发酵——基因工程菌
发酵工程名词解释
1. 引物：与待扩增的 DNA片段两头的状态下生长的培育方法。
核苷酸序列特异性互补的人工合成的 6. 聚合酶链式反响：又称聚合酶链式寡核苷酸序列，它是决定 PCR扩增特反响、或无细胞克隆技术，使依据 DNA异性的重点要素。
模板特异性模拟体内复制的过程，在2. 富集培育：经过采纳选择性培育基，体外适合的条件下，以单链为模DNA使目的微生物大批生殖，而其余微生板，以人工设计合成的寡核苷酸为引物的生长被克制，进而便于目的微生物，利用热稳固的 DNA聚合酶，从 5′物的分别。
-3 ′方向渗透单核苷酸，进而特异性3. 操控子学说：调理基因的产物隔绝的扩增 DNA片段的技术。
物，经过控制操控子中的操控基因从7. 代谢控制发酵：就是利用遗传学的而影响其周边的构造基因的活性。
方法或其余生物化学的方法，人为的4. 生长因子：凡是微生物生长不行缺在脱氧核糖核酸的分子水平上，改变少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、和控制微生物的代谢，使实用的目的嘧啶、维生素等均称为生长因子。
产物大批生成、累积的发酵。
5. 连续发酵：连续不停的向发酵罐中8. 菌种退化：主要指生产菌种或选育流加新鲜发酵液，同时又连续不停的过程中挑选出来的较优秀菌株，因为排出等量的发酵液，进而使 pH、养分、进行接种传代或收藏以后，集体中某溶解氧保持恒定，使微生物生长和代些生理特点和形态特点渐渐减退或完谢活动保持旺盛稳固的状态的一种发全丧失的现象。
或菌种的一个或多个酵方式。
或以必定的速度向发酵罐内特征，随时间的推移逐渐减退或消逝增添新鲜培育基，同时以同样的速度的现象，一般常指菌株的生活力、产流出培育液，使培育物在近似恒定的孢能力弱退和目的产物产量的降落。
9. 基因工程菌：将目的基因导入细菌12.发酵热：是指发酵过程中开释出来体内使其表达，产生所需要的蛋白的的净热量，主要包含生物热和搅拌热。
细菌称为基因工程菌，如：大肠杆菌13.发酵：广义指借助微生物大批生成10. 种子培育：是指经冷冻干燥管、砂并累积特定产物的过程。
发酵工程 2 发酵工业菌种应用
包括病毒、立克次氏体、细菌、放线菌、酵母菌、
霉菌、单细胞藻类、原生动物和支原体等。 常见的工业微生物： 细菌、放线菌、酵母菌、霉菌及危害细菌、放 线菌生长的噬菌体等 。
一、工业微生物常用菌种
1．细菌（bacteria ）
发酵工业常用的细菌有枯草芽孢杆菌、醋酸 杆菌、乳酸菌、棒状杆菌、短杆菌等。用于生 产酶制剂、醋酸、乳酸、氨基酸、肌苷酸等 。
如产腺苷的芽孢杆菌黄嘌呤营养缺陷型菌
株，回复子的比例随传代次数的增加而增加， 腺苷产量也随之下降。 3）创造良好的培养条件 孢子能力的衰退。 在进行栖土曲霉培养
时，温度从28-30℃提高到33-34℃，可防止产
4）利用不易衰退的细胞传代 在放线菌和霉菌中，由于其菌丝细胞常含 有几个细胞核，若用菌丝接种就易出现衰退，而 孢子一般是单核的，用于接种，就不会发生这类
5．其它 担子菌：香菇、灵芝等。 藻类：螺旋藻、单胞藻等。 基因工程菌：基因工程菌在发酵工程已得到广泛 应用，如酶制剂、胰岛素、干扰素、生长激素、 乙型肝炎病苗等的生产。
二、工业生产对菌种的要求 （ 1 ）能在廉价原料制成的培养基上生长，且 生成的目的产物产量高、易于回收； （2）生长较快，发酵周期短；
2、退化的原因
1）基因突变
那些控制生产性状的基因发生负突变。
2）分离现象 由于诱变获得的高产菌株本身不纯，
高产突变只发生在一个核（多核时）和一条DNA链
上（单核时），随着细胞分裂，核发生分离，突 变基因和未突变基因发生分离，出现了突变的高 产菌株和未突变的低产菌株。
3 ）自发突变
培养环境营养不良、发酵时间过
变异有局限性，复合处理则可扩大突变的位点范
围，使获得正突变菌株的可能性增大，因此，诱
工程菌的知识
工程菌的知识基因工程大肠杆菌发酵的研究摘要：基因工程菌的发酵工艺研究在生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。
研究结果表明，每１０Ｌ发酵液可得１～２ｋｇ湿菌体，发酵时间从一般的２４～３０ｈ缩短到６～８ｈ，５Ｌ、１５Ｌ、１５０Ｌ发酵罐都可得重复性的结果。
这项发酵工艺研究不仅适用于E.coli各种不同类型的表达启动子的工程菌，也适用于野生菌株疫苗等的生产，将对我国基因工程产业化起重要作用。
关键词基因工程菌,高密度发酵,人干扰素α22b ,鲑鱼降钙素,鱼生长激素, K88K99 基因工程疫苗作者：巫爱珍. 孙玉昆.刊名：生物工程学报讨论:含PL 启动子的E. coli 工程菌的表达及温度敏感株活菌疫苗的生产。
要求细菌在较低的温度(30 ℃) 发酵增殖,在一定时间内提高菌体密度,然后迅速提高温度诱导目的产物的表达。
这类菌表达产物的表达量取决于二个因素:一是在30 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度,二是快速升温诱导,要同时解决这二个问题是较困难的,目前不少基因工程研究室或生产厂对于这类菌的发酵均遇到上述同类的问题,即菌体密度不高和表达量低,他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵体积,显然不是良策,因为含PL 启动子的工程菌在发酵过程中发酵体积越大(500～1000L) ,其表达效率愈低,并大大增加了抽提分离表达产物的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。
而本文报道的高密度发酵技术能同时解决以上的问题,发酵时间短(约8h) ,菌体密度及表达效率高,生产车间小型化,能节省大量后处理的设备投资、人力、能源、废物废水处理量少,符合发展现代化生产的要求。
对于不需温度诱导表达,在30 ℃发酵的工程菌或野生菌应用我们的工艺技术发酵,当发酵持续6 小时,菌体仍在直线增殖的情况下,如果延长发酵时间,菌体将继续增加。
E. coli 的不同工程菌或野生菌具有不同的特性,在发酵过程中我们随之对发酵条件作了相应的改变,均取得高密度的发酵结果。
基因工程菌的发酵控制
基因工程菌的发酵控制近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。
从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。
1 、营养源浓度的控制由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。
为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g 干菌体/L 发酵液，酿酒酵母可达145g 干菌体/L 发酵液。
但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。
此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。
常采用在调节pH 的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。
使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。
2 、质粒的不稳定性及其控制在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。
带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。
