五、鸡胚的壳外培养
不同时期鸡胚体外培养及其影响因素的研究
Ａ Ｓ板 材 时从 粒 料 干燥到 板 材冷却 定 型的 各种 工 艺参数 、 响 因素及 其 控 制 要 点 ； 纳 总结 了挤 出成 型 Ａ Ｓ板 材 的 Ｂ 影 归 Ｂ
各 种 质 量 缺 陷 、 生 原 因及 其 相 应 的 对 策 措 施 。 产
关键 词 冰箱 ＡＢ Ｓ板 材 挤 出成 型 工 艺 控 制
光 泽 ， 有 良好 的 电性 能 和 热 流 动 性 。故 而 Ａ Ｓ的 并 Ｂ
圈
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综合性能 较好 。Ａ Ｓ的缺 点是 ： 耐侯 性差 ， Ｂ ① 长期暴 露 在 空气 中 易 变 脆 发 黄 ， 是 因 为 丁 二 烯 单 元 中含 这 有 双 健 ， 紫 外 线 作 用 下 会 发 生 降 解 。 为 此 包 装 在 Ａ Ｓ板材时必须使 用黑 色 Ｐ Ｂ Ｐ薄 膜 ； 易 吸湿 ， 装 ② 包 Ａ Ｓ板 材 要 注 意 密 封 性 和 存 放 期 限 （ 般 为 ２ ） Ｂ 一 ８ｄ ； ③ 不 耐 有 机 溶 剂如 丙 酮 等 ， 以 在 选 择 发 泡 剂 、 泡 所 清
挤 出成 型 是 塑 料 主 要 的 成 型 加 工 方 法 之 一 。 冰
箱 内胆 材 料 采 用 的 （ 烯 腈 ／ 二 烯／ 乙 烯 ） 聚 丙 丁 苯 共 物 （ Ｂ ） 材 就 是 挤 出 成 型 制 品 。挤 出成 型 的 ＡＢ ＡＳ板 Ｓ 板 材再 经 真 空 吸 塑 二 次 加 工 制 成 箱 胆 和 门 胆 。 若 Ａ Ｓ板 材 厚 度 不 均 ， 塑 时会 使 内 胆 厚 薄 不 均 ， 泡 Ｂ 吸 发 后 易 造 成 内胆 应 力 开 裂 、 泡 ， 响 门 封 条 的 装 配 ， 离 影 从 而 影 响 冰 箱 的 制 冷 性 能 ； Ａ Ｓ板 材 存 有 杂 质 、 若 Ｂ “ 眼 ”、 纹 、 线 、 孔 、 寸 超 差 等 现 象 将 影 响 牛 木 划 针 尺 吸塑成品率 ； 板材塑化 、 光定型 、 引不均衡 ， 若 压 牵 则
鸡胚
鸡胚培养法的缺点：
1. 一般的病毒通常不使鸡胚产生特异性的感染指 征。 2. 卵黄中常常含有抗家禽病原体的母体抗体。 3. 某些细菌、衣原体和病毒能够从感染的母鸡传 递到鸡胚。 4. 通常鸡胚常常含有白血病病毒。 5. 在鸡食物中加入抗菌素，母鸡吃后会传递给鸡 胚，鸡胚就会产生对立克次体和衣原体感染的抵 抗。
五、注意事项
鸡胚为一活的有机体，因此要严格 无菌操作，同时动作要仔细，以免造成 物理死亡。接种后24小时内死亡应不计 结果。
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流感病毒鸡Байду номын сангаас培养法
福建省疾病预防控制中心 杨式芹
一、概况
1911年Rous和Murphy首先应用鸡胚 培养研究肉瘤病毒(Rous肉瘤)的繁殖。 1938年Goodpasture和Burnet等应用 鸡胚繁殖病毒、Cox应用卵黄囊培养立克 次氏体。
鸡胚培养法的优点：
1. 它的组织分化程度低，可选择适当途径 接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体 含大量病毒。 2. 是个整体，有神经血管的分布及脏器的 构造。 3. 来源充足，操作简单，通常是无菌的， 对接种的病毒不产生抗体。
二、鸡胚的结构与生理
鸡胚是由三个胚层发育起 来的，即外胚层，中胚层和内 胚层，它们构成胚胎的组织与 器官。
（约10日龄鸡胚的结构见图）
三、材料
（一）7~11日龄鸡胚
（二）孵卵箱
（三）检卵灯、开卵钻和卵盘 （四）其它
四、接种技术
（一）活胚检查
1.血管：活胚可见清晰的血管，有时可见血管搏 动，死胚血管模糊成淤血带或淤血块。 2.胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其在转动 胚胎时，死胚见不到任何胎动，胚胎发红像出血样， 有的呈现黑块。 3.血管网是否丰满：发育好的鸡胚可见密布丰满 的血管网，也就是绒毛尿囊膜，死胚则见不到这一 现象。
鸡胚培养
鸡胚培养前言：鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，用牛痘病毒（vaccinia virus）和鸡新城疫病毒（Newcastle-disease virus）接种鸡胚。
牛痘病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长，经培养后，产生肉眼可见的白色痘疱样病变，似小结节或白色小片云翳状。
鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。
基本原理鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。
鸡胚培养的技术比组织培养容易成功，也比接种动物的动物来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，同时它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，是常用的一种培养动物病毒的方法。
