第十二章 吸光光度分析法
吸光光度法概述(一)
吸光光度法概述（一）10.1.1吸光光度法概念许多物质本身具有显然的色彩，例如，高锰酸钾溶液呈紫红色，硫酸铜溶液呈蓝色。
有些物质本身无色或是浅色，但碰到某些试剂后，变成了有色物质，如淡黄色的Fe3+与SCN-反应生成血红色的协作物，淡绿色的Fe2+与邻二氮菲作用生成橙红色的协作物等。
物质展现不同的色彩是因为物质对不同波长的光挑选性汲取的结果，而色彩的深浅是山于物质对光的汲取程度不同而引起的。
基于物质对光的挑选性汲取而建立起来的分析办法称为吸光光度法。
对于有色溶液来说，溶液色彩的深浅在一定条件下与溶液中有色物质的含量成正比关系。
吸光光度法利用这一关系，通过分光光度计测得溶液中有色物质对光的汲取程度而对物质举行定性和定量分析。
与经典化学分析办法相比，吸光光度法的特点有：①敏捷度高。
吸光光度法适用于测定微量物质，被测组分的最低浓度为10-5～10-6mol/L。
②精确度高。
吸光光度法的相对误差通常为2％～5％，常量组分的精确度的确不如滴定分析法和分量分析法高，但对微量组分，化学分析法是无法举行的，而吸光光度法则彻低能满足要求。
③操作简便。
吸光光度法的仪器设备容易，操作简便。
若采纳敏捷度高、挑选性好的显色剂，再采纳相宜的掩蔽剂消退于扰，有的样品可不经分别挺直测定。
完成一个样品的测定普通只需要几分钟到十几分钟，有的甚至更短。
④应用范围广泛。
几乎全部的无机离子和许多有机化合物均可挺直或间接地用吸光光度法测定。
吸光光度法已经成为生产、科研、环境监测等部门的一种不行缺少的测试手段。
通常状况下，吸光光度法可以分为以下几种：①可见吸光光度法。
基于物质对420～760 nm可见光区的挑选性汲取而建立的分析办法，也称为可见分光光度法，是微量分析的简便而通用的办法。
②红外吸光光度法。
利用物质对0.78～1000um红外光区电磁辐射的挑选性汲取的特性来举行结构分析、定性分析和定量分析的一种分析办法，又称为红外汲取光谱法和红外分光光度法。
武汉大学无机及分析化学ppt (吸光光度法)
选择性
2 测定浓度控制
控制浓度 吸光度A：0.2～0.8
减少测量误差
3 参比溶液选择
仪器调零 消除吸收池壁和溶液对入射光的反射 扣除干扰
试剂空白 试样空白 褪色空白
4 标准曲线制作
理论基础：朗伯-比尔定律
相同条件下 测定不同浓度标准溶液的吸光度A A～c 作图
A
0 .3 5
0 .3 0
0 .2 5
0 .2 0
0 .1 5
0 .1 0
0 .0 5
0 .0 0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
c o n c e n tra tio n
12.6 吸光光度法的误差
对朗伯-比尔定律的偏移 非单色光引起的偏移 物理化学因素：非均匀介质及化学反应 吸光度测量的误差
显M 色+ n反L应= 体M系Ln中显的色副反反应应影响 *其它离子可能与显色剂反应：M´ + nL = M´Ln,消耗显色剂； *L受酸效应影响，有L-、HL+等形态存在；被测离子有络合效应
e 表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液的吸光度。单位：
(L•mol-1 •cm-1)
桑德尔(sandell)灵敏度： S 当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光程内所能检测到
的吸光物质的最低含量。 单位：mg/cm2
S=M/e
推导：根据定义0.001＝εbc 故 bc ＝0.001/ε （1） c为浓度，单位为mol/1000cm3,b为cm, bc表示单位截面积光程内的摩尔数，即 mol/1000cm2，如果bc乘以被测物质的分子量M,则得单位截面积光程内被测物质的量， 即桑德尔灵敏度S。 S=（bc/1000）×M×106 = bcM × 103（μg·cm-2），将（1）的bc＝0.001/ε代入，S＝
第12章可见光分光光度法
厚度的乘积成正比.
即:
A = e bc
Lambert-Beer 定律不仅适用于有色溶液,也适用于其它均匀的、非散射用,则:
A 总 = A1 + A2 + …… = e1bc1 + e2bc2 + …… 吸光度具有加和性.
据: A=lg(1/T)= e bc,若 b 固定, A = K’c
显色剂 M(待测组分) → MR(有色化合物) 显色: 将待测组分转变为有色物质的过程. 显色剂: 使待测组分形成有色化合物的试剂. 1.显色反应分类: 氧化还原反应:
Ag+ 2Mn2+ + 5S2O82- + H2O → 2MnO4- + 10SO42- + 16H+ 配位反应: 多数显色反应以配位反应为主. 2.显色反应的选择: (1)灵敏度与选择性:含量低、干扰少时一般选择高灵敏度(e max > 6×104) 的显色反应; 含量较高、选择性较差,且难以消除时选择中、低灵敏度(e max < 5×104 )的显色反应. 显色反应的选择性: 一定条件下显色反应的专一性. (2)显色剂的吸收以及有色物质的稳定性: 在测定波长处尽量无吸收,或对比度尽可能大 对比度 Δl = ½lmaxMR- lmaxR½≥ 60nm MR 应足够稳定. 3.显色反应条件的选择: 酸度;
e = A/bc = 1.20/(2.0 ´ 5.37 ´ 10-5) = 1.1 ´ 10-4 L·mol-1·cm-1.