此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。
由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。
质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。
前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。
为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，选择最佳的发酵条件。
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
课后习题
1、影响质粒稳定性的因素有哪些？ 2、在工业生产中如何提高质粒稳定性，提高外源基因的 表达量？ 3、基因工程菌的培养与常规菌种的培养工艺有何不同？ 4、如何对基因工程菌的生产工厂防护？
EndThanks!Fra bibliotek生物工艺学
提高质粒稳定性的措施
（1）选择合适的宿主菌和合适的载体 （2）选择适宜的培养方式 （3）控制合适的发酵培养基和适宜的培养条件 （4）固定化技术
生物工艺学 第二节 基因工程菌的培养工艺 培养基的组成与培养条件 碳源 氮源 无机盐 生长因子 营养缺陷型互补标记和抗生素选择标记的相应成分 接种量
生物工艺学
院 系： 生物医药系 教研室： 生物工程
北 京
联
合
大
学
生
物
化
学
工
程
学
院
生物工艺学
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
上章重点
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
发酵过程中的代谢变化与控制参数 温度对发酵的影响及控制 PH值对发酵的影响及其控制 溶解氧对发酵的影响及其控制 菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制 CO2和呼吸商 泡沫对发酵的影响及其控制 发酵终点的判断
基因重组菌外漏的防范 （1）接种 （2）机械密封 （3）取样 （4）排气 （5）排液 基因工程产物的提取
生物工艺学
本章重点
1. 2. 3.
4.
5. 6. 7.
8.
9. 10. 11.
12.
基因工程菌的定义 基因工程菌特点 基因工程菌质粒的不稳定 影响质粒稳定性的因素 提高质粒稳定性的措施 基因工程菌培养基的组成与培养条件 基因工程菌发酵的工艺过程 质粒稳定性的分析 实现高密度发酵的方法 基因工程菌发酵过程的检测与控制 基因重组菌外漏的防范 基因工程产物的提取
大肠杆菌基因工程菌株的构建及发酵试验
图 2 OD600 值随时间的变化趋势
图 3 pH 值随时间的变化趋势
4/8
2012 生工大实验
图 3 pO2 值随时间的变化趋势
3.4 GFP 离子交换层析分离
在洗脱过程中先用 Buffer A 洗，没有荧光洗脱。Buffer B 梯度洗脱至 17 管的开始出峰但未见荧光。至 20 管时可见荧光，第 21 管时荧光最强。
水+感受态大肠杆菌 LB 平板培养基 LB+Amp 平板培养基 LB+Amp+ara 平板培养基 5000 个 99 个 776 个
pGLO+感受态大肠杆菌 5000 个 5000 个 1616 个
注；其中 LB 平板培养基菌落过于密集无法计数按 5000 计，pGLO+感受态大肠杆菌接种于 LB+Amp 平板培养基涂布不均菌落
280/260 7 0.15 0.15 0.15 0.68 0.68 0.68 0.86 0.93 0.99 0.25 0.25 0.40 2 0.038 0.038 0.03 0.48 0.48 0.40 1.22 1.45 1.55 0.03 0.03 0.03
表 5 对照标准比值
0.15M 甲酸 0.189 0.226 0.081 0.032 0.836 0.358 0.142 840
0.01M 甲酸+0.05M 甲酸钠 0.134 0.164 0.059 0.016 0.817 0.360 0.098 900
0.1M 甲酸+0.1M 甲酸钠 0.172 0.174 0.098 0.034 0.989 0.563 0.195 720
pH 6.22 6.21 6.32 6.38 6.20 5.80 5.55
生化工程-基因工程菌培养
基因工程菌在生产过程中可能产生变异或逃逸，对环境和人体健康造成潜在威胁。因此，需要加强安全 监管和风险评估。
生物农药
生物农药
基因工程菌可用于生产生物农药，如杀虫剂、杀菌剂等。通过基因工程技术改良微生物， 使其产生具有杀虫、杀菌作用的代谢产物，实现对病虫害的有效防治。
生物农药的优势
生物农药具有环保、安全、可持续等优点，能够减少化学农药的使用，降低对环境的污 染和对人体的危害。
生物农药的挑战
生物农药的作用机制和效果可能受到环境因素的影响，如温度、湿度等，因此在实际应 用中需要加强效果评估和监测。
生物肥料
生物肥料
基因工程菌可用于生产生物肥料，通过改良微生物的代谢 途径，使其产生具有营养价值的代谢产物，如氮、磷、钾 等矿物质元素，为植物提供养分。
生物肥料的优势
生物肥料具有环保、安全、高效等优点，能够提高土壤肥 力和植物生长效率，减少化肥的使用和环境污染。
3
加强下游处理技术的研究
针对基因工程菌产生的难分离纯化的产物，未来 将加强下游处理技术的研究，提高产物的纯度和 收率。
感谢您的观看
THANKS
基因工程菌能够高效降解有毒有 害物质或重金属离子，降低对环 境的污染和对生态系统的破坏。
生物环保的挑战
基因工程菌在降解过程中可能产 生变异或逃逸，对环境和人体健 康造成潜在威胁。因此，需要加 强安全监管和风险评估。
04
基因工程菌培养的挑战与前 景
基因工程菌培养的挑战
பைடு நூலகம்
基因工程菌种稳定性问题
培养基优化需求
基因表达技术
基因表达技术是指将重组后的目的基因导入宿主细胞中，并在宿主细胞中进行表达，产生相应的蛋白 质或代谢产物。
一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程
一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程基因工程菌是指经过基因工程技术改造的微生物菌株，广泛应用于生物工程、医学和农业等领域。
本文将介绍一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程。
一、基因工程菌的制备方法基因工程菌的制备方法主要包括以下几个步骤：1. 选择宿主菌株：根据所需的功能和目标，选择合适的菌株作为宿主，常见的宿主菌株有大肠杆菌、酵母菌等。
2. 提取目标基因：从源菌株中提取所需的目标基因，可以通过PCR 扩增、限制性内切酶切割等方法获取目标基因片段。
3. 载体构建：将目标基因片段与合适的载体进行连接，构建重组载体。
常用的载体有质粒、噬菌体等。
4. 转化：将重组载体导入宿主菌株中，使目标基因能够稳定表达。
5. 筛选和鉴定：经过转化的菌株进行筛选和鉴定，常用的方法有抗性筛选和PCR鉴定等。
6. 培养和扩大：经过筛选和鉴定的基因工程菌株进行培养和扩大，得到足够的菌体。
二、基因工程菌的应用与流程基因工程菌在生物工程、医学和农业等领域有广泛的应用。
下面以生物工程领域为例，介绍基因工程菌的应用与流程。
1. 目标基因的克隆与表达从源菌株中提取目标基因，并通过PCR扩增获取目标基因片段。
然后将目标基因片段与适当的载体连接，构建重组载体。
接下来，将重组载体导入宿主菌株中，经过筛选和鉴定，获得含有目标基因的基因工程菌株。
