细胞转染技术-宋晓萍

在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质 粒DNA链发生断裂。所以，多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：
共价闭合环状DNA（超螺旋 ）： 质粒的两条链没有断裂； 开环DNA： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子； 线形DNA： 质粒的两条链均断裂；线性分子
ErbB2 ErbB2 ErbB2
6. 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长 溶解时间。 7. 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。 8. 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完 全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。 9. 洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液或水。 洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确 保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸 馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。 10. 洗脱体积太小：随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。 11. 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min可 达到较好的效果。
2
质粒提取扩增
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。 将细菌质粒转化到大肠杆菌中，然后从大肠杆菌中收获大量质粒的过程。
1、质粒的转化
——将质粒 DNA 导入细菌的过程 感受态细菌细胞在 CaCl 2 低渗溶液中膨胀为球状（感受态细菌的制备， 略）。质粒 DNA 与 CaCl 2 形成抗 DNase 羟基 - 磷酸钙复合物黏附于 细菌表面，经 42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物。在 丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌 中，外源基因得到表达。 BL21(DE3)一般用于外源基因的原核表达， DH5a，TG1和HB2151一般用于重组质粒的克隆和扩增 TG1长得慢，菌落较小，转化效率高，用于普通的克隆测序， BL21(DE3)长的快，菌落较大，转化效率低点，主要用于原核表达。
2
稳定转染
1. 转染前一天铺板：5.0-8.0×104细胞接种在24孔板上，0.5ml正常培养基。 2. 24h后的细胞融合达到70%-90%的密度。 3. 转染： （1）50ul无血清培养基（Opti-MEM）+20pmol siRNA（或0.8ugDNA）， 柔和混匀，室温孵育5min （2） 50ul无血清培养基+1ul lipo2000（DNA+2ul lipo2000）柔和混匀，室 温孵育5min。 （3）将DNA加入Lipo2000中，轻柔混匀，室温孵育20min 4.将24孔板中的正常培养基换为无血清的培养基（Opti-MEM）1.9ml。 5.将100ulsiRNA/Lipo2000（DNA/Lipo2000）复合物混匀逐滴加入孔中，轻 轻摇匀。 6.4-6h后，换培养基（全培），48-72小时监测转染水平。 7. 加相应的抗生素筛选，一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单后就可 以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2
15,000bp 10,000bp 7,500bp 5,000bp
常见问题及解决方案
Q1：原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?
这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。 解决办法： 1. 降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。 2. 使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使 得质粒复制更加稳定。 3. 质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的
转染细胞的稳定筛选
1． 确定抗生素作用的最佳浓度： 不同的 细胞株 对各种抗生素有不同 的敏感性,因此在筛选前要做预试验,确定抗生素对所选择细胞的最低作用 浓度. ①提前 24 小时在 96 孔板或 24 孔板中接种细胞 8 孔,接种量以第二天长 成 25%单层为宜,置 CO2 孵箱中 37℃培养过夜. ②将培养液换成含抗生素的培养基, 抗生素浓度按梯度递增0,（50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μ g/ml）. ③培养 10-14 天以绝大部分（>90%） 细胞死亡 浓度为准, 筛选稳定表 达克隆时可比该浓度适当提高一个级别,维持时使用筛选浓度的一半. 2． 转染 48-72 小时后按 1: 10 的比例将转染细胞在 6 孔板中传代,换为 含预试验中 确定的抗生素浓度的选择培养基.在6 孔板内可见单个细胞, 继续培养可见单个 细胞分裂 繁殖形成单个抗性集落.
感受态细菌细胞 TG1 DH5a
特点 长得慢，菌落较小，转化效率高， E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体 转化时，可与载体编码的β－半乳糖 苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝 白斑筛选鉴别重组菌株。
用途 用于普通的克隆测序 常用于分子克隆、质粒 提取和蛋白质表达。
BL21(DE3)
该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌 一般用于外源基因的原 体T7启动子的表达载体（如pET系列） 核表达 的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染 色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 长的快，菌落较大，转化效率低点。
脂质体介导转染
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细 胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内。
转染试剂的选择
1. promega公司
Promega转染试剂产品适合于人HeLa，Hep G2，293，K562，Jurkat；猴COS7，CV-1；小鼠NIH3T3；仓鼠BHK，CHO；大鼠PC12；昆虫S19等等细胞系的 RNAi转染。
3
1 2 3
转染方法
瞬时转染 稳定转染 逆转录病毒转染
转染前细胞培养
细胞培养用品 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 35mm 60mm 细胞培养用品 96孔板 24孔板 12孔板 表面积（mm2/孔） 50 100 200 401 962 962 2827 siRNA/DNA 5pmol/0.2μg 20pmol/0.8μg 40pmol/1.6μg 细胞密度 1.5×104-5.0×104 3.0×104-1.0×105 8.0×104-2.0×105 1.6×105-4.0×105 3.0×105-8.0×105 3.0×105-8.0×105 1.0×106-2.5×106 培养基终体积 100μl 500μl 1.0ml 培养基（μl/孔） 100μl 200μl 500μl 1.0ml 2.0ml 2.0ml 6.0ml
3. 挑选单克隆. ①滤纸片法：用消毒的 5x5mm 滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在 单细 胞 集落上 10-15 秒,取出粘附有细胞的滤纸片放于 24 孔板中继续加 压培养. 细胞在 24 孔板中长满后转入 25cm2 培养瓶中,长满后再转 入 75cm2 培养瓶中培养. ②有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的 10 倍稀释（10-2-1010）,将每一稀释度的细胞滴加到 96孔板中培养,7- 10天后,选择单 个克隆生长的孔再一次进行克隆. 4. ELISA或 Westernblot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由 于不同克隆的 表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达 量最高的克隆传代并保种.
