细胞转染技术-宋晓萍
转染详细步骤大攻略
转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。
将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。
具体操作步骤如下：1）质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下：(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
（注：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低）(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
（注：混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
（注：溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清）(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min 至溶液变清亮。
(6)37℃水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。
12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。
(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。
PEI转染技术
PEI法瞬时转染HEK-293F悬浮培养物细胞于37℃，150rpm下，CO2恒温箱中的振荡器平台上悬浮生长。
在进行转染之前，请保持5-7代的培养物，以确保稳定的生长模式。
HEK293悬浮细胞（Freestyle™293-F细胞，Life Technologies，目录号R790-07）于Freestyle™293表达培养基（Life Technologies，货号12338026）中培养。
细胞量应维持在4 x 105和3 x 106细胞/ml之间，体积不超过培养瓶总体积的20％。
最佳旋转速率由每种培养瓶类型和培养量确定。
Life Technologies的Freestyle™293-F细胞在更高的密度和体积下容易结块。
聚乙烯亚胺（PEI）（25 kDa线性PEI，Polysciences，Inc.，目录号23966）在含有25mM HEPES和150mM NaCl（pH 7.5）的缓冲液中以1 mg/ml的浓度制备成母液。
PEI添加到缓冲液，并涡旋振荡，直至完全溶解（这可能需要花费数分钟的涡旋时间）。
一旦完全溶解的PEI可以使用0.22 µM注射器过滤器进行无菌过滤，分装后在-20℃冷冻直至需要。
为了获得最佳的转染效率，细胞在转染时应具有> 95％的活力。
转染前24小时，使细胞分裂增殖至约1 x 106细胞/ml的密度，并在37°C CO2培养箱中振荡过夜。
转染时细胞密度应为约2 x 106细胞/ml。
转染应以2.5 x 106至3.0 x 106细胞/ml的细胞密度进行。
使用血球计数器对细胞计数，并调低足够的体积，以2.5 x 106细胞/ml的密度将细胞重悬在新鲜的293F Freestyle Media中，并以所需的体积进行转染。
转染前将细胞重悬于新鲜培养基至关重要。
条件培养基含有抑制转染的代谢产物。
细胞应在室温下以1200 rpm旋转10分钟。
转染24小时后，将转染产物以1：1稀释，即转染的初始体积是所需最终体积的一半。
lipo2000转染操作步骤
Lipo2000 瞬时转染细胞步骤Stealth? RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection像293T细胞，因为半贴壁，换液容易导致细胞飘起来，所以中间不换液。
转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
生素可以进入细胞。
这降低了细胞的活性，导致转染效率低。
所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。
这样，在转染前也不必润洗细胞。
对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。
另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。
3.细胞状态这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。
有文献说传代不要超过17代。
细胞复苏后的3代左右时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化。
lipo转染操作步骤
L i p o2000瞬时转染细胞步骤Stealth?RNAiorsiRNATransfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。
B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将AB两管混合，放置20min。
3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
PlasmidDNATransfectionDNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1中板。
贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。
2转染。
A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。
B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将AB两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cmdish细胞质粒转染量4-6ug足以。
Opti-MEM?I减血清培养基是EMEM的改良型,其中使用了HEPES和碳酸氢钠进行缓冲,并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、痕量元素和生长因子.常用其作为无血清培养基与质粒和lip2000分别混合。
细胞生物学技术课件GFP细胞转染实验讲义
这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳 定表达
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载体名称：pEYFP-C1 载体类型：哺乳动物细胞表达载体
载体大小：4.7kb 载体宿主：大肠杆菌，哺乳动物细胞（E.coli, Mammalian cells） 细菌抗性：卡纳（kan） 真核筛选标记：新霉素（Neomycin） 5' 测序引物：EGFP-N Sequencing Primer (#6479-1) 3' 测序引物：EGFP-C Sequencing Primer (#6478-1) 载体描述：encodes an enhanced yellow-green variant of the Aequorea victorioiled plasmid DNA or siRNA constructs), or even proteins such as antibodies, may be transfected.