最后，通过培养和表达优化等步骤，使目标基因在基因工程菌中稳定表达，并获得足够的目标蛋白产物。
2. 代谢工程与合成生物学基因工程菌在代谢工程和合成生物学中起到重要作用。
通过基因工程技术，可以改造菌株的代谢途径，使其具有特定的代谢功能。
例如，通过引入外源基因，可以使菌株具备合成特定化合物的能力，如生物染料、药物等。
通过调控代谢途径中的关键基因表达水平，还可以实现代谢产物的高效合成。
3. 蛋白质工程与酶工程基因工程菌在蛋白质工程和酶工程中也有广泛应用。
通过基因工程技术，可以改变蛋白质的结构和功能，实现蛋白质的改良和优化。
基因工程菌的发酵
基因工程菌的稳定性
影响基因工程菌稳定性的因素
载体的选择
遗传特性
宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上
发酵工艺
培养基 生长速率 限制性基质 程菌的稳定性
提高基因工程菌稳定性的策略
改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：
将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点 禁止 DNA 片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因 （DNA 单链结合蛋白编码基因）
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
培养基
一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培 养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质， 微生物的生长较在基本培养基中快。
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
比生长速率
基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速 率有助于提高质粒稳定性。
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
控制培养条件 有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用 间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒 的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质 粒的稳定性。 例如研究表达干扰素 a 的大肠杆菌 W3110(pEC901) 在不同比生长 速率下的质粒稳定性，随着稀释率的增加，质粒稳定性明显增加，干扰 素的比效价也明显增大.
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高
基因工程菌培养
2、pH值对工程菌生长和表达的影响 在相同通气量和搅拌速度下，pH值对不同 菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有 一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培 养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋 白诱导表达阶段。偏碱性的pH对外源蛋白 的表达不利，因此，表达时要调节pH在 6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表 达。
31
4、诱导时机对表达的影响
诱导时机指加入诱导剂的时间
以天冬酰氨酶表达为例，见表。在 A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌 体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶 活和表达水平都较高。而菌体进入对数期 后期，由于发酵液中营养的消耗，及代谢 产物的积累，使菌体的生长速度受到抑制。 在此状态下诱导，表达显然受到影响。
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3、诱导时间对外源蛋白表达的影响 诱导时间：加入诱导剂后的培养时间
随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加， 但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒 性，合成速率下降，甚至产物被分解。
诱导时间对酶表达水平和活力的影响 诱导时间 酶活力 酶表达水平 0 0.02 1 52.3 37% 2 118.8 57% 3 120.8 67% 4 165.0 68% 5 139.9 64% *L-天冬酰氨酶
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4、控制比生长速率的葡萄糖流加 菌体的比生长速率与代谢产物的表达 密切相关。比生长速率太大，超过某 一值，易产生乙酸，这一比生长速率 值称为菌体的乙酸产生临界比生长速 率。通过考察得出最优比生长速率， 控制溶氧、转速、补糖来控制比生长 速率。
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五、生长与表达的影响因素
不同发酵条件下工程菌发酵结果 通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量 1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8% 2 2 250 2.6 7.8 0.77 4 2.08 16.7% 3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2% 4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4% 5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9% *鲤鱼生长激素基因工程菌
基因工程菌培养资料
一、概述
基因工程菌生产的产品主要有二类，蛋白 质和非蛋白质。
基因操作： 敲除或插入基因片段、增强 启动子——代 谢工程 基因插入载体，转化工程菌
1
第一页，编辑于星期五：二十二点 六分。
非蛋白质产物大多可以通过代谢工程，改造 细胞的一些基因，如在细胞中插入编码酶的 DNA，产生新的途径或增强某一途径，从而 得到新的化合物或增加产量。
分离丢失
结构不稳定性
宿主细胞调节突变
12 12
第十二页，编辑于星期五：二十二点 六分。
1、分离丢失
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现 分离丢失。 为什么会出现质粒丢失呢？ 质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和 低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷 贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代 细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少 遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质 粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可 能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。 虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百 万细胞分裂中一个）。