3.摩尔吸光系数的意义:
定性与结构分析的参数;
同一吸光组分,不同 l 或不同溶剂中, e 不同;
不同吸光组分,一定 l 和确定的溶剂中,e 也 不相同.
估量定量方法的灵敏度.
第十二章 吸光光度法
• •
（4）显色时间 显色反应由于反应速 度不同，完成反应的时间 也不同。有些反应能瞬时 完成，且颜色能在长时间 内保持稳定；有些反应虽 能快速完成，但产物迅速 分解。对于一般的分析， 希望加入显色剂后数分钟 就达到最大的吸光度值， 且在1～2 h内稳定不变。
• • • • • •
二、测定误差及测定条件的选择 在光度分析中，除了偏离朗伯－比尔定律所引起 的误差外，测量误差也是误差的主要来源。 1．测量误差 ． （1）光度测量误差 （2）仪器误差 ① 仪器稳定性 ②仪器精度 ③杂散光的影响 （3）操作误差 2．测定条件的选择 ． （1）选择合适的入射光波长 （2）吸光度范围的控制 （3）选择合适的参比溶液 纯溶剂空白 、试剂空白 、试液空白
• 第二节 基本原理 • 一、光的基本性质
让一束白光通过棱镜， 让一束白光通过棱镜，由于折 射作用可分为红、 射作用可分为红、橙、黄、绿、青 紫七种色光， 、蓝、紫七种色光，这种现象称为 色散，所以白光即为复合光。 色散，所以白光即为复合光。实验 证明不仅上面所说的七种颜色的光 混合成白光， 可以 混合成白光，如果将适当颜 色的两种单色光按一定的强度比例 混合，也可以形成白光， 混合，也可以形成白光，这两种单 色光被称为互补光。 色光被称为互补光。
• 2．显色反应条件的选择 ． • （1）显色剂的选择 • 寻找显色反应的最佳条件，对显色剂的用量的探索是 很重要的。 • 显色反应一般可表示如下： • M(被测组分)＋R(显色剂) M( ) R( ) MR( MR(有色化合物) )
• （2）溶液的酸度
• （3）显色温度
• 显色反应一般在室温下 进行，但有些反应需要 加热至一定的温度（如 磷钼蓝法测定磷，其显 色温度为55～60℃）才 能完成，还有些有色物 质高温时易分解，因此 对不同的反应，应通过 实验找出合适的温度范 围。
吸光光度法 PPT
T It I0
朗伯(Lambert J H)与比尔(Beer A)分别于 1760与1852年研究了光的吸收与溶液层的厚 度及溶液浓度的定量关系,二者结合称为朗伯比尔定律,也称为光的吸收定律。
光栅(grating)是依照光的衍射与干涉原理将复 合光色散为不同波长的单色光,然后再让所需波 长的光通过狭缝照射到吸收池上。它的分辨率 比棱镜大,可用的波长范围也较宽。
3、吸收系统——比色皿或吸收池
用于盛放试液的容器。它是由无色透明、耐腐 蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃制成的,按 其厚度分为0、5cm,lcm,2cm,3cm与5cm。
• 偏离朗伯－比尔定律的原
因主要是仪器或溶液的实际
条件与朗伯—比尔定律所要
求的理想条件不一致。
1、物理因素
(1)非单色光引起的偏离
* 朗伯-比尔定律只适用于单色光,但由于单色器
色散能力的限制与出口狭缝需要保持一定的宽度, 因此目前各种分光光度计得到的入射光实际上都 是具有某一波段的复合光。由于物质对不同波长 光的吸收程度的不同,因而导致对朗伯－比尔定ຫໍສະໝຸດ * 分子吸收光谱 -带状光谱
molecular absorption spectrum →由电子能级跃迁而产生吸收光谱[能量差
在1~20(eV)],为紫外及可见分光光度法。
UV/Vis Spectrophotometry →由分子振动能级(能量差约0、05~l eV)与
转动能级(能量差小于0、05 eV)的跃迁而 产生的吸收光谱,为红外吸收光谱。用于 分子结构的研究。
B 络合:显色剂与金属离子生成的是多级络合物,且各 级络合物对光的吸收性质不同,例如在Fe(Ⅲ) 与 SCN-的络合物中,Fe(SCN)3颜色最深,Fe(SCN)2+颜 色最浅,故SCN-浓度越大,溶液颜色越深,即吸光度 越大。
吸光光度法讲解
吸光光度法讲解吸光光度法是一种广泛应用于化学分析和生物科学研究中的定量分析方法。
它通过测量样品溶液对特定波长的光的吸收程度来定量分析物质的浓度。
吸光光度法基于光的著名的“比尔-朗伯定律”，该定律描述了物质溶液对光的吸收与其浓度之间的关系。
通过测量光的吸收度，我们可以推算出浓度。
吸光光度法的基本原理是根据物质溶液对特定波长的光的吸收程度与溶液中物质的浓度之间的线性关系。
具体来说，当光通过物质溶液时，物质分子或离子会吸收光的能量，使光强度降低。
根据比尔-朗伯定律，光的吸光度（A）与物质的浓度（c）之间存在如下关系：A=εlc，其中ε是吸光度的摩尔吸光系数，l是光程长。
通过测量光的吸光度和已知的吸光度摩尔吸光系数，我们可以计算出溶液中物质的浓度。
在实践中，吸光光度法通常使用分光光度计来进行测量。
