实验1大肠杆菌的培养与分离

2020/8/5
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选修1需学习的实验
• 实验1 大肠杆菌的培养和分离 • 实验4 果汁中的果胶和果胶酶 • 实验5 加酶洗衣粉的使用条件很效果 • 实验6 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测 • 实验8 果酒及果醋的制作 • 实验10 泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定 • 实验11 植物的组织培养
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微 生物污染培养基。
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3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固 后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置， 既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以 防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
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按化学成分来分
合成培养基:
根据细胞生存所需物质的种类和 数量，用人工方法模拟合成的。
合成培养基主要成分是氨基酸、 维生素、碳水化合物、无机盐和其它 一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相 对固定;成本低
缺点： 缺少某些成分，不能完全满 足体外细胞生长需要。
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按化学成分来分
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细
胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如
血清）。 血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋
白、铁蛋白等）
②多种金属离子；
③激素；
④促贴附物质，如纤粘蛋白、
冷析球蛋白、胶原等。
⑤各种生长因子
⑥转移蛋白
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⑦不明成分
2.不同的微生物往往需要采用不同 的培养基配方 .
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第一部分 :微生物的利用
一、基础知识
1微生物 2培养基 3无菌技术
二、实验操作
1操作步骤 2微生物的接种技术
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一基础知识
病毒
病毒界
（一）微生物
微生物包括哪五类：
细菌和蓝细菌 原核生物界 放线菌
真菌
真菌界
原生动植物 原生生物界
特点：结构都相当简单,个体多数十分微小。 通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到， 有的甚至没有细胞结构。
在数次画线后,可以分离到由一个细 胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体, 这就是菌落.
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1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需 要灼烧接种环吗？为什么？
答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接 种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线 前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种 环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的 菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线 次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少， 以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和 感染操作者。
液体培养基：
表面生长
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均匀混浊生长
沉淀生长
按物理状态来分
固体培养基：菌落，菌苔
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半固体培养基： 按物理状态来分
无动力
有动力(弥散)
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观察细菌的运动、厌氧菌的分离和菌种鉴定
选择培养基
按功能来分
加入青霉素的培养基:
分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基:
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二、实验操作 1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）
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操作步骤
1．计算、称量 2．溶化 3．调pH： pH7．6 4．过滤：这一步可以省去。 5．分装：分装过程中注意不要使培养 基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而 引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过 三角烧瓶容积的一半为宜。 6．加塞 7．包扎
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1放线菌
1、结构： ➢单细胞原核 ➢分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）
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2病毒
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SARS病毒、 禽流感病毒
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朊病毒（蛋白质病毒）
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病毒的增殖：
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3真菌
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酵母菌和霉菌
如图是酵母菌电子显微 镜下20的20/8/形5 态结构
分离金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基:
分离固氮菌
不加含碳有机物的无碳培养基:
分离自养型微生物
加入青霉素等抗生素的培养基:
分离导入了目的基因的受体细胞
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按功能来分
鉴别培养基
• 伊红美蓝乳糖培养基
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按化学成分来分
天然培养基：
天然培养基有血清、血浆、和组 织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限;成分复杂，影响对某 些实验产物的提取和实验结果的分析; 易发生支原体污染;
1.培养基的类型和用途
（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培 养基、半固体培养基和液体培养基。其中固 体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等，而液 体培养基一般用于工业生产。 （2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别 培养基。 （3）按化学成分来分，可分为天然培养基和 合成培养基。
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按物理状态来分
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2.在灼烧接种环之后，为什么要等其 冷却后再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时，
为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线 条起始处要少，每次从上一次划线的末端开 始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而 逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来 的菌落。
• 含碳无机物: 碳酸盐、碳酸氢盐、 二氧化碳
•
含碳有机物：
糖类（主要）葡萄糖 蛋白质
乳糖
脂肪酸
②不同微生物所利用的碳源不同
a.异养型微生物的碳源为 含碳有机物（有机碳） b.自养型微生物的碳源为 含碳无机物（无机碳）
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(3)氮源
• 可作为氮源的物质有: • 含氮无机物： 氮气 、氨气 、 氨盐 、硝酸盐 • 含氮有机物： 蛋物质(1)水 (2)碳源 (3)氮源 (4)无机 盐
• 其他物质 pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细 菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、 某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗 透压等的要求。
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(2)碳源
• 可作为碳源的物质有:
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min 或 80 ℃ 下煮15min 如牛奶的消毒 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁 尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线消毒 ……
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灭菌
① 概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的 微生物，包括芽孢和孢子。
10．无菌检查： 将灭菌的培养基放入37℃的温室中培 养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。
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倒平板技术
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1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时， 才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的 温度？
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形 瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手 时，就可以进行倒平板了。
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8．灭菌:
将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中， 塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌 锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌 15～30min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干 热灭菌箱内，在160～170 ℃下灭菌2h。
9．倒平板:
待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯附 近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用 来接种.
② 方法：a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌
a.灼烧灭菌
注意适用范围
微生物的接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰的充分燃烧层灼烧
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b. 干热灭菌
c. 160－170℃ ；1－ 2h
能耐高温的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 d.100kPa 121℃ e.15-30min
利用化学或物理方法，杀死大部份 致病微生物的过程。区分为高程度消毒 （High-level Disinfection）、中程度 消毒（Intermediate-level Disinfection）、低程度消毒（Lowlevel Disinfection）三种方式。
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(2)消毒的方法：
牛肉膏 尿素
②固氮微生物所利用的氮源是 氮气
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3培养基配制原则：
• 营养要协调 • 目的要明确 • PH要适宜
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（三）无菌技术
1.无菌技术的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中， 所有防止杂菌污染的方法。
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从制备培养基到接种与培养等全部实 验过程要无菌操作
• （1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进 行清洁和消毒 ；
• （2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具 进行灭菌 ；
• （3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附近进行；
• （4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品 相接触。
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2.消毒与灭菌的概念及两者的区别
消毒 （１）消毒定义：
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菌落：
• 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖 时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定 形态结构的子细胞群体，叫做菌落。
• 菌落是鉴定菌种的重要依据。
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菌落
细菌的菌落特征 因种而异