粒稳定性也比较差，所以在使用上有较大的限制，
8
第八页，编辑于星期五：二十二点 六分。
3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物现在 发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等
优点
生长快 最大生长速率是大肠杆菌的25%
个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发酵 液中回收。 有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。
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第二十六页，编辑于星期五：二十二点 六分。
4、控制比生长速率的葡萄糖流加
菌体的比生长速率与代谢产物的表达密切 相关。比生长速率太大，超过某一值，易 产生乙酸，这一比生长速率值称为菌体的 乙酸产生临界比生长速率。通过考察得出 最优比生长速率，控制溶氧、转速、补糖 来控制比生长速率。
基因工程菌培养
培养温度
高温提高生长速度 低温增加重组菌稳定性 对于温度敏感重组菌,发酵过程一般分为生长
和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。 但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重 组蛋白量。
-
诱导剂及诱导时间控制
乳糖操纵子，IPTG 诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都
会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时, 外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高 而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影 响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选 择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。 一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。
稳定
-
选择合适拷贝数的菌株 在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内 质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方 法是在培养的不同阶段，采用不同培养温 度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采 用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较 低，而比生长速率升高，在主培养中途升 高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量 提高。
考虑将发酵过程分阶段控制 两阶段培养法： ⑴先使菌体生长至一定密度； ⑵再诱导外源基因的表达
-
控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表
达程度 控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：采用天然培养基培产时质粒稳定
件较用合成培养基为高 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的
毒
-
pH值的控制
在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸 和ＣＯ2,可使ｐＨ值显著降低。
常用于控制ｐＨ的酸碱有ＨＣｌ,ＮａＯＨ 和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有 补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓 度对大肠杆菌的生长有很大影响,当ＮＨ4+ 浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠 杆菌的生长。
基因工程大肠杆菌发酵的研究
讨论
• 含PL启动子的 启动子的E.coli工程菌的表达及温度敏感株 启动子的 工程菌的表达及温度敏感株 活菌疫苗的生产要求细菌在较低的温度（ ℃ 活菌疫苗的生产要求细菌在较低的温度（30℃） 发酵增殖，在一定时间内提高菌体密度， 发酵增殖，在一定时间内提高菌体密度，然后迅 速提高温度诱导目的产物的表达。 速提高温度诱导目的产物的表达。 • 这类菌表达产物的表达量取决于两个因素：一是 这类菌表达产物的表达量取决于两个因素： 在30℃发酵过程中尽可能提高菌体密度；二是快 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度； 速升温诱导。 速升温诱导。
• 科学家们把人的胰岛素基 因送到大肠杆菌的细胞里， 因送到大肠杆菌的细胞里， 让胰岛素基因和大肠杆菌 的遗传物质相结合。 的遗传物质相结合。人的 胰岛素基因在大肠杆菌的 细胞里指挥着大肠杆菌生 产出了人的胰岛素。 产出了人的胰岛素。并随 着它的繁殖， 着它的繁殖，胰岛素基因 也一代代的传了下去， 也一代代的传了下去，后 代的大肠杆菌也能生产胰 岛素了。 岛素了。这种带上了人工 给予的新的遗传性状的细 被称为基因工程菌。 菌，被称为基因工程菌。
• 二、生物工程下游技术的必要性 近年来，不少基因工程药物、疫苗、 近年来，不少基因工程药物、疫苗、 酶制剂及某些检测试剂，如人（ 酶制剂及某些检测试剂，如人（牛、猪） 生长激素、 （ ， ）干扰素、链激酶、 生长激素、α-（β-，γ-）干扰素、链激酶、 凝乳酶、葡激酶、白细胞介素、人胰岛素、 凝乳酶、葡激酶、白细胞介素、人胰岛素、 肿瘤坏死因子、表皮生长因子、心房肽、 肿瘤坏死因子、表皮生长因子、心房肽、 降钙素、仔猪腹泻疫苗、 型肝炎检测试 降钙素、仔猪腹泻疫苗、C-型肝炎检测试 剂等都是应用基因工程大肠苗菌进行生产 的。
基因工程产业化除上游构建工程菌之外， 基因工程产业化除上游构建工程菌之外，下 游必须建立生产规模的发酵工艺、离心、 游必须建立生产规模的发酵工艺、离心、细胞破 目的产物的分离、纯化、 碎、目的产物的分离、纯化、恢复表达产物的天 然结构使之具有生物活性， 然结构使之具有生物活性，有的表达产物还需进 一步加工修饰， 一步加工修饰，如人胰岛素原的化学切断与酶切 降钙素C-末端的酰胺化修饰 末端的酰胺化修饰， 断，降钙素 末端的酰胺化修饰，以及质量控制 等，没有这些下游技术的建立就没有基因工程产 品。
工程菌