分光光度计可以发射一束特定波长的光，并测量光通过样品溶液前后的光强度差异。
这种差异可以转化为吸光度，并用于计算物质的浓度。
吸光光度法有许多应用领域。
在化学分析中，吸光光度法可以用于分析金属离子、化学物质的浓度、酸碱度等。
它可以通过配备合适的试剂和仪器来满足不同的分析需求。
在生物科学研究中，吸光光度法被广泛应用于测量DNA、蛋白质和酶的浓度。
通过测量DNA和蛋白质在特定波长下的吸光度，可以确定它们的浓度，进而研究其相互作用、结构和功能。
吸光光度法还可以用于测量酶的活性，通过测量酶和底物之间的反应，可以确定酶的催化能力。
吸光光度法有许多优点。
首先，它是一种快速、简单和经济的分析方法。
与其他方法相比，吸光光度法仪器简单、成本低，且操作方便。
其次，吸光光度法具有较高的选择性和灵敏度。
通过选择合适的波长和试剂，可以实现对特定物质的高度选择性测量。
此外，吸光光度法对微量物质的测量也非常敏感，可以达到微克或纳克级别的浓度测量。
然而，吸光光度法也存在一些限制。
首先，该方法对于有色的物质比较适用。
对于无色物质，需要经历一系列的试剂反应使其形成有色产物，才能进行吸光度测量。
吸光光度分析法Spectrophotometry
常数。
在生物学研究中的应用
蛋白质测定
吸光光度法是测定蛋白质含量的常用方法之一。通过测定 蛋白质溶液在紫外区的吸光度，可以计算出蛋白质的浓度。 该方法具有操作简便、准确度高的优点。
DNA和RNA定量
吸光光度法可以用于DNA和RNA的定量分析。通过测定 DNA或RNA在特定波长下的吸光度，可以计算出其浓度 和纯度，从而进行定量分析。
智能化与自动化
自动化检测系统
在线监测与远程监控
自动化检测系统可实现样品自动进样、 自动检测和自动处理等功能，提高检 测效率。
在线监测和远程监控技术可实现实时 监测和远程控制，提高监测效率和准 确性。
智能算法与软件
智能算法和软件的应用可实现光谱数 据的自动处理、分析和解释，提高检 测准确度。
06
结论
04
吸光光度分析法的优缺点
优点
高灵敏度
吸光光度分析法具有较高的灵敏 度，能够检测低浓度的物质，尤
其在痕量分析中表现出色。
操作简便
该方法操作简便，实验过程相 对简单，易于实现自动化和标 准化。
应用广泛
吸光光度分析法适用于多种不 同类型样品的分析，如水、土 壤、生物体等。
成本较低
该方法所需的仪器设备和试剂 相对便宜，降低了分析成本。
微型化与便携化
01
02
03
便携式光谱仪
便携式光谱仪可方便地携 带至现场进行快速检测， 具有操作简便、结果准确 等优点。
手持式光谱仪
手持式光谱仪可直接手持 操作，方便快捷，可广泛 应用于环境监测、食品安 全等领域。
微型化检测器
微型化检测器具有体积小、 重量轻、功耗低等优点， 可应用于便携式仪器和微 型化仪器中。
第十二章紫外可见吸光光度法习题
第⼗⼆章紫外可见吸光光度法习题第⼗⼆章紫外-可见吸光光度法习题1.是⾮判断题1-1物质的颜⾊是由于选择性地吸收了⽩光中的某些波长所致，VitB12溶液呈现红⾊是由于它吸收了⽩光中是红⾊光波。
1-2因为透射光和吸收光按⼀定⽐例混合⽽成⽩光，故称这两种光为互补⾊光。
1-3有⾊物质溶液只能对可见光范围内的某段波长的光有吸收。
1-4符合朗伯-⽐⽿定律的某有⾊溶液的浓度越低，其透光率越⼩。
1-5符合⽐⽿定律的有⾊溶液稀释时，其最⼤吸收峰的波长位置不移动，但吸收峰降低。
1-6朗伯-⽐⽿定律的物理意义是：当⼀束平⾏单⾊光通过均匀的有⾊溶液时，溶液是吸光度与吸光物质是浓度和液层厚度的乘积成正⽐。
1-7在吸光光度法中，摩尔吸光系数的值随⼊射光的波长增加⽽减⼩。
1-8吸光系数与⼊射光波长及溶液浓度有关。
1-9有⾊溶液的透光度随着溶液浓度的增⼤⽽减⼩,所以透光度与溶液的浓度成反⽐关系。
1-10在吸光光度测定时，根据在测定条件下吸光度与浓度成正⽐的⽐⽿定律的结论，被测溶液浓度越⼤，吸光度也越⼤，测定结果也就越准确。
1-11进⾏吸光光度法测定时，必须选择最⼤吸收波长的光作⼊射光。
1-12朗伯-⽐⽿定律只适⽤于单⾊光，⼊射光的波长范围越狭窄，吸光光度测定的准确度越⾼。
1-13吸光光度法中所⽤的参⽐溶液总是采⽤不含被测物质和显⾊剂的空⽩溶液.1-14在实际测定中，应根据光吸收定律，通过改变⽐⾊⽫厚度或待测溶液浓度，使吸光度的读数处于0.2～0.7之间，以减⼩测定的相对误差。
1-15在吸光光度法测定时，被测物质浓度相对误差的⼤⼩只有透光度为15%～65% 的范围内才是最⼩的。