器材牛痘病毒液，鸡新城疫病毒液；白壳受精卵（自产出后不超过10天，以5天以内的卵为最好）；孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加 1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。
操作步骤1．准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45—60%），孵育三日后，鸡卵每日翻动1—2次。
孵至第4日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。
活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。
生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
2．接种1）绒毛尿囊膜接种（a）将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。
（b）用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5—6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。
鸡胚培养和细胞培养
鸡胚培养和细胞培养第⼀节鸡胚接种⼀、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多⼈类和动物病毒的⽣长增殖，是常⽤的病毒分离培养⽅法之⼀（⾐原体、⽴克次体的分离亦⽤鸡胚）。
⽬前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应⽤较多。
可⽤于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再⽤鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是⼀种不可缺少的培养⼿段。
鸡胚培养的优点是，来源充⾜，价格低廉，操作简单，⽆需特殊设备或条件，易感病毒谱较⼴，对接种的病毒不产⽣抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需⽤第⼆试验系统来测定病毒存在与否；⾮ SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚⾄还可能带有鸡⽩痢沙门⽒菌、霉形体、鸡⽩⾎病等病毒。
因此，⽤鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使⽤⾮免疫蛋来孵鸡胚，最好⽤ SPF 鸡胚。
⼀般说来，孵育⾄ 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的⽣长，因为此阶段鸡胚发育⽇趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，⾻胳不健全，还未长出⽻⽑，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获⾼滴度的病毒，14 天以后，胚胎⾻骼硬化，胚⽪表⾯⽻⽑渐⽣，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）⼀定要注意到这⼀点。
孵育⾄ 21 天左右，⽺⽔和尿囊液已全部被胚胎吸收，⼀部分卵黄陷⼊胚胎腹部，另⼀部分则仍留在体外，胚胎已发育成⼩鸡，破壳⽽出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为⽯灰质的卵壳，上有⽓孔供⽓体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使⽓体分⼦与胚胎内的液体分⼦在内外进⾏交换，因此在孵育时需要有⼀定的湿度和空⽓。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱⽔、引起鸡胚死亡。
⽓流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
鸡胚小肠上皮细胞的体外分离培养和鉴定
Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ａ ｎ ｉ ｍ ａ ｌ Ｎｕ ｔ ｒ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ６ － ２ ６ ７ ｘ ． ２ ０ １ ５ ． ０ ７ ． ０ ２ ０
１ ５ ｎ ｇ ／ ｍＬ 表 皮生 长 因子 （ Ｅ Ｇ Ｆ） 为Ｐ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ产 品 ； Ｔ ｒ ｉ ｚ ｏ ｌ 为 Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ公 司 产 品 ； 反 转 录 试 剂 盒 为
Ｔ ａ Ｋ ａ Ｒ ａ产 品 ； 荧光
导人 Ｓ Ｖ ４ ０ Ｔ致 癌基 因建立 永 生 化 鸡 小肠 上 皮 细 胞
系奠定 基 础 。