发酵时，随DO浓度的下降，细 胞生长减慢。 外源基因的高效表达需要大量 的能量，促进细胞的呼吸作用，提 高对氧的需求。 维持较高的DO值，才能提高工 程菌的生长，利于外源蛋白产物的 形成。
采用调节搅拌转速的方法, 可改变培养过程中的氧供给，提高 活菌产量。
⒌ 热诱导时机的影响
一般在对数生长期或对数生长后期升温诱 导表达。 要求在2min内让罐升温达到42 。 升温时间太长，会降低外源蛋白表达量， 也给提取纯化增加困难。
微生物发酵目的是为了获得初级或次 级代谢产物，细胞生长并非主要目标 应用发酵罐大规模培养基因工程菌是 为了获得最大量的基因表达产物。
发酵罐的组成有：
发酵罐体
保证高传质作用的搅拌器 精细的温度控制和灭菌系统 空气无菌过滤装置 残留气体处理装置 参数测量与控制系统 培养液配制和连续操作系统。
发酵罐要求： 提供菌体生长最适生长条件， 培养过程不得污染， 保证纯菌培养， 培养及消毒过程不得游离异物， 不能干扰细菌代谢活动等。
表达产物不稳定：
人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的
延长，干扰素活性反而下降。
影响工程菌稳定性的因素： （1）质粒结构：质粒稳定区受到影响，重组质粒上
有重复序列等。
（2）宿主 ：宿主中重组基因的完整性、重组时有关
基因的变异等。
（3）环境因素 ：高温、去垢剂、某些药物(如利福
平)、染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的 丢失。
b 抗生素依赖变异法
诱变使宿主成为某抗生素的依赖性突变株，而重组 质粒上含有该抗生素的非依赖性基因。发酵生产时，不向
培养基中加抗生素就能起到消除重组质粒不稳定的影响。
c 、营养缺陷型法
诱变使宿主成为营养缺陷型，将相关基因插入到重
发酵工程名词解释
1.引物：与待扩增的DNA片段两端的核苷酸序列特异性互补的人工合成的寡核苷酸序列,它是决定PCR扩增特异性的关键因素;2.富集培养：通过采用选择性培养基,使目的微生物大量繁殖,而其他微生物的生长被抑制,从而便于目的微生物的分离;3.操纵子学说：调节基因的产物阻遏物,通过控制操纵子中的操纵基因从而影响其邻近的结构基因的活性;4.生长因子：凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质,如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子;5.连续发酵：连续不断的向发酵罐中流加新鲜发酵液,同时又连续不断的排出等量的发酵液,从而使pH、养分、溶解氧保持恒定,使微生物生长和代谢活动保持旺盛稳定的状态的一种发酵方式;或以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基,同时以相同的速度流出培养液,使培养物在近似恒定的状态下生长的培养方法;6.聚合酶链式反应：又称聚合酶链式反应、或无细胞克隆技术,使根据DNA模板特异性模仿体内复制的过程,在体外适合的条件下,以单链DNA为模板,以人工设计合成的寡核苷酸为引物,利用热稳定的DNA聚合酶,从5′-3′方向渗入单核苷酸,从而特异性的扩增DNA片段的技术;7.代谢控制发酵：就是利用遗传学的方法或其他生物化学的方法,人为的在脱氧核糖核酸的分子水平上,改变和控制微生物的代谢,使有用的目的产物大量生成、积累的发酵;8.菌种退化：主要指生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌株,由于进行接种传代或保藏之后,群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象;或菌种的一个或多个特性,随时间的推移逐步减退或消失的现象,一般常指菌株的生活力、产孢能力衰退和目的产物产量的下降;9.基因工程菌：将目的基因导入细菌体内使其表达,产生所需要的蛋白的细菌称为基因工程菌,如：大肠杆菌10.种子培养：是指经冷冻干燥管、砂土管中处于休眠状态的工业菌种接入试管斜面活化后,在经过摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量纯种的过程; 11.发酵工程：是指给微生物提供最适宜的生长条件,利用微生物的某种特定功能,通过现代化技术手段生产出人类需要的产品的工程称发酵工程,又称为微生物工程;它主要包括菌种生产,发酵条件的优化与控制,反应器的设计及产物的分离、提取与精制等;或研究利用微生物大量生产各种有用物质的一门现代工业学科,它即研究生产过程与微生物的关系,也研究工程学的问题,包括研究改造或构建适合于工业生产的微生物菌种,研究创造合适的环境条件以使微生物积累某种产物和相关的工业设备;12.发酵热：是指发酵过程中释放出来的净热量,主要包括生物热和搅拌热;13.发酵：广义指借助微生物大量生成并积累特定产物的过程;有机物既是被氧化的基质又是氧化还原反应过程中电子的最终受体;15.发酵工业：借助微生物大量生产各种有用物质的现代工业,它必须具备三个条件：优良的菌种、合适的环境条件指使微生物大量积累某种特定产物的环境条件、先进的工艺设备16.微生物工业：又称发酵工业17.厌氧发酵：厌氧微生物在隔绝空气不与分子态氧接触的情况下进行的发酵过程;一般适用于微生物作用于有机化合物的分解代谢,反应时放出气体同时产生热量; 18.好氧发酵：利用微生物在有氧气存在的情况下生成并积累微生物菌体或代谢产物;42.一级种子：指从斜面上转入摇瓶等小型发酵设备进行第一次扩大培养;19.液体发酵：液体发酵是相对于固体和半固体发酵而言,是从培养基的状态对发酵的一个分类;当然,由于培养基状态不同也影响了发酵过程的很多因素,如发酵的条件,发酵设备等;20.浅盘液体发酵：根据微生物对氧气的需要分为静置发酵和通气发酵,浅盘液体发酵是一种通气发酵方式,指从小规模的克氏瓶到较大规模的塑料膜和具有自动控制的发酵器,一般用于科研;21.深层液体发酵：即微生物细胞在一个密封的发酵罐内,通入无菌空气进行发酵; 22.深层培养：又称通气搅拌技术,采用机械通气搅拌,使得好气性发酵进行大规模生产;23.固体发酵：根据培养物的物理状态分类的一种发酵方式;发酵培养物为固态; 24.浅盘固体发酵：主要以曲盘,竹帘等培养为主,目前国内小型酿造厂或种曲培养尚使用;25.深层固体发酵：是浅盘固体发酵的一种发展,如厚层通气床,固体发酵罐等,用于工业生产;26.分批发酵：根据物料和产物的进出方式进行分类的一种发酵方式,所有物料除去空气,消泡剂,酸碱调节剂外一次加入发酵罐,灭菌、接种、培养,最后整个罐的内容物放出,进行产物回收;27.补料分批发酵：指发酵过程有物料连续或间歇流入,但物料的流出有两种情况,一是物料流出速率为零,二是物料流出速率不为零,即后者定期排出一定量的发酵液;在分批培养过程中补入新鲜的料液,以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点;在此过程中只有料液的加入没有料液的取出,所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加;43.二级种子：将一级种子再次扩大培养,使种子达到发酵罐的接种量;29.半连续发酵：在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液带放称为半连续培养;某些品种采取这种方式,如四环素发酵30.生长连动型产物形成：通常都直接涉及降解的代谢途径,产物直接来自产能的初生代谢,微生物的生长,碳源降解和产物形成是平行的,营养期和分化期不分;31.非生长连动型产物形成：初生代谢和产物形成完全分开的,产物不是来自降解的代谢,而是来自无定向途径;32.