2.选择题2-1分光光度法与普通⽐⾊法的不同点是A.⼯作范围不同B.光源不同C.检测器不同D.检流计不同E.获得单⾊光⽅法不同2-2 Zn2+的双硫腙-CCl4萃取吸光光度法中，已知萃取液为紫红⾊络合物，其吸收最⼤光的颜⾊为A.红B.橙C.黄D.绿2-3有⾊络合物的摩尔吸光系数，与下列因素中有关系的是A.⽐⾊⽫的厚度B.有⾊络合物浓度C.吸收池材料D.⼊射光波长2-4透光率与吸光度的关系是A.1T =A B.㏒1T=A C.㏒T=A D.T=㏒1A2-5某物质的摩尔吸光系数（ε）较⼤，说明A.光通过该物质溶液的厚度厚B.该物质溶液的浓度⼤C.该物质对某波长的光吸收能⼒很强D.测定该物质的灵敏度⾼E.测定该物质的灵敏度低2-6朗伯-⽐⽿定律说明，当⼀束单⾊光通过均匀有⾊溶液中，有⾊溶液的吸光度正⽐例于A.溶液的温度B.溶液的酸度C.液层的厚度D.有⾊配合物稳定性E.溶液的浓度和溶液厚度的乘积2-7符合⽐⽿定律的有⾊溶液稀释时，其最⼤吸收峰的波长位置A.向长波⽅向移动B.向短波⽅向移动C.不移动，但⾼峰值降低D.不移动，但⾼峰值增⼤2-8已知磷钼杂多酸络合物的透光率为10%，⽽它与硅钼杂多酸络合物的吸光度差为0.699，那么，硅钼杂多酸络合物的透光率为A. 50%B. 20%C. 30%D. 40%2-9进⾏光度分析时，误将标准系列的某溶液作为参⽐溶液调透光率100％，在此条件下，测得有⾊溶液的透光率为85％。
分光光度分析法
重庆大学化学化工学院
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2015年1月30日
在可见光，KMnO4溶液对波 长525 nm附近绿色光的吸收 最强，而对紫色和红色的吸 收很弱。λmax=525 nm。 浓度不同时，光吸收曲线形 状相同，λmax不变，吸光度不 同。
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2015年1月30日
* 单色器 单色器的作用是将光源发出的连续光谱分解为单色光 的装臵。分为棱镜和光栅。 * 比色皿也称吸收池或样品池。用于盛放试液的容器。 它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相 等的玻璃或石英制成，按其厚度分为 0.5cm ， lcm ， 2cm，3cm和5cm。 使用比色皿时应注意保持清洁、透明，避免磨损透 光面。 紫外光只能用石英比色皿； 可见光可用石英或玻璃比色皿。
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2015年1月30日
12.3.2 标准曲线法 借助分光光度计来测量一系列标准溶液的吸光度，绘制 标准曲线，根据被测试液的吸光度，从标准曲线上求得被 测物质的浓度或含量。
A
标液 A
1 C1 A1
2 C2 A2
3 4 5 C3 C4 C5 A3 A4 A5
2015年1月30日
12.3 光度分析的方法和仪器 12.3.1 目视比色法 用眼睛观察、从管口垂直向下观察（比色管），比较待 测溶液和标准溶液颜色的深浅，以确定物质含量的方法。
优点是仪器简单，操作简便，适宜 于大批试样的分析。灵敏度高，因为 是在复合光-白光下进行测定，故某 些显色反应不符合朗伯-比尔定律时， 仍可用该法进行测定。 主要缺点是准确度不高，标准系列 不能久存，需要在测定时临时配制。
吸光光度分析
吸光光度分析法基于物质对光选择性吸收而建立起来的分析方法，称为吸光光度分析法。
本章重点讨论可见光区的吸光光度分析。
第一节吸光光度分析概述吸光光度分析法(absorption spectrophotometry)，包括比色分析法、可见分光光度法、紫外分光光度法和红外分光光度法等。
与经典的化学分析方法相比，吸光光度法具有以下几个特点：1．灵敏度高吸光光度法主要用于测定试样中微量或痕量组分的含量。
测定物质浓度下限一般可达10—5～10—6 mol·L—1，若被测组分预先加以富集，灵敏度还可以提高。
2．准确度高比色法测定的相对误差为5%～10%，分光光度法测定的相对误差为2%～5%，完全可以满足微量组分测定的准确度要求。
若采用精密分光光度计测量，相对误差可减小至1%～2%。
3．仪器简便，测定速度快吸光光度法虽然需要用到专门仪器，但与其它仪器分析法相比，比色分析法和分光光度法的仪器设备结构均不复杂，操作简便。
近年来由于新的高灵敏度、高选择性的显色剂和掩蔽剂的不断出现，常常可以不经分离而直接进行比色或分光光度测定，使测定显得更为方便和快捷。
4．应用广泛吸光光度法能测定许多无机离子和有机化合物，既可测定微量组分的含量，也可用于一些物质的反应机理及化学平衡研究，如测定配合物的组成和配合物的平衡常数，弱酸、弱碱的离解常数等。
第二节吸光光度分析的基本原理一、溶液的颜色和对光的选择性吸收1．光的基本性质光是一种电磁波。
电磁波范围很大，波长从10—1 nm～103 m，可依次分为X–射线、紫外光区、可见光区、红外光区、微波及无线电波，见表8—1。
表8-1电磁波谱区域λ/ nmX –射线10-1～10远紫外光区10～200近紫外光区200～400可见光区400～760近红外光区760～5×104远红外光区5×104～1×106微波1×106～1×109无线电波1×109～1×1012注：1 m = 109 nm人的眼睛能感觉到的光称为可见光(visible light)。
