第六章外源目的基因表达与调控ppt课件

第一, 必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白 质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上
第二, 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转 录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主 细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的 启动子是一种极为重要的条件
第三, 这种启动子应是诱导型的，能通过简单 的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。
核糖体结合位点
转录终止子
复制 起点
1. 复制子是一段包含复制子起始位点和反式因子 靶序列在内的DNA片段。
大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒 表达载体，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点 和有关序列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复 制子。
2.启动子和终止子
启动子是调控外源基因转录的重要顺式元件。 理想的启动子应该具备以下性质：
五、绝缘子
绝缘子长约几百个核苷酸，是通常位于启动 子同正调控元件(增强子)或负调控因子之间的一 种调控序列。绝缘子本身对基因的表达既没有正 效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控 元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。
Hale Waihona Puke 六、反义子反义RNA是一类与特定DNA序列互补的小分 子RNA。编码反义RNA的DNA称为反义子。反义 RNA广泛存在于原核生物和真核生物中，在DNA 的复制、转录和翻译三个水平对基因的表达起着 调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最普遍。
1.双向性。正反两个方向调节活性。 2.重复序列。增强子一般含有能独立行使功能 的重复序列。 3.功能与位置无关。 4.特异性。组织特异性，或在特定细胞阶段。 5.对异源基因也有调节功能。
三、终止子
终止子是提供终止信号使RNA聚合酶停止转录 的DNA序列。
本征终止子指不需要其他蛋白辅助因子便可在 特殊的RNA结构区内实现终止作用。属于强终止 子。
第三节 外源基因表达与调控
外源基因表达包括目的基因与表达载体重组后， 导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产 生目的基因产物(目的蛋白)。
外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受 体细胞两部分组成。
一、大肠杆菌表达系统
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子
转录 翻译
二、mRNA的延伸与稳定性
外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、 终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。
为了防止mRNA在转录过程中的非特异性终止， 可以在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。
在表达载体中加入正常转录终止序列，可以防 止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制 在一定的范围内，增加外源基因表达的稳定性。
第六章 外源目的基因表达与调控
生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编 码的形式储存在遗传物质DNA上, 基因表达 是 目 的 基 因 DNA 在 导 入 的 细 胞 内 转 录 成 mRNA, 再以mRNA指导翻译成蛋白质。基 因 的 表 达 依 赖 于 有 效 的 转 录 和 mRNA 的 正 确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节 的调节作用，其中转录最为关键，原核的 基因表达过程和方式与真核细胞有显著不 同。
质粒拷贝数
(一)大肠杆菌基因表达载体
R
－35 －10
SD
编码序列
TT Tcr Ori
启动子
起始密码子
AUG、GUG、UUG
终止密码子
UAAU、UGA、UAG
大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体， 含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大 肠杆菌中有效复制的复制子。
启动子
一、启动子
启动子是一段提供RNA聚合酶识别和结合的 DNA序列，一般位于表达基因的上游。
1.序列特异性。在启动子的DNA序列中，通常 含有几个保守的序列框。
2.方向性。启动子是一种有方向性的顺式调控 元件。
3.位置特性。一般启动子只能启动其下游基因 的转录。
4.种属特异性。
二、增强子
增强子是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作 用序列。
第一节 外源基因表达机制
一、外源基因的起始转录
外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。选 择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一 个表达系统首先要考虑的问题。
理想的可调控的启动子在细胞生长的初期不表 达或低水平表达，当细胞增殖达到一定的密度后， 在某种特定诱导因子的诱导下，RNA聚合酶开始 启动转录，合成mRNA。
依赖型终止子需要ρ因子的辅助，属于弱终止 子。
四、衰减子
衰减子是基因表达调控的精细调节装置，利用 原核生物转录与翻译相偶联的特性，依赖自身巧 妙的特征序列和相应的RNA二级结构，对基因转 录进行地开关式的微调作用，从而保证原核生物 在相关操纵子处于阻遏的状态下仍能以一个本底 水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素等。
五、基因沉默
基因沉默是导致外源基因不能正常表达的重要因 素，主要出现在转基因动物和转基因植物中。
目的基因沉默是在核酸水平上DNA与DNA、 DNA与RNA、RNA与RNA相互作用的结果。重 复序列或同源序列是基因沉默的普遍原因之一， 在构建表达载体时，应尽可能避免与内源序列有 较高的同源性。
第二节 基因表达的调控元件
外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译 两个重要环节。
基因的转录是在RNA聚合酶的作用下合成 mRNA，原核生物mRNA一般不需要转录后加工。
真核生物mRNA在细胞内合成，且需要经过一 繁殖加工过程：RNA剪接、5′端加帽、 3′端加上 poly(A)尾巴。
原核生物一般没有翻译后加工，真核生物有较 复杂的翻译后加工。
终止子
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合
酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的
mRNA 混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原
三、外源基因mRNA的有效翻译
外源基因在原核生物中的有效翻译需要考虑：
1. AUG(ATG)是首选的密码子； 2. SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位 点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基； 3. SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3~9 个碱基； 4. 在翻译起始区的周围的序列不易形成明显的 二级结构。