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 试 验 材 料
及 转运 吸收 小 肽方 面 产 生 重 要 的作 用 。 国外 研 究 小 肠 上皮 细 胞 生 物 学 功 能 以 及 肠 道 免 疫 机 理 的 较 多 。 目前 ， 国外通过转 染猴空泡 病毒 ４ ０ （ Ｓ Ｖ４ ０ ） 也 建 立 了一 些 小 肠 上 皮 细 胞 系 ［ ５ － ８ ］ ， 但 不
理、 鸡 肠道 营养 物 质 转运 吸 收 与免 疫机 理提 供 模 型 。 本 试验 采 用 组 织块 培 养 法 来分 离培 养 鸡 小 肠 上 皮 细胞 。运 用刮 除 法 、 酶 消化 法 、 有 限稀 释 法 纯化 鸡 小 肠 上 皮 细 胞 。利 用噻 唑 蓝 （ ＭＴ Ｔ） 法 来鉴 定鸡 小肠上 皮 细 胞 生 长情 况 。通 过 实时 荧光 定 量 Ｐ Ｃ Ｒ（ Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ） 检 测 鸡 小 肠 上 皮 细胞 特 异
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。
2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。
3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。
4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。
5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。
6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。
7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。
8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。
9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。
10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。
11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。
12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。
13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。
14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。
15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。
鸡胚的实验报告
一、实验目的1. 了解鸡胚培养的基本原理和操作步骤；2. 掌握鸡胚培养过程中细胞的分离、培养和传代技术；3. 观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。
二、实验原理鸡胚培养是一种在体外培养鸡胚细胞的方法，主要用于研究细胞生物学、分子生物学和发育生物学等领域。
通过将鸡胚组织中的细胞分离出来，并在特定的培养条件下进行培养，可以观察到细胞的生长、形态和增殖情况，从而研究细胞的生物学特性。
三、实验材料1. 新鲜鸡蛋：选用新鲜鸡蛋，确保蛋壳完整，无破损；2. 实验器材：解剖刀、剪刀、镊子、解剖盘、培养皿、移液枪、培养箱、显微镜等；3. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶等；4. 其他：消毒剂、无菌操作台、无菌棉签等。
四、实验步骤1. 鸡胚的获取：将新鲜鸡蛋在37℃温水中浸泡10分钟，使蛋壳软化，然后用解剖刀在鸡蛋的一端切开，取出鸡胚。
2. 鸡胚的解剖：将鸡胚放在解剖盘上，用剪刀剪开卵黄囊，取出卵黄囊膜，用镊子取出鸡胚成纤维细胞。
3. 细胞的分离：将鸡胚成纤维细胞放入装有DMEM培养基的培养皿中，用胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆后加入胎牛血清终止消化，然后用移液枪吹打细胞，使细胞分散。
4. 细胞的接种：将分散的细胞接种到培养皿中，放入培养箱中培养。
5. 细胞的观察：在显微镜下观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。
6. 细胞的传代：待细胞生长到一定密度后，用胰蛋白酶消化细胞，将细胞分离成单个细胞，再进行接种。
五、实验结果1. 鸡胚成纤维细胞在培养过程中，呈扁平梭形，细胞质丰富，细胞核明显。
2. 随着培养时间的延长，细胞逐渐增多，细胞密度逐渐增大。
3. 在显微镜下观察，细胞形态规则，生长旺盛。
4. 经过传代培养，细胞仍保持良好的生长状态。
六、实验讨论1. 鸡胚培养过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