光度分析法
1.灵敏度高：该法测定物质的浓度下限为105~10- 6M（也即10-4~10-5%）。
2.准确度高：比色分析的相对误差为5~10%， 光度分析的相对误差为2~5%。 3.操作简便、测定速度快：所用的仪器不复杂， 试液配好后，几分钟就可得出实验结果。 4.应用广泛：几乎所有的无机离子和有机化合 物都可直接或间接地用本方法测定。
A 光吸收曲线：
500
525
560
λ
(nm)
λmax =525nm
KMnO4溶液的吸收曲线
第十二章 比色分析法及光度分析法
§1 概述 §2 朗伯-比尔定律 一. 朗伯定律 二. 比尔定律 三. 朗伯-比尔定律
朗伯认为：如果把液层分成无限 小的厚度为db的薄层，照在薄层上 的光强度为I，光经过薄层时强度 减弱dI，则： -dI∝Idb －dI=k1 Idb
光电池
检流计
T
A
A
B
410
470
530
λ
λmax 吸光曲线
λ
兰色滤光片的透光曲线 AB=500-440=60nm
Tmax =470nm
测定溶液中KMnO4（λmax=540 nm）和K2Cr2O7（λmax=440nm） 含量，可通过下列步骤求出： (1)在波长440nm、540nm处分别测定KMnO4和K2Cr2O7标准溶 液的吸光度，求出 K440 Cr Cr Mn Mn K540 K440 K540 (2)在波长440nm、540nm处分别测定KMnO4和K2Cr2O7混合液 的吸光度，列出下列方程式：
It
I
dI I
k3dc
0
c
I0
I0
ln II0t k3c
分析化学-吸光光度法
顯然
摩爾品質
ε= Ma
(4) a 或ε的測定方法 取適當濃度的被測物溶液, 用分光光度計測得 A 值,
进而由 A abc 或 A bc 算得 a 或 見下例
【例 1】 Fe2+ 濃度為 5 mg·L-1 的溶液 1 mL, 用 1,10 - 二氮菲顯色後，定容為 10 mL，取 此溶液用 2 cm 吸收池在 580 nm 波長處測得 吸光度 A = 0.190，計算其摩爾吸光係數ε 和吸光係數 a。
a M
55.85 g mol 1
1.90102 L g1cm1
【例 2】 K2CrO4 的鹼性溶液在 372 nm 處 有最大吸收。現有 310-5 mol ·L-1 K2CrO4 鹼性溶液，在 372 nm 處用 1 cm 吸收池測得 其透光率為 71.6%。
求： 1. 該溶液的吸光度？ 2. K2CrO4 溶液在 372 nm 處的摩爾吸收系
c吸
光 物 質
b
液層厚度
透過光的強度為
It
吸光物質吸收 一部分光後
實驗證明, 吸收光的程度(吸光度)與吸光物 質濃度和液層厚度的乘積成正比。這一規 律稱為 朗伯-比耳定律。
可以导出朗伯-比耳定律的数学表达式为 :
lg I0
比例常數
Kbc
It
lg I0 = A = Kbc It
称为吸光度 absorbance
透光率 T 在 15％ ~ 65％, 吸光度 A 在 0.2 ~ 0.8 之間 才能使測量的相對誤差較小（＜ ±4%）。
這是通常所要求的準確度
當吸光度 A = 0.434（或透光率 T = 36.8%) 時，測量的相對誤差最小。
8.4 吸光光度法分析條件的選擇 8.4.1 顯色反應 因為許多被測物無色（不吸收可見光，吸 光係數為 0）或顏色太淺（吸光係數值太 小），使測定的靈敏度和準確度都太低。 所以常加入某種試劑（顯色劑），使與被 測物反應（顯色反應）：
分析化学-吸光光度法
Analytical Chemistry 分析化学
2、物质对光选择性吸收的实质
一束光通过某物质时该物质的分子、原子或离子与 光子发生碰撞，光子的能量转移至分子、原子或离 子上，使这些粒子发生能级变化，由基态跃迁至较 高能态，这个过程即为吸收。
光是否被物质吸收，取决于
光子的能量 物质的结构 只有当能级差△E 与光子能量h相当时物质吸收光。
（3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质 定性分析的依据之一。
2011.3
分析化学（2011)
CYJ 16
Analytical Chemistry 分析化学
（4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光 度 A 有差异，在λmax处吸光度A 的差异最大。此 特性可作为物质定量分析的依据。 （5）在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以
A1 = 1/2A=0.150
由于A1 = –lgT1 则 T1 =10-0.15 = 0.708=70.8%
10.6 吸光光度法的误差
