化铵标准溶液于 25mL 具塞刻度试管中，用蒸馏水补足至 5mL。
向各试管中加入 4mL 苯酚溶液和 3mL 次氯酸钠溶液，摇匀，在室温下放置 30min。
用分光光度计在 625nm 波长处，以空白管（即 0mL 氯化铵标准溶液）为参比，测定各管的吸光度值。
以氯化铵的含量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品处理称取适量的待测样品，置于 100mL 容量瓶中，加入 20mL 尿素溶液，在 37℃恒温水浴锅中保温 30min。
保温结束后，将容量瓶取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。
吸取 5mL 上述处理后的样品溶液于 25mL 具塞刻度试管中，按照绘制标准曲线的步骤进行操作，测定样品溶液的吸光度值。
3、空白对照除了不加入样品外，按照样品处理的步骤进行操作，得到空白对照溶液。
测定空白对照溶液的吸光度值。
五、实验结果与计算1、根据样品溶液和空白对照溶液的吸光度值，在标准曲线上查出相应的氯化铵含量（μg）。
2、脲酶值（μg/g·30min）的计算公式为：脲酶值＝（样品中氯化铵含量空白对照中氯化铵含量）×稀释倍数 × 1000 ／样品质量六、实验注意事项1、实验过程中应严格控制反应条件，如温度、时间等，以确保实验结果的准确性。
脲酶活性测定方法pH增值法、盐酸中和法
MM_FS_CNJ_0315出口大豆饼粕脲酶活性 pH增值法盐酸中和法MM_FS_CNJ_0315出口大豆饼粕脲酶活性测定方法pH增值法、盐酸中和法1.适用范围本方法适用于大豆饼粕类脲酶活性的测定。
2.方法一2.1.术语脲酶活性：在规定的操作条件下，使试样中的脲酶分解尿素释放出氨基氮，以溶液pH值的变量表示。
2.2.原理概要将研细的试样与缓冲尿素溶液混合，在30℃作用30min后，测定溶液的pH值。
2.3.主要试剂和仪器2.3.1.主要试剂磷酸缓冲溶液：将3.403g KH2PO4和4.355g K2HPO4溶解并稀释至1000mL。
临用前，以强酸或强碱调节其pH至7.0，其使用期限不超过90d；缓冲的尿素溶液：溶15g尿素（NH2CONH2）于500mL磷酸缓冲溶液中。
加入5mL甲苯，用于防腐和防止霉菌生长。
按上法调节其pH至7.0。
2.3.2.仪器分析天平：感量0.1mg；研磨器：易于清理，研磨过程中不发热，并能达到要求的磨粉细度；恒温水浴：能控制于30±0.5℃；pH计：备有玻璃电极和甘汞电极，灵敏度不低于±0.02pH单位，同时附有温度补偿；试管：直径22mm，长150mm，具橡胶塞；烧杯：容量10mL；单刻度移液管：10mL；精密计时器；标准筛。
2.4.试样的制备用研磨器将约10g的样品，在不升高温度的条件下尽可能研细，使其通过60目标准筛的量不少于60％。
收集全部磨碎物于广口瓶中，小心混合并立即进行分析。
2.5.过程简述准确称取试样0.200g，放入试管内，加10mL缓冲的尿素溶液，塞好橡胶塞，混匀。
置于30±0.5℃水浴中，记下时间。
隔5min放入第二个与此相同的试管作重复试验。
另称试样0.200g，放另一试管内，加10mL磷酸缓冲溶液，塞好橡胶塞，混匀，作为空白试验。
与上管间隔5min置于同一水浴中。
在消化过程中，每隔5min将试管内容物都摇匀一次。
脲酶的测定
脲酶的测定脲酶是一种重要的酶类物质，它在生物体内起着关键的催化作用。
脲酶的测定是一项常用的实验方法，可以用于研究酶的活性以及相关的生物化学过程。
本文将介绍脲酶的测定方法及其应用。
一、脲酶的概述脲酶是一类具有相似结构和功能的酶，可以催化脲的水解反应，将脲转化为尿素和氨。
脲酶在生物体内广泛存在，不仅参与氮代谢过程，还与多种生物学功能密切相关，如参与DNA修复、细胞凋亡等。
常用的脲酶测定方法有光度法、电化学法和荧光法等。
以下将分别介绍这些方法的原理和操作步骤。
1. 光度法光度法是一种基于物质吸收光的强度与其浓度成正比关系的测定方法。
脲酶测定中常用的底物是尿素，通过测定产生的尿素浓度变化来间接测定脲酶的活性。
操作步骤：（1）取适量的样品，并加入适量的底物溶液；（2）在一定的温度下，反应一段时间；（3）加入某种试剂，使产生的尿素与试剂发生反应，并形成有色产物；（4）通过测定产生的有色产物的吸光度，计算出脲酶的活性。
2. 电化学法电化学法是利用电极的电化学反应与脲酶的活性变化相关联，从而测定脲酶的浓度。
常用的电化学方法有循环伏安法、方波伏安法等。
操作步骤：（1）将电化学电极放置在含有脲酶底物的溶液中；（2）在一定的电压范围内，记录电流与电压的变化曲线；（3）根据电流与电压的变化关系，计算出脲酶的浓度。
3. 荧光法荧光法是利用脲酶底物与某种荧光试剂反应产生荧光信号的变化来测定脲酶的活性。
该方法具有高灵敏度和高选择性的特点。
操作步骤：（1）将含有脲酶底物和荧光试剂的溶液置于荧光分析仪中；（2）激发荧光试剂产生荧光信号；（3）测定荧光信号的强度变化，计算出脲酶的活性。
三、脲酶的应用脲酶作为一种重要的酶类物质，在医学、生物学和农业等领域有着广泛的应用。
1. 医学应用脲酶的活性与多种疾病的发生和发展密切相关，如肾功能衰竭、尿毒症和某些肿瘤等。
通过测定脲酶的活性，可以对这些疾病进行早期诊断和监测。
2. 生物学研究脲酶参与了许多生物学过程，如DNA修复、细胞凋亡等。
酶的测定(详细)
一、脲酶测定(比色法)1.方法原理脲酶广泛存在于土壤中，它能酶促尿素分解生成氨、二氧化碳和水。
测定脲酶的方法很多，包括比色法、扩散法、电极法等，其中比色法最为常用。
现介绍苯酚一次氯酸钠比色法，该方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚次氯酸钠作用(在碱性溶液中及在亚硝基铁氰化钠催化剂作用下)生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。
2.试剂配制（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
3.操作步骤取5g风干土置于50mL三角瓶中，加1mL甲苯。
15min后加10mL10％尿素溶液和20mLpH=6.7柠檬酸盐缓冲液。
摇匀，37℃恒温箱中培养24h。
过滤，取1mL滤液注入50mL 容量瓶中，然后按配制标准曲线显色方法进行比色测定（为了消除土壤中原有的尿素而引起的误差，每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。
）。
标准曲线配制：分别取0、l、3、5、7、9、11、13mL氮工作液，移于50mL容量瓶中，然后加蒸馏水至20mL。
再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液。
随加随摇匀。
20min 后显色，定容。
lh内在分光光度计上于波长578nm处比色。
根据吸光值与氮溶液浓度绘制标准曲线。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
一、脲酶测定(比色法)
脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：
（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，
并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢
氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B
两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤
称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
1h内再分光光度计上于578nm处比色。
3、结果计算
以24小时后1g土壤中NH3－N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure）
Ure＝a·V·n/m
式中：a为由标准曲线求得的NH3－N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。
补充：
1) 1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。
2) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。
以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照
3)无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。
每个土样都设此对照。