细胞原代培养

• 胶塞和塑料用品清洗
清水浸泡后，2％NaOH溶液煮沸10min, 自来水冲洗、晾干，1％稀盐酸浸泡30min, 自来水冲洗，双蒸水冲3次，晾干、包装。
二、物品包装
同类物品包装一起，大小合适，包扎紧 凑，多层包装，写上标签
三、消毒
• 器具常用压力蒸汽灭菌 掌握时间：煮沸10～20min
• 试剂消毒 无机试剂可用压力蒸汽灭菌（插5～7＃
3.过滤
• 用400目不锈钢筛网过滤 • 收集滤液于离心管 4.离心 • 平衡、离心5min，1000～1500 rpm • 去上清，加PBS，混匀，离心（同上） • 重复上一步 5.接种 • 去上清，加3～5ml培养基，混匀，接种于培养瓶 • 加培养基3～5mm深，盖紧盖，观察细胞密度 6.培养
其它常用液
• 消化液 0.25％胰蛋白酶溶液、0.02%EDTA溶液、胶原酶。
• 消化酶抑制剂 0.1％～0.5％大豆胰酶抑制剂
• NaHCO3溶液 常用浓度7.4％、5.6％、3.7％
• HEPES溶液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸） 终浓度10～50 mmol/L
• 抗生素液 青霉素和链霉素二者的终浓度都达到100U/ml
• 对骨、前列腺、癌组织等纤维多、较硬的 组织可用胶原酶
• 短时间内可获得大量活细胞
主要实验器材
• 培养箱 二氧化碳恒温箱，5％CO2，37℃，保持湿
度，消毒灭菌。
• 倒置显微镜 可观察活细胞，直接观察培养瓶或培养板，
带拍摄等功能。
• 离心机 普通离心机（500～4000rpm），高速离心
机（1000～15000），冷冻离心机等 （离心力转换成转速： g ＝1.118×r2×10－5）
细胞的原代培养
（研究生实验教学）
实验目的
• 熟悉细胞培养的基本条件和准备工作
• 熟悉并掌握原代培养中取材、消化、收集 细胞和接种等基本实验技术
• 了解细胞原代培养的原理及其方法
实验原理
• 原代培养（primary culture） 从供体取得组织细胞在体外首次培养。 细胞分化、药物测试、细胞株建立等
• 基本方法 组织块法和消化法
a.组织块法：直接将组织块接种于培养瓶， 24小时就有细胞向四周游出。 简便、易行，适合于来源有限、数量较少 的组织做原代细胞培养
b.消化法
• 用酶消化、分解妨碍细胞生长的间质（基 质、纤维等），形成单个细胞或细胞团
• 对上皮、肝、肾、胚胎等间质少、较软组 织选择胰蛋白酶
针头）
有机试剂过滤除菌，常用0.22µm • 超净工作台
紫外灯照射30min以上 • 培养室
紫外灯照射2～3h/天
操作步骤
1.取材 • 75％酒精浸泡乳鼠2min，取肝脏于平皿中 • PBS溶液洗涤3次 • 去除液体后，剪碎成1～2mm3小块 2.消化 • 加5～8倍组织量的胰蛋白酶溶液 • 转移到离心管内，加盖 • 37℃水浴15min，每5min摇晃1次 • 终止消化：加1ml含血清的培养基DMEM
放入培养箱，2天后观察，换液。
•Biblioteka Baidu超净工作台 紫外消毒，鼓风，保持干净、整洁
• 高压锅 用电，带压力表，自动恒压，掌握时间
橡胶、塑料、药品——15’，金属——20’ • 培养瓶
玻璃瓶和塑料瓶，洗涤要干净，临时消毒
• 培养基 a.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解乳蛋白等 b.合成培养基：DMEM、RPMI1640、199培养基等 c.无血清培养基：Ham F12和DMEM混合的基础培 养基、自行设计与配制的培养基（加其他成分）
主要实验准备工作
一、培养用具的清洗 • 浸泡
清水浸泡数小时，新玻璃器皿泡5％稀盐酸12h以 上（中和表面碱性物质） • 洗刷
洗洁精、软毛刷，轻刷、多次、彻底 • 浸酸（由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水配制）
灌满，6h以上，最好过夜，去污好 • 冲洗
充分，灌满-倒出10次以上，最后蒸馏水冲 2～3次，烘干、包装。