10.7 常用的吸光光度法
10.8 吸光光度法的应用
2011.3
分析化学（2011)
CYJ 2
Analytical Chemistry 分析化学
化学分析与仪器分析方法比较
化学分析：常量组分(>1%)，Er 0.1%-0.2% 依据化学反应， 使用玻璃仪器
准确度高
灵敏度高 仪器分析：微量组分(<1%)， Er 2%-5% 依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器
2011.3
分析化学（2011)
CYJ 12
Analytical Chemistry 分析化学
吸收光谱
光作用于物质时，物质吸收了可见光，而 显示出特征的颜色，这一过程与物质的性 质及光的性质有关。
第十二章吸光光度分析法Spectrophotometry
吸收光谱分析 Analysis of Absorption Spectroscopy
吸光光度法是以物质对光的 选择性吸收为基础的分析方法.
本章主要讨论可见光区(400750 nm) 的吸光光度法
11.1 基本概念
1.物质对光的选择吸收
单色光
具有同一波长的光为单色光.
一束平行单色光通过有色溶液时， 溶液的吸光度A与液层厚度b和溶液 浓度c的乘积成正比。
--------Lambert -Beer定律
A=Kbc
K—比例常数,与溶液性质, T, l有关
K值随c的单位不同而不同, 液层厚度以cm为单位.
•c /g·L-1
A=abc
a 吸光系数 absorption coefficient
cx=0.0600 mg/ml c未=0.0600×50.00/10.00
=0.300 mg/ml
11.4 显色反应和显色条件
1.显色反应 1.灵敏度高.
Cu~NH3 e 6201.2×102 Cu~双硫腙 e 5335.0×104
2.选择性好 3.显色产物组成恒定,性质稳定. 4.显色产物与显色剂色差大,显色
复合光
由不同波长光组成的混合光
称为复合光。
互补光
透射光与吸收光组成白光，
故称为互补色光
物质的颜色 对不同波长的光选择性吸收
溶液的颜色 被吸收光色的互补色
硫酸铜溶液，吸收黄光
呈现蓝色.
黄
高锰酸钾溶液，吸收
绿光, 呈现紫色。
橙
绿 青
白光
青蓝
红
蓝
紫
光的互补色示意图
2.吸收曲线 absorption spectrum
十二章节吸光光度法
一定的强度比例混合，也可以得到白光，这 两种单色光就叫做互补色光 。如绿光和紫 光互补，蓝光和黄光互补。
互补色光：如绿光和紫光互补，蓝光和黄光 互补。
绿
黄
青（蓝绿）
橙
青蓝（绿蓝）
红
蓝
紫
表12-2* 物质的颜色与吸收光颜色的互补关系
武汉大学（四版）*
错。 ε改变，εmax 不变。
例12–3 有一浓度为1.0μg • mL–1的Fe2+溶液，以邻二 氮菲显色后，用分光光度计测定，比色皿厚度为 2.0cm，在波长510nm处测得吸光度A=0.380，计算 该显色反应的吸光系数a和摩尔吸光系数ε。
解：已知 b=2.0cm A=0.380 铁的摩尔质量M=55.85 g • mol–1
吸光光度法的特点： （1）灵敏度高； （2）准确度高； （3）操作简便 快速； （4）应用广泛。
二、物质对光的选择性吸收
1、物质的颜色是由于物质对不同波长的光具有选择 性吸收而产生的。
物质对光产生选择性吸收的原因 分子、原子或离子具有不连续的量子化能级。
只有照射光中光子的能量hν与被照射物质粒子的基 态和激发态能量之差△E相等的那部分色光才会被物 质或其溶液所吸收。不同的物质微粒由于结构不同
光而呈现蓝色
光的互补：蓝 黄
用不同波长的单色光照射，测吸光度— 吸收曲线
与最大吸收波长 max；
3、光吸收曲线
用不同波长的单色光照射某一物质测定吸光度， 以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制曲线， 描述物质对不同波长光的吸收能力。
吸收曲线
17
吸收曲线的讨论：
（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸 光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax
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第十二章 吸光光度分析法一、本章要点1．掌握吸收曲线的绘制方法、吸收光谱、最大吸收波长的概念。
2. 掌握朗伯-比尔定律、吸光度、摩尔吸光系数、透光率的基本概念及相互之间的关系。
3.熟悉偏离朗伯-比尔定律的原因。
4. 掌握显色反应及其条件的选择、吸光光度分析方法及熟悉常用仪器的基本原理、主要部件及具体操作。
二、示例解析1. 已知含Cd 2+浓度为140µg ·L -1的溶液，用双硫腙显色后，用厚度为2cm 的比色皿测得 A=0.22，计算此溶液的摩尔吸光系数。