部分生长连动型产物形成：通常间接地同产能途径相关联,是非正常的代谢结果,分批发酵前期产物高比率消耗,产物很少或没有生成,接着生长下降,产物开始形成,底物又成高比率的消耗,营养期和分化期是分开的;34.自然选育：不经过人工处理,利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育;35.诱变育种：常规诱变育种：利用物理、化学等诱变剂,使微生物发生突变而进行菌种选育的过程;合理诱变育种：根据微生物的代谢调节机理来选择一定类型的微生物突变株,以获得高产菌株;36.反馈调节：末端产物浓度的变化对该生物合成途径中的关键酶的合成或活性有影响;许多生物合成途径具有两个以上的末端产物,这种分支合成途径的调节方式较复杂,其调节方式包括：同工酶调节、顺序反馈调节、协同反馈调节、累加反馈调节、增效反馈调节、激活和抑制联合调节和酶的共价修饰等方式;39.孢子培养基：供菌种繁殖孢子的一种固体培养基,要求使菌体生长迅速,产生数量较多的优质孢子,并且不引起菌种的变异;在配置上要求:营养不能太丰富,否则不易产孢,无机盐浓度要适当,不然会影响孢子量和孢子的颜色质量,注意pH和湿度; 38.回复突变：突变体经过第二次突变又完全地或部份地恢复为原来的基因型和表型;完全恢复是由于突变的碱基顺序经第二次突变后又变为原来的碱基顺序,称真正的回复突变;部分恢复是由于第二次突变发生在另一部位上,其结果是部分恢复原来的表型.亦称为第二位点突变或基因内校正;40.种子培养基：为扩大发酵罐的接种量,往往先将斜面菌种进入到相对体积比较小的种子罐或摇瓶进行培养;种子培养基还可以供孢子发芽、生长和菌体繁殖;种子培养基要求营养物质适当的丰富和完全,培养基成分易于被菌体吸收,但浓度不宜过高,控制碳氮比,保持培养过程中pH稳定在适当范围内;另外种子培养基的主要成分和培养条件应尽可能同发酵培养基保持一致,以缩短延迟期,使菌种迅速转入旺盛生长;41.发酵培养基：发酵培养基是供菌体生长繁殖和大量产生发酵产品之用;因此发酵培养基营养成分即要丰富和完全,又要求严格控制尤其那些对发酵产物的形成有严重影响的成分;48.异淀粉酶：一种脱支酶,催化水解糖原、支链淀粉以及它们的β极限糊精中的α-1,6-糖苷支链;与短梗霉多糖酶的区别在于不能作用于短梗霉多糖;49.分批灭菌：是指培养基在发酵罐中用蒸气加热,达到预定温度且维持一定时间,然后迅速将培养基冷却,并通入无菌空气保压,至接近发酵温度时接种;50.连续灭菌：是将培养基在发酵罐外连续不断进行加热,维持和冷却,最后进入发酵罐;51.空消：对发酵罐消毒52.实消：对培养基进行消毒53.旋风分离：空气除菌的装置之一,空气从切线方向进入容器,在容器内形成旋转运动产生的离心力分离较大的微粒;54.丝网分离器：丝网分离器能分离较小的雾滴;当气流通过丝网时,液滴与丝网撞击而被拦截在丝网上;液滴沿细丝往下流,使聚集在丝网上的液滴不断增大,直到液滴离开丝网落下,而与丝网分离;55.总过滤器：目前都采用介质过滤的方法,定期进行灭菌,定期调换新介质;空气由底部切线方向进入过滤器,由上部切线方向排出;56.分过滤器：随发酵罐次次消毒的过滤装置;每个发酵罐前配置的空气过滤装置; 57.惯性截留作用：当空气在遇到障碍物被迫改变方向时,由于微粒具有一定惯性力,不随气流运动方向的改变而改变,即颗粒仍作直线运动,以至与障碍物相撞,空气中微粒撞到过滤器内的棉花纤维等障碍物时,即被载留或阻拦在纤维上面,这种现象称为惯性截留现象;58.拦截滞留作用：当气流速度很慢时,微生物随低速气流慢慢靠近纤维,微粒所在的主导气流受纤维所阻,而改变流动方向,绕过纤维前进,并在纤维的周围形成一层滞流区,滞流区的速度更慢,进入滞流区的微粒慢慢靠近和接触纤维而被黏附滞留,称拦截滞流作用;59、59.接种量：指接入到发酵培养基中的种子液的量,以种子液占发酵液总量的百分比计算,决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度;60.通气量：指一分钟内,通过发酵液的空气体积比发酵液的体积61.溶解氧：溶解于液体发酵液中的氧62.中间补料：在发酵过程中向培养基中流加或间歇补加碳源或氮源物质,使培养基中碳源物质和氮源物质含量相对稳定,以延长产物的产生推迟菌体的自溶时间增加发酵液是体积,而使发酵单位大幅度上升;63.泡敌：化学合成类消泡剂,如聚氧丙基甘油醚、聚氧乙烷丙烷甘油醚,这一类化学合成消沫剂通称“泡敌”;64.呼吸商：二氧化碳释放率与菌氧气消耗率的比,用来描述排气中CO2与排气中O2之间的关系;65.板框过滤：是由滤板和滤框组成板框式,在输料泵的压力作用下,把料液送进各滤室,再利用过滤介质把形成固体和液体分开的整体设备;66.盐析法：也称中性盐沉淀法,中性盐的亲水性大于蛋白质的亲水性,当加入大量中性盐时,它们能夺取蛋白质表面的电荷,破坏其水膜,而使蛋白质沉淀析出;67.萃取：萃取是用一种溶剂将被提取物从一种固体或液体中提取出来;81.抗生素：是由生物来源的一些次级代谢产物,这些物质可以在一定浓度下有选择性地抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细胞;82.半合成抗生素：或是以由生物合成所得的天然抗生素或其类似物为原料,用化学合成方法改造其部分结构和制备一些新型衍生物；或是利用微生物某些酶的作用,在抗生素分子中改变或引进取代基来获得新抗生素,以这些方法制得的产品,都称为半合成抗生素;。
生物技术概论论文-酵母基因工程菌的构建过程及其在食品领域中的应用
酵母基因工程菌的构建过程及其在食品领域中的应用随着科技的发展，食品生物技术在食品工业发展中的地位和作用越来越大，已经渗透到食品工业的方方面面，特别是基因工程技术等技术在21世纪的食品工业中充当重要的角色。
而工程菌就是用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系，是采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点。
主要应用于治理海洋石油泄漏，生产基因工程药物，酵母基因工程中等方面。
而酵母基因工程中，酵母基因工程菌就是菌类细胞株系用的是酵母菌，能够发挥着一定的功能，可以提高发酵的效率。
酵母基因工程的优点：1.是真核生物，大多具有价高的安全性。
2.繁殖速度快，能大规模生产，具有降低基因工程产品成本的潜力。
3.将原核生物中已知的分子和基因操作技术与真核生物中复杂的转运后修饰能力相结合，能方便外缘基因的操作。
4.采用高表达启动子，可高效表达目的基因，而且可诱导调控。
5.提供了翻译后加工和分泌的环境，使得产物和天然蛋白质一样或类似。
6.酵母菌可表达外源蛋白与末端前导肽融合，指导新生肽分泌，同时在分泌过程中可对表达的蛋白进行糖基化修饰。
7.不会形成不溶性的包涵体，易于分离提纯8.移去起始甲硫氨酸，避免了在作为药物中使用中引起免疫反应的问题。
9.酵母菌（主要是酿酒酵母）已完成全基因组测序，他具有比大肠杆菌更完备的基因表达控制机制和对表达产物的加工修饰和分泌能力。
10.酵母可进行蛋白的N-乙酰化，C-甲基化，对定向到膜的胞内表达蛋白具有重要意义。
构建基因工程菌是一个复杂、繁琐的过程，因此构建酵母基因要注意：1、结构简单，易于研究2、繁殖能力强，数目多3、成本低，易于培养、4易于观察。
一．酵母基因工程菌的构建过程：1.目的基因的获取：获取目的基因是实施基因工程的第一步，有三种方法提取目的基因。
（1）从自然界中已有的物种中分离出来：.从基因文库中获取目的基因（俗称：鸟枪法）：将含有某种生物的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。
