腺病毒的一些常见问题及解答

汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！

1.目前，对于基因治疗的载体选择，很难有一个统一的结论，文章也很多，我将在如下给出。本人认为，无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法，因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因，并且使其具有一定的作用。而对于载体的副作用，目前较为公认的就是病毒载体转染效率高，但副作用大；质粒载体毒性小，但转染效率比较低。

同时，对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体，pEGFP、pDsRed、pEYFP和pECFP等：

这些载体如果用于细胞水平的检测，也许会更加

的方便、直观，但是，如果用于体内的基因治疗，那就不是一个理想的载体了。而传统的表达载体如INVITROGEN公司（)的pCDNA载体系列，会更好一些。

同时，为了获得更加高效的表达，一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体，以增加外源基因的分泌表达。

正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。

以上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。

2.转染过小鼠肝癌细胞H22，请赐教：用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒？如果用脂质体，哪家的最好？

H22细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高，

二是不用筛选直接用于实验。但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%，且影响因

素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达100%，但只能短期表达（7－10天），随着细

胞传代，外源基因会逐渐丢失。

当然，H22也可用脂质体进行转染，筛选应在96孔板上进行，由于培养液少、细胞

相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大

培养。

3.重组腺病毒作基因治疗，因为不是很了解，用AdEasy系统可以吗？具体的

实验步骤是来自什么地方？主要细胞及试剂的来源？

.BIOgene公司有整个系统，从质粒到细胞都有，我AdEasy的基本原理请参阅文献

A

Vol.95.pp.2509-2514,March 1998

4.以腺病毒为载体做肿瘤细胞的基因转染，查文献，病毒滴度测定用噬斑法，但所用细胞不统一，是否有统一规定？就用肿瘤细胞来测行吗？

只有能反式提供E1的细胞才能用来测腺病毒滴度，一般用HEK293细胞，用肿瘤细胞肯定不能

形成噬斑。

1）腺病毒E1区有转化细胞能力，出于安全性的考虑，也是为了增加载体的包装容量，现在通行的腺病毒载体是E1区缺失的。

2）由于E1区是复制必需区，所以需要包装细胞系反式提供E1蛋白，这种细胞系最常见的就是293系列和911细胞。

3）病毒感染性滴度的测定方法有几种。一般是通过噬斑记数来测定的，所以需要能够支持病变的细胞基质。如果你的病毒带有荧光或颜色标记，可以用一般的细胞系进行滴度测定，前提是病毒可以感染这种细胞。

5.腺病毒主要通过CAR介导感染细胞，感染效率不仅和MOI有关，而且与靶细胞表面的CAR

表达量相关，例如对于单核细胞，由于CAR表达量很低，无论MOI有多高，感染率都很低；但对于其他多种细胞类型，腺病毒介导的基因转染效率都很高。而对于脂质体介导的转染来说，脂质体和基因载体的用量都有一定的限制，超量使用对细胞的毒性很明显。我个人认为这两种方法的可比性不强，而且后者在大多数情况下转染效率低于前者。

“腺病毒的转染效率主要取决于靶细胞表面的CAR表达水平和感染时所选定的MOI“的含义是什么？

外壳蛋白未经过改造的腺病毒载体对细胞的有效感染需要细胞膜上表达有两个必要的受体，即负责腺病毒与细胞粘附接触的柯萨奇－腺病毒受体(CAR)和负责将腺病毒内化的整合素型受体

(αⅤβ3、αⅤβ5或αⅢβ1)。

上述所说应该是5型Ad（属于A组腺病毒）。对于B组腺病毒如Ad35，其细胞受体是CD46，在人的所有体细胞表面都有该受体。所以35型腺病毒可以感染几乎所有的人的体细胞。AGTC公司新近推出的Ad5F35载体是将Ad5的Fiber改造成Ad35的Fiber。因此，将会对许多研究者开展干细胞、DC细胞或其它Ad5难以转导的细胞的基因转移研究有很大帮助。

MOI是病毒浓度的单位。1个MOI定义为加入到细胞中的病毒颗粒数，即理论上一个细胞中转入一个病毒颗粒。

6.腺病毒的保存方法是什么？温度应是-20、70、

80℃？要不要加保护液，例如甘油什么的？做体外实验要不要纯化腺病毒？

越低保存时间越久。要不要加保护液，例如甘油什么的？可以不要。做体外实验要不要纯化腺病毒？根据需要一般如果在10e10以上可以不用。80℃，10%甘油保存即可。

腺病毒没有那么娇，关键看何时要用，4度冰箱可放置1－3月，－20度可保存1－2年，此外，体外的滴度要求不高，无需纯化，但滴度还是要测的。而体内一定要纯化至高滴度，一般是在超滤下完成。每次超滤要损失80％，工作量很大哦。

8.用脂质体转染293需7-10天，在这期间要从板分到瓶，可不可以用胰酶消化？

用脂质体转染293细胞是只需要一天时间，一般是先将生长状态较好的细胞约50－70%传入一新瓶，约12－24小时，用100ulHBS＋10ul脂质体，混合，最好用聚丙已烯管，另外一管用100ulHBS＋10ulDNA混合，然后两者作用10-15分钟，用来转染293，293先用无血清DMEM清洗二次，避免细胞悬浮，加入2ml左右无血清培养基，再缓慢加入上面的混合液，12小时左右，换含10%血清的DMEM，一般几天后，培养基消耗尽后应换液，也可以从板分到瓶，或是从小瓶分入大瓶，但绝对不可以用胰酶消化。

9.转染后收病毒时，只取293细胞弃上清进行冻融还是连培养上清和细胞一起要呢？