解： 查表知Cd 的摩尔质量为112.41g ·mol —1c (Cd 2+)=140×10-6/112.41=1.25×10—6（mol ·L —1） 461088102512220⨯=⨯⨯==ε-...bc A （L ·mol -1·cm —1） 需要指出的是，上例中的ε 值是把被测组分看成是完全转变成有色化合物的。
但在实际测定中，因有色物质组成不确定或有副反应存在，实际计算出的是表观摩尔吸光系数。
2. 已知吸光度A = 0.474，计算T 及T %解： A = -lg T = 2 - lg T %lg T = -A = -0.474 ， T = 0.336； lg T % = 2-A = 2-0.474 =1.53， T % = 33.63. 准确移取含磷30μg 的标准溶液于25mL 容量瓶中，加入5%钼酸铵及其它相关试剂，稀释至刻度。
在690nm 处测定吸光度为0.410。
称10.0g 含磷试样，在与标准溶液相同的条件下测得吸光度为0.320。
计算试样中磷的质量分数。
解： ω（P ）=100⨯mA V c A S X S X =3100.1025410.02530320.0⨯⨯⨯⨯⨯ =0.23 4. 某一分光光度计的透光率读数误差为0.005，当测量的百分透光率为9.5%时，测得的浓度相对误差为多少？解：∆T = 0.005，T = 0.095，代入式（8-6）：095.0lg 095.0005.0434.0⨯⨯=∆c c = -0.022 = -2.2% 5. 测定某样品中Fe 的含量，称样0.2g 测得T =1.0%，若仪器透光率读数误差为0.50%试计算：⑴ 测量结果的相对误差为多少？⑵ 欲使测得的A 值为0.434，以提高测量的准确度，则应减少称样量或稀释样品多少倍？⑶ 若不进行上面的操作，为提高测量准确度应选用几厘米的比色皿？解： ⑴ ∆T =0.50%，T = 1.0%，代入（8-6）式01.0lg 01.0005.0434.0⨯⨯=∆C C = 0.1085 = 10.85% ⑵ 原试液T =1.0%，A = 2.00，要使A = 0.434，降低相对误差，则需稀释样品。
因为减少称样量会增大称量误差。
所以稀释倍数=C 原/C =2.00/0.434 =4.6，即稀释4.6倍。
⑶若不稀释样品，为了提高准确度，则要降低吸光度，因为C 较大，所以应选择厚度小的比色皿，即选用0.5cm 比色皿。
6. 如何选择适宜的参比溶液？答： 溶剂空白：在测定波长下溶剂有吸收。
试剂空白：在测定波长下试剂有吸收。
试样空白：在测定波长下试样基体有吸收。
蒸馏水空白：在测定波长下均无吸收。
7. 某合金中含有Mn 和Cr ，称取1.000g 试样，溶解后稀释至50.00mL ，将其中的Cr 氧化至Cr 2O 72-，Mn 氧化至MnO 4-，然后在440nm 和545nm 用1.0cm 比色皿测得吸光度分别为0.204和0.860。
已知在440nm 时Mn 和Cr 的摩尔吸光系数分别为ε（Mn ）=95.0 L ·cm —1·mol —1，ε（Cr ）=369.0 L ·cm —1·mol —1。
在545nm 时Mn 和Cr 的摩尔吸光系数分别为ε（Mn ）=2.35⨯103 L ·cm—1·mol —1，ε（Cr ）=11.0 L ·cm —1·mol —1。
求试样中Mn ，Cr 的质量分数。
（M （Mn ）=54.94 g ·mol—1，M （Cr ）=52.00 g ·mol —1）解：根据（8-8）、（8-9）式Cr Cr 440M n Mn 440Cr 440M n 440440bC bC A A A ε+ε=+=Cr Mn Mn Cr Mn bC A A A 545545545545545εε+=+= 0.204 = 95.0⨯C Mn + 369.0⨯C Cr0.860 = 2350⨯C Mn + 11.0⨯C Cr解得 C Mn = 3.64⨯10—4mol ·L —1 C Cr = 4.59⨯10—4mol ·L -1ω（Mn ）=000.194.5410501064.334⨯⨯⨯⨯-- = 0.0010 ω（Cr ）=000.100.525021059.44⨯⨯⨯⨯- = 0.0024 8. 某酸碱指示剂在水中存在下列平衡：HIn （黄色） H + + In -（蓝色），在650nm 处仅In -有吸收。
今配制两份同浓度而不同pH 值的指示剂溶液，于650nm 处在同样测量条件下测量吸光度，得到pH 1 = 4.50时，A 1 =0.180；pH 2 = 5.10时，A 2 =0.360。
求该指示剂的理论变色点。
解：根据酸碱指示剂变色原理，其理论变色点的pH 即指示剂的p K a θ。