基因工程菌构建的方法和步骤
基因工程菌构建的方法和步骤1. 了解基因工程菌嘿，伙计们，今天我们要聊聊“基因工程菌”这个话题，别担心，我不会用什么高深的术语把你绕晕。
我们先来把概念捋一捋。
基因工程菌，简单来说，就是把外来的基因“送”进某种细菌的体内，让这些细菌变成小小的生物工厂，生产我们需要的物质。
就像你在厨房里加点调料，能把菜肴的味道改变一样。
基因工程菌的目的是通过这种“改造”，让细菌能够合成有用的蛋白质、酶或者其他的化学物质。
这样一来，它们就能帮助我们解决各种问题，比如生产药物、清理污染或者改良作物。
2. 构建基因工程菌的步骤要构建基因工程菌，我们得经过几个步骤，哎呀，这可不简单，但也不至于让人望而却步。
接下来，我就给你细细道来，千万别走神哦！2.1 选择目标基因首先，我们得决定要插入哪个基因。
这个基因可以来自其他生物，比如植物、动物，甚至是其他细菌。
想象一下，你要给你的微型生物工厂添加一项新技能，就像给它升级一个新功能。
这一步就像是挑选你最喜欢的配料，关键在于找出最适合你需求的那个基因。
2.2 构建载体接下来，我们要搞个“载体”，也就是用来运输目标基因的工具。
可以把它想象成快递公司，我们的目标基因就像包裹，载体就是快递员。
常见的载体有质粒（就是一种小小的DNA环）或病毒载体。
载体的选择，基本上是看你的目标基因是小巧玲珑还是“大块头”，当然也要看它的安全性和有效性。
2.3 转化细菌现在，咱们得把装载着目标基因的载体“送”进细菌里。
这一步就像把新员工介绍给公司的老员工，确保他们能顺利融入团队。
我们用的技术有几种，比如化学转化、热激转化和电转化。
每种方法都有自己的“拿手绝活”，这时就得看情况选择最合适的了。
2.4 筛选和鉴定好了，目标基因成功送到细菌体内后，我们得确认它是否真的“安家”了。
这个步骤就像是检查你的新配方在实际操作中是否真的有效。
我们会用一些方法来筛选出那些成功转化的细菌，比如抗生素筛选、荧光标记等。
搞定这些之后，我们还需要用一些高大上的技术，如PCR、测序，来确认基因的确切位置和表达情况。
《基因工程菌发酵》课件
通过将目标基因插入宿主菌株的染色体，实现对目标基因的表达和调控。
2
发酵过程
利用菌株进行发酵过程，通过代谢产物合成目标化合物。
3
纯化和提取
通过有效的纯化和提取技术，获取目标化合物的高纯度。
基因工程菌发酵的优势
1 高效
菌体能够高效合成目标化合物，提高生产效率。
2 可控
通过基因调控和发酵条件优化，可以精确控制产品成分和质量。
总结和展望
基因工程菌发酵是一项具有广泛应用和巨大潜力的技术，将在医药、工业、 环境和农业等领域继续发展和创新。
《基因工程菌发酵》PPT课件
通过深入浅出的解释和精美的图片，本课件将详细介绍基因工程菌发酵的背 景、原理、应用领域以及发展前景。
背景介绍
基因工程菌发酵是一种重要的生物工艺技术，利用基因工程手段改造菌株， 通过发酵生产目标物质。
基因工程菌发酵的定义
基因工程菌发酵是指利用重组DNA技术构建具有特定基因组的菌株，并通过 菌体生物代谢过程来合成目标化合物的过程。
3 环保
利用菌株的生物降解能力，减少废弃物产生和环境污染。
基因工程菌发酵的发展前景
创新性
基因工程菌发酵将会不断结合新 技术和新领域，推动科技创新。
研究和发展
越来越多的研究机构和企业投入 基因工程菌发酵领域的研究和开 发。
生物技术发展
基因工程菌发酵是生物技术发展 的重要方向之一，有着广阔的应 用前景。
基因工程菌发酵的应用领域
制药业
利用基因工程菌发酵生产药物，提高药物生产 效率和纯度。
环境治理
利用基因工程菌发酵进行废水处理和有机废弃 物降解。
工领域
利用基因工程菌发酵生产化工原料和生化产品， 替代传统化工合成过程。
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ห้องสมุดไป่ตู้
真核基因在大肠杆菌中的表达方式 （1）以融合蛋白的形式表达药物基因：融合蛋
白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。 优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定；易高 效表达；但只能做抗原。 不做人体注射用药。
（2）以非融合蛋白的形式表达药物基因：易被 蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应。 （3）分泌型表达蛋白药物基因：外源基因融合到 原核蛋白信号肽序列的下游。
G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
1、大肠杆菌
如果产品翻译后不需要修饰，最普遍选用大肠 杆菌作为宿主。
优点：
•人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得 比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因操 作；
•大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细 胞浓度（50g/l）；
•大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
只能简单糖基化。 当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译 后修饰时，要用动物细胞组织培养来达到。
丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加 工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等 真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全 菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺。
影响目的基因在酵母菌中表达的因素 （1）外源基因拷贝数：高度稳定、高拷贝 （2）外源基因的表达效率：启动子 （3）外源蛋白的糖基化： （4）宿主菌珠的影响：菌体生长力强；菌体
分离丢失示意图
2、质粒结构不稳定性
指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺 失所致工程菌性能的改变。如果质粒发生 突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合 成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有 抗生素的培养基中生长。而且由于不合成 外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快， 使得在这种培养物中带有突变质粒的菌占 统治地位，这种培养情况就是结构不稳定 性。
第八章 一、概述
基因工程菌培养
基因工程菌生产的产品主要有二类，蛋白 质和非蛋白质。
基因操作：
•敲除或插入基因片段、增强 启动子— —代谢工程
•基因插入载体，转化工程菌
细胞因子、疫苗、酶
二、宿主-载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统 要求：翻译后的修饰要简单
如果用于食品要考虑宿主菌要求安全， 列入FDA表中 常用的宿主系统有：大肠杆菌
大肠杆菌作为宿主的主要问题是