Transfection of animal cells typically involves opening transient pores or "holes" in the cell membrane, to allow the uptake of material.
inhibitor and mimics转染使用说明方法学
mmu-miR-125a-5p研究策略Standard 报价Standard 报价2ng 350 RMB 5ng 600 RMBmicr ON™ mmu-miR-125a-5pmimic2ng 300 RMB 5ng 500 RMBmicr OFF™ mmu-miR-125a-5pinhibitor,转染mmu-miR-125a-5p mimic(24孔板为例)1．联系锐博公司合成mmu-miR-125a-5p mimic和mmu-miR-125a-5p inhibitor;2．合成的2ng mmu-miR-125a-5p mimic用1000ul RNase-free water配制成20uM的储存液,分装成5ul每管放-30或-80冻箱冻存(mimic的工作浓度为50nM);3．转染前一天，胰酶消化细胞并计数1X105 c-kit-，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中;4．对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释1.25ul mmu-miR-125a-5p mimic 存储液;5．对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ无血清培养基稀释1μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后室温5分钟（在30分钟内同稀释的RNA混合。
室温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合6．混合稀释的RNA（第4步）和稀释的Lipofectamine 2000（第5步）。
在室温保温20分钟。
注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。
复合物可以在室温保持6小时稳定7．直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀,加入500ul培养基,混匀。
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在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质 粒DNA链发生断裂。所以，多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：
共价闭合环状DNA（超螺旋 ）： 质粒的两条链没有断裂； 开环DNA： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子； 线形DNA： 质粒的两条链均断裂；线性分子
ErbB2 ErbB2 ErbB2
2
稳定转染
1. 转染前一天铺板：5.0-8.0×104细胞接种在24孔板上，0.5ml正常培养基。 2. 24h后的细胞融合达到70%-90%的密度。 3. 转染： （1）50ul无血清培养基（Opti-MEM）+20pmol siRNA（或0.8ugDNA）， 柔和混匀，室温孵育5min （2） 50ul无血清培养基+1ul lipo2000（DNA+2ul lipo2000）柔和混匀，室 温孵育5min。 （3）将DNA加入Lipo2000中，轻柔混匀，室温孵育20min 4.将24孔板中的正常培养基换为无血清的培养基（Opti-MEM）1.9ml。 5.将100ulsiRNA/Lipo2000（DNA/Lipo2000）复合物混匀逐滴加入孔中，轻 轻摇匀。 6.4-6h后，换培养基（全培），48-72小时监测转染水平。 7. 加相应的抗生素筛选，一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单后就可 以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2
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转染方法
瞬时转染 稳定转染 逆转录病毒转染
转染前细胞培养
细胞培养用品 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 35mm 60mm 细胞培养用品 96孔板 24孔板 12孔板 表面积（mm2/孔） 50 100 200 401 962 962 2827 siRNA/DNA 5pmol/0.2μg 20pmol/0.8μg 40pmol/1.6μg 细胞密度 1.5×104-5.0×104 3.0×104-1.0×105 8.0×104-2.0×105 1.6×105-4.0×105 3.0×105-8.0×105 3.0×105-8.0×105 1.0×106-2.5×106 培养基终体积 100μl 500μl 1.0ml 培养基（μl/孔） 100μl 200μl 500μl 1.0ml 2.0ml 2.0ml 6.0ml
2. Invitrogen公司 Lipofetamine2000，适合于Hela，BHK，HEK，COS-7，PC12，NIH3T3等各种 常用细胞系的RNAi转染。 3. 转染FAQs： 脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂 质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。 悬浮细胞是用的电穿孔法。
6. 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长 溶解时间。 7. 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。 8. 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完 全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。 9. 洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液或水。 洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确 保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸 馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。 10. 洗脱体积太小：随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。 11. 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min可 达到较好的效果。
Lipo2000（siRNA/DNA） 0.25μl/0.5μl 1μl/2μl 2μl/4μl
6孔板
35mm 60mm
100pmol/4.0μg
100pmol/4.0μg 600pmol/8.0μg
2.0ml
2.0ml 5.0ml
5μl/10μl
5μl/10μl 10μl/20μl
推荐的DNA:Lipo2000=1:0.5-1:5（ug：ul） siRNA:Lipo2000=1:0.01-1:0.1（pmol：ul）
3. 挑选单克隆. ①滤纸片法：用消毒的 5x5mm 滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在 单细 胞 集落上 10-15 秒,取出粘附有细胞的滤纸片放于 24 孔板中继续加 压培养. 细胞在 24 孔板中长满后转入 25cm2 培养瓶中,长满后再转 入 75cm2 培养瓶中培养. ②有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的 10 倍稀释（10-2-1010）,将每一稀释度的细胞滴加到 96孔板中培养,7- 10天后,选择单 个克隆生长的孔再一次进行克隆. 4. ELISA或 Westernblot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由 于不同克隆的 表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达 量最高的克隆传代并保种.