设酸碱指示剂的总浓度为c ，当指示剂全部以In -存在，即C In = C 时，吸光度为A ，则pH 1 = p K a θ + lg11In In C C c - pH 2 = p K a θ + lg 22In In C C C - c （In -）1 = A 1/εb ， c （In ）2 = A 2/εb ， c = A /εb 代入上式pH 1 = p K a θ + lg =-11A A A p K A θ + lg =-180.0180.0A 4.50 pH 2 = p K a θ + lg 2A A A -= p K a θ + lg =-360.0360.0A = 5.10 解得： A = 0.540 p K a θ = 4.80三、自我检测（一）判断题1.可见光的波长范围在400-760nm 之间。
（ ） 2.吸光度A 与透光度T 成反比。
（ ） 3.朗伯-比尔定律只适用于单色光。
（ ） 4.同一物质与不同显色剂反应，生成不同的有色化合物时具有相同的ε 值。
（ ） 5.可见光源用钨丝白炽灯，紫外光源用氘灯。
（ ） 6.若显色剂用量多，则显色反应完成程度高，故显色剂用量越多越好。
（ ） 7.一般来说，加入有机溶剂，可以提高显色反应的灵敏度。
（ ）8. 浓度相对误差仅与仪器读数误差相关。
（ ）9. 浓度较高时测量相对误差大，浓度较低时，测量相对误差小。
（ ）10. 符合朗伯-比尔定律的某有色溶液稀释时，其最大吸收波长λmax 向长波方向移动。
（ ）11. 有色溶液的吸光度随溶液浓度增大而增大，所以吸光度与浓度成正比。
（ ）12. 在光度分析中，溶液浓度越大，吸光度越大，测量结果越准确。
（ ）（二）填空题1. 朗伯-比尔定律数学表达式：A =kbc ，式中A 代表 ，b 代表 ，c 代表 ，k代表 。
当c 的单位用mol ·L -1表示时，k 以符号 表示，称为 。
2. 下列物质水溶液选择吸收光的颜色为：CuSO 4 ；K 2Cr 2O 7 ； KMnO 4 。
3. 光度计的种类和型号繁多，但都主要由 、 、 、 、 五大部件组成。
4. 分光光度计的表头上，均匀的标尺是 ，不均匀的标尺是 。
5. 为了降低测量误差，吸光光度分析中比较适宜的吸光度范围是 ，吸光度为 时，测量误差最小。
6. 在以参比溶液调节仪器的零点时，因无法调至透光度为100%，而只好调节至95%处，此处测得一有色溶液的透光度读数为35.2%，该有色溶液的真正透光度为 。
7. 二苯硫腙的CCl 4溶液吸收580 ~ 620nm 范围内的光，它显 色。
8. 测量某有色配合物在一定波长下 用2cm 比色皿测定时其T =0.60，若在相同条件下改用1.0cm 比色皿测定，吸光度A 为 ，用3.0cm 比色皿测定，T 为 。
9. 苯酚在水溶液中摩尔吸光系数为6.17⨯103 L ·cm —1·mol —1，若要求使用1.0cm 比色皿，透光度在0.15 ~ 0.65之间，则苯酚的浓度应控制在 。
10. 吸光光度分析的方法有 、 、 等。
（三）选择题1. 在吸光光度法中，透射光强度与入射光强度之比称为 （ ）A ． 吸光度 B. 透光度 C. 消光度 D. 光密度2. 有色溶液的摩尔吸光系数ε 与下列哪种因素有关 （ ）A ．入射光波长 B.液层厚度 C.有色物质浓度 D.有色物质稳定性3. 透光度与吸光度的关系是 （ ）A. 1/T = AB. lg1/T = AC. lg T = AD. T = lg1/A4. 若测得某溶液在λmax 时A >0.8，可以采取下列哪些措施？ （ ）A.增大光源亮度B.改变入射光波长C.稀释溶液D.换用小的比色皿。
5. 邻菲罗林测Fe ，合适的参比溶液 （ ）A ．样品空白 B.试剂空白 C.蒸馏水空白6. 分光光度法测定钴盐中微量Mn ，加入无色氧化剂将Mn 2+氧化为MnO 4-，测定中应选（ ）A.试剂空白B.不加氧化剂的样品空白C. 蒸馏水空白7. 一有色溶液，测得 A = 0.701，其T %为 （ ）A ． 10.7 B.19.9 C.15.8 D.25.28. KMnO 4溶液吸收白光中的 （ ）A ．黄光 B.红光 C.蓝光 D.绿光9. 符合朗伯-比尔定律的有色溶液，当其浓度增大后 （ ）A. λmax 不变 B .T 增大 C. A 减小 D.ε 增大10. 有A 、B 两份完全相同的有色物质溶液，A 溶液用1.0cm 比色皿，B 溶液用2.0cm 比色皿，在同一波长下测得的吸光度值相等，则它们的浓度关系为。
（ ）A. C A = 1/2C BB. B A c c =C. C A = 2C BD. 2B A c c =（四）计算题1. 有一KMnO4溶液，盛于1cm比色皿中，在560nm波长的单色光下测得透光度为60%，如将其浓度增大1倍，其它条件不变，吸光度为多少？2. Fe2+用邻二氮菲显色，当Fe2+的浓度ρ=0.76μg·mL—1，于510nm波长处、用2.0cm的比色皿测得透光度为50.2%，求该显色反应的摩尔吸光系数。