细胞转染技术
汇报人：宋晓萍 2015.5.9
目录
1 2
3 4 5
基本原理 质粒提取扩增 转染方法 影响转染实验的因素 常见问题及解决方案
1
细胞转染——
基本原理
将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。
研究内容：研究和控制真核细胞基因功能 应 用：基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物 学试验
瞬时转染
稳定转染
外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游 离体（episome）存在。尽管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转 入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小， 大约 1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标 记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉 素 B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选， 得到稳定转染的同源细胞系。
2. Invitrogen公司 Lipofetamine2000，适合于Hela，BHK，HEK，COS-7，PC12，NIH3T3等各种 常用细胞系的RNAi转染。 3. 转染FAQs： 脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂 质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。 悬浮细胞是用的电穿孔法。
Q2：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决?
1. 大肠杆菌老化，细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养， 2. 质粒拷贝数低，质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚 活化的菌比负80℃保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可 能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。 3. 菌体中无质粒，质粒丢失。每次接种时应接种单菌落。另外，检查抗生 素使用浓度是否正确。判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在 光线明亮处摇荡新鲜培养液，如果菌液呈漂絮状，情况很好。如果呈泥 水状，即看不到絮状，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。 4. 碱裂解不充分，菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。 5. 吸附柱过载：
该菌株在使用pUC系列质粒载体进行 分子克隆、质粒提取和 DNA转化或用M13 phage载体进行转 蛋白质表达。 染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽 和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补， 从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此 很容易鉴别重组体菌株
JM109
质粒的转化具体方法省略…… NOTE: I. 不同的感受态细菌转化效率不同，选择合适的E.coli II. 1ng的cccDNA就可使50ul的感受态细胞饱和，DNA量过多会降低转化 效率。 III. 转化时为提高转化效率，质粒加入E.coli培养1h后可离心弃上清后用剩 余的菌液涂布。
Lipo2000（siRNA/DNA） 0.25μl/0.5μl 1μl/2μl 2μl/4μl
6孔板
35mm 60mm
100pmol/4.0μg
100pmol/4.0μg 600pmol/8.0μg
2.0ml
2.0ml 5.0ml
5μl/10μl
5μl/10μl 10μl/20μl
推荐的DNA:Lipo2000=1:0.5-1:5（ug：ul） siRNA:Lipo2000=1:0.01-1:0.1（pmol：ul）
2、质粒的提取扩增
I. 细菌铺板：加入抗生素（终浓度是50ug/ml-100Hale Waihona Puke Baidug/ml） II. 挑选菌落：从LB培养基上挑选菌落备用 III. 细菌培养：37摄氏度培养箱中以180rpm摇动12~14h，使大肠杆菌 繁殖 IV. 碱裂解抽提：采用细胞裂解的方式，从含目标质粒的大肠杆菌菌液 中将质粒提取出来
1
瞬时转染
1. 转染前一天铺板：5.0-8.0×104细胞接种在24孔板上，0.5ml正常培养基。 2. 24h后的细胞融合达到70%-90%的密度。 3. 转染： （1）50ul无血清培养基（Opti-MEM）+20pmol siRNA（或0.8ugDNA）， 柔和混匀，室温孵育5min （2） 50ul无血清培养基+1ul lipo2000（DNA+2ul lipo2000）柔和混匀，室 温孵育5min。 （3）将DNA加入Lipo2000中，轻柔混匀，室温孵育20min 4.将24孔板中的正常培养基换为无血清的培养基（Opti-MEM）1.9ml。 5.将100ulsiRNA/Lipo2000（DNA/Lipo2000）复合物混匀逐滴加入孔中，轻 轻摇匀。 6.4-6h后，换培养基（全培），48-72小时监测转染水平。 7. 转染效率： • 绿色荧光蛋白看荧光 • mRNA水平，48h后收样品，做PCR • 蛋白水平，72h后收蛋白，做WB。
常规转染技术
外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细 胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持 续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说， 超螺旋质粒 DNA 转染效率较高，在转染后 24-72 小时内 （依赖于各种不同的构建）分析结果， 常常用到一些报告 系统如荧光蛋白，β 半乳糖苷酶等来帮助检测。