保护碱基列表
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不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求PCR设计引物时酶切位点的保护碱基表1
PCR设计引物时酶切位点的保护碱基表2
在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
保护碱基列表
PCR设计引物时酶切位点的保护
注释：
1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2．切割率：正确识别并酶切的效率
3。
加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
保护碱基列表格
AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG
GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG
GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG
TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
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SacI
CGAGCTCG
10
10
SacII
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0
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50
>90
SalI
GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
0
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10
50
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GAGTACTC
10
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SmaI SpeI SphI StuI XbaI XhoI
AAAAGTACTTTT
CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA
GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG
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2 精心整理，用心做精品
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Hind III
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG
GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA
切割率%
2 hr
0 0 0
20 hr
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CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG
GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA
保护碱基列表
010>90>900
Pvu I
GCGATCGCATCGATCGATCGACGATCGTCG
0100
02510
Sac I
GGAGCTCC
10
10
Sac II
CCCGCGGGGGACCGCGGTCC
050
0>90
Sal I
GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGGTCGACGCGTCGGCCATAGCGGCCGCGACGCGTCGACGAA
.
PCR设计引物时酶切位点的保护
酶
寡核苷酸序列
%切割率
2 hr
20 hr
Acc I
CGGTCGACCGCGGTCGACCGGCCGGTCGAC
000
000
Afl III
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0>90>90
0>90>90
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0>90>90>90
Xho I
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010
025
3 / 4
.
7510CTCGAGCGGCCG
Xma I
GCCCCGGGGGCCCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGATCCCCCCGGG
02550>90
075>90>90
注释：'端加55‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的1．如果要加在序列的‘端加保护碱基，就在酶切位点识上相应的碱基（黑色），相同如果要在3 '端加上相应的碱基（黑色）。别碱基序列（红色）的3 2．切割率：正确识别并酶切的效率3。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。4 / 4
引物设计保护碱基列表
在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴專在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5 “端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护緘基，是有数据可以参考的，见附表。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的緘基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C,反之亦反。
(完整)保护碱基列表
(完整)保护碱基列表
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PCR设计引物时酶切位点的保护
注释：
1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色)的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2．切割率：正确识别并酶切的效率
3.加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
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EcoR I
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ScaI
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SmaI
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StuI
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仅供个人学习参考
XmaI
CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA
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Nsi I
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GAA
Sca I
GAGTACTC AAAAGTACTTTT
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Sma I
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Spe I
GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG
GGGT(A/T)ACCC
AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG
GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG
Hae III
GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA
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保护碱基列表
GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG
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酶 Acc I Afl III Asc I Ava I BamH I Bgl II BssH II
PCR 设计引物时酶切位点的保护
寡核苷酸序列
GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG
切割率% 2 hr 20 hr
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CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG
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11月13日引物合成的详解1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA 链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。
第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
它不能有效去除比目的片段短的小片段。
实际上，它是一种脱盐的作用。
这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。
对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
◆OPC纯化： OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。
OPC法纯化的DNA纯度大于95%。
适用于40mer以下引物的纯化。
◆PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。
PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。
◆HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。
纯度可以大于99%。
主要用于短链和修饰引物的纯化。
该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。
3.引物的OD数如何定量？答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。
测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。
DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。
需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。
4.需要什么级别的引物？答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。
根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增<45 base OPC一般PCR扩增>45 base PAGE诊断PCR扩增< 40base OPC, PAGEDNA测序20base左右OPC亚克隆，点突变等根据实验要求定OPC, PAGE，HPLC根据实验要求定PAGE基因构建（全基因合成）反义核酸根据实验要求定PAGEPAGE, HPLC修饰引物根据实验要求定5.最长可以合成多长的引物？答：引物越长，出现问题的概率就越大。
有的公司合成过120base的引物，产率很低。
除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。
6.需要合成多少OD数？答：根据实验目的确定。
一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。
但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。
做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。
片段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。
超出需要之外的OD 数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
7.如何检测引物的纯度？答：实验室方便的作法是用PAGE方法。
使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。
加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。
600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。
8.如何计算引物的浓度？答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。
引物一般配制成10-50pmol/ul。
一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。
引物的分子量可以从合成报告单上获得。
如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。
注意：1 OD260= 33 ug/ml.9.如何计算引物的Tm值？答：引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.10.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？答：非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。
如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量。
或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns– 62.NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA,WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。
对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A 混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。
Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。
常规碱基分子量：Base Molecular WeightA313.21C289.18G329.21T 304.19I 314.2U 290.17常规修饰基团分子量修饰基团分子量修饰基团分子量5’-Biotin405.453’-TAMARA623.605’-(6 FAM)537.463’-Dabsyl498.495’-HEX744.133’-(6 FAM)569.465’-TET 675.243’-Amino Modifier C3153.075’-Cy5533.633’-Amino Modifier C7209.185’-Cy3507.593’-Thiol Modifier C3154.1211.如何溶解引物？答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。
根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。
溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。
12.如何保存引物？答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。
引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。
溶解后的引物-20度可以长期保存。
如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。
修饰荧光引物需要避光保存。
13.合成的引物5’端是否有磷酸化答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。
如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，需要另外收费。
14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？连接反应需要引物的5’磷酸基团。
如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。
磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。
SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
15.测序发现引物有突变是怎么回事？答：测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物, 发生的概率不大，但是肯定也会发生。