•大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在细 胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被水 解或形成不溶的包含体。包含体蛋白是不 折叠的，必须重新溶解并使它复性。
•大量的外源蛋白会触发热冲击响应。增加 蛋白水解酶的活性。此时，蛋白水解酶使 蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。
（一）基因工程菌带有外源基因，外源基 因可能在质粒上也可能整合到染色体上， 这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌 往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样 就会大大降低产物的表达。为了抑制基因 丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择 压力，如抗生素。
（二）基因工程菌的培养一般分两段。前 期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱 导因子，诱发产物表达。
指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代 菌的现象。 为什么会出现质粒丢失呢？ 质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和 低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷 贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代 细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少 遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质 粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可 能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。 虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百 万细胞分裂中一个）。
3、宿主细胞突变
宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。 这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标 蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启 动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细 胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白 的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子， 通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG） 来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷 透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的 结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的 表达。
三类主要基因工程表达体系的比较
表达体系 产物 产生部位 培养方式 产物活性 浅在危险
大肠杆菌 多肽、蛋白 菌内 融合蛋白
部分可高产
对原核好 不大
酵 母 多肽、蛋白 菌内 可高产 真核接近 不大 糖基化蛋白 胞外 天然
动物细胞 完整 胞外
几乎可为 可能有
糖基化蛋白
可高产 天然产物 致癌因素
三、利用基因工程菌生产的特点
（三）基因不稳定性
生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但 是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损 害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白 的能力的细胞一般生长得快得多，从而能 替代有生产能力的菌株，这就导致基因的 不稳定性。 基因的不稳定性原因： •分离丢失 •结构不稳定性 •宿主细胞调节突变
1、分离丢失
内源蛋白酶要弱；菌株性能稳定；分泌能力强。
4、哺乳动物细胞
哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排 列，而且所有转译后处理（修饰）与在整 个动物中相同，在某种情况下可能转译后 修饰有些不同，但它可提供最接近于天然 副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞 外。
但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵， 蛋白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋 白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢 细胞）。
在大的反应器中含有非常多的细胞，总会 存在无质粒细胞，例如1000L发酵液，每 毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞， 那么在这个反应器中就含有109个无质粒 细胞。
质粒的分离丢失受许多环境因素影响，如 溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀 释速率。
许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒 附着在一起形成一个单位。
2、G+细菌
枯草杆菌是G+菌，没有外膜，能把蛋白分 泌（excretion）到胞外。不能使蛋白质糖 基化
缺陷:枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快 降解产物。而且枯草杆菌基因构建比大肠 杆菌困难，质粒稳定性也比较差
其他: 链霉菌：不致病、使用安全，分泌能力强，
可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基 化能力，可做理想的受体菌。
3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物 现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等 优点 •生长快 最大生长速率是大肠杆菌的25% •个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发酵 液中回收。不产内毒素 •有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。 缺点 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难， 外源蛋白分泌到胞外也有限。