转染细胞的稳定筛选
1． 确定抗生素作用的最佳浓度： 不同的 细胞株 对各种抗生素有不同 的敏感性,因此在筛选前要做预试验,确定抗生素对所选择细胞的最低作用 浓度. ①提前 24 小时在 96 孔板或 24 孔板中接种细胞 8 孔,接种量以第二天长 成 25%单层为宜,置 CO2 孵箱中 37℃培养过夜. ②将培养液换成含抗生素的培养基, 抗生素浓度按梯度递增0,（50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μ g/ml）. ③培养 10-14 天以绝大部分（>90%） 细胞死亡 浓度为准, 筛选稳定表 达克隆时可比该浓度适当提高一个级别,维持时使用筛选浓度的一半. 2． 转染 48-72 小时后按 1: 10 的比例将转染细胞在 6 孔板中传代,换为 含预试验中 确定的抗生素浓度的选择培养基.在6 孔板内可见单个细胞, 继续培养可见单个 细胞分裂 繁殖形成单个抗性集落.
该菌株在使用pUC系列质粒载体进行 分子克隆、质粒提取和 DNA转化或用M13 phage载体进行转 蛋白质表达。 染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽 和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补， 从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此 很容易鉴别重组体菌株
JM109
质粒的转化具体方法省略…… NOTE: I. 不同的感受态细菌转化效率不同，选择合适的E.coli II. 1ng的cccDNA就可使50ul的感受态细胞饱和，DNA量过多会降低转化 效率。 III. 转化时为提高转化效率，质粒加入E.coli培养1h后可离心弃上清后用剩 余的菌液涂布。
感受态细菌细胞 TG1 DH5a
特点 长得慢，菌落较小，转化效率高， E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体 转化时，可与载体编码的β－半乳糖 苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝 白斑筛选鉴别重组菌株。
用途 用于普通的克隆测序 常用于分子克隆、质粒 提取和蛋白质表达。
BL21(DE3)
该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌 一般用于外源基因的原 体T7启动子的表达载体（如pET系列） 核表达 的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染 色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 长的快，菌落较大，转化效率低点。
2
质粒提取扩增
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。 将细菌质粒转化到大肠杆菌中，然后从大肠杆菌中收获大量质粒的过程。
1、质粒的转化
——将质粒 DNA 导入细菌的过程 感受态细菌细胞在 CaCl 2 低渗溶液中膨胀为球状（感受态细菌的制备， 略）。质粒 DNA 与 CaCl 2 形成抗 DNase 羟基 - 磷酸钙复合物黏附于 细菌表面，经 42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物。在 丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌 中，外源基因得到表达。 BL21(DE3)一般用于外源基因的原核表达， DH5a，TG1和HB2151一般用于重组质粒的克隆和扩增 TG1长得慢，菌落较小，转化效率高，用于普通的克隆测序， BL21(DE3)长的快，菌落较大，转化效率低点，主要用于原核表达。
细胞转染技术
汇报人：宋晓萍 2015.5.9
目录
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基本原理 质粒提取扩增 转染方法 影响转染实验的因素 常见问题及解决方案
1
细胞转染——基本原理将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。
研究内容：研究和控制真核细胞基因功能 应 用：基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物 学试验
2、质粒的提取扩增
I. 细菌铺板：加入抗生素（终浓度是50ug/ml-100ug/ml） II. 挑选菌落：从LB培养基上挑选菌落备用 III. 细菌培养：37摄氏度培养箱中以180rpm摇动12~14h，使大肠杆菌 繁殖 IV. 碱裂解抽提：采用细胞裂解的方式，从含目标质粒的大肠杆菌菌液 中将质粒提取出来
常规转染技术
外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细 胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持 续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说， 超螺旋质粒 DNA 转染效率较高，在转染后 24-72 小时内 （依赖于各种不同的构建）分析结果， 常常用到一些报告 系统如荧光蛋白，β 半乳糖苷酶等来帮助检测。
瞬时转染
稳定转染
外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游 离体（episome）存在。尽管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转 入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小， 大约 1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标 记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉 素 B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选， 得到稳定转染的同源细胞系。
15,000bp 10,000bp 7,500bp 5,000bp
常见问题及解决方案
Q1：原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?
这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。 解决办法： 1. 降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。 2. 使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使 得质粒复制更加稳定。 3. 质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的