2. 培养基的质量对细胞的生长和增殖有重要影响，需选用优质培养基。
3. 细胞传代次数过多，可能导致细胞生长缓慢、形态发生变化，影响实验结果。
鸡胚培养和细胞培养
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非SPF鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用SPF鸡胚。
一般说来，孵育至8-14天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
鸡胚的钝头（俗称“大头”），是气室，其功能是呼吸和调节胚内压力。
鸡胚培养
病毒的鸡胚培养, 提纯, 鉴定1. 鸡胚的选择和孵化选SPF鸡胚, 入孵前0.1%新洁尔灭消毒表面. 在温度37.5-38℃, 湿度40%-57%通风良好的条件下孵育. 孵育过程中每天翻蛋两次, 要求蛋的角度要达到前俯后仰45°.在孵育的第五天照蛋, 去除无精蛋和死胚蛋, 第九日起每天照蛋2次, 去除死胚蛋.2. 病毒的接种病毒的浓度, 由病毒原始浓度, 将其稀释至效价为1:1280备用, 接种鸡胚时将其稀释1000倍,接种: 采用第9-10日龄的鸡胚, 进行尿囊腔接种, 接种量0.1ml,接种步骤: a 照蛋标出气室和大血管位置b 气室底边胚胎附近无大血管处标记注射位置c 气室向上放置于卵架上, 碘酒酒精消毒蛋壳d 注射点和气室顶分别队蛋壳打洞,e 1ml针头以30度夹角刺入3-5mm, 注射病毒液f 石蜡封口孵育: 气室向上, 孵箱温度36℃,湿度40%-57%, 定时换气, 捡出24小时内死亡的鸡胚, 培养48小时, 搜集24小时以后死亡的鸡胚,收获: 48小时后, 4℃冰箱过夜/-20℃ 1小时,避免收获时流血.气室端卵壳表面消毒, 镊子击破卵壳, 除去壳膜, 撕破绒毛尿囊膜, 吸出尿囊液和羊水, 无菌容器4℃保存待用. 同时可以取出鸡胚, 观察有无出血, 卷曲等病毒的提纯、分装及保存尿囊液经低速离心（2800r/min，800g）30min，弃去沉渣，含NDV的上清液再经低温超速离心（4℃，30000r/min，90000g）60min沉淀病毒。
沉淀物用pH7.2、0.01mol/L PBS重悬，并用0.5%新鲜鸡红细胞悬液测定NDV的血凝单位（Hu），然后稀释成1:1280Hu/ml，分装于安瓿，置-20℃保存备用，临用前解冻病毒的鉴定:(1)血凝实验(HA):试管编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10稀释倍数1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 对照生理盐水(ml) 0.40 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 病毒液(ml) 0.10 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 生理盐水(ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25得最好稀释倍数, 称为病毒得血凝滴度.(2)毒力测定将BSR T7/5细胞培养于九孔板, 对数生长期, 24小时前换培养液, 将所得到的病毒液倍比稀释(按上表), 分别感染BSR T7/5细胞培养皿,(小时后)观察细胞病变情况,计数噬菌斑, 将其与病毒浓度做图, 取呈线性关系的浓度段, 判断病毒的侵染力所需材料:1.SPF鸡蛋2.1%鸡血红细胞悬液3.0.1%新洁尔灭溶液4.病毒原液5.石蜡6.照蛋器7.卵架8.1ml注射器9.孵箱10.4℃冰箱11.无菌容器12.碘酒, 酒精, 镊子, 剪刀, 洗管, (打孔器)附:1.病毒血球凝集单位: 能使鸡红细胞凝集的最高稀释倍数的病毒液0.25ml称为一个病毒血球凝集单位2.病毒的效价: 每单位体积中侵染单位的数量, 如寄生某寄主所需最小量病毒是0.1ml稀释至1/106的病毒悬液, 其效价为:1/(10-1X10-6)= 107.3.噬菌斑形成单位(pfu): 如0.1ml病毒悬液再单层细胞上形成20个蚀斑, 则每毫升病毒悬液的pfu是(1/0.1)X20=200pfu/ml4.鸡胚的判断: 正常胚胎: 可见有清晰得血管小团, 有鸡胚迹象, 可见有胚胎主动活动无精卵, 经过4天孵育后未见有胚胎迹象,仅见模糊卵黄影死胚或濒死卵: 胚胎运动呆滞或不动, 血管昏暗, 折断或飘落。
病毒的鸡胚培养法
（一）实验目的 （二）实验原理 （三）实验器材 （四）实验方法 （五）实验作业
（一）实验目的
1.了解鸡胚培养有哪几种常用的接种方法。 2.掌握鸡胚尿囊腔接种培养鸡新城疫病毒的操作技术
。
（ 实二验）室培实养验病原毒常理使用动物接种和鸡胚培养两种方
法，而鸡胚培养更为常见。一般而言，禽病毒病大 部分可经鸡胚分离病毒，其他动物病如犬瘟热也可 经鸡胚分离病毒。
（五）实验作业
1.用鸡胚培养病毒，在选用鸡胚时应注意什么问题？ 2.绒毛尿囊腔内接种在培养和收毒过程中应注意哪些
问题？
鸡胚接种技术是养禽业中一种相对新的疫苗接种方法 。这种方法就是对孵化后期的鸡胚接种某些活的病毒 疫苗。这些病毒疫苗不会对孵化率产生不利的影响， 通过这种方式接种疫苗后孵出的雏鸡具有免疫保护力 。
（三）实验器材
1.鸡胚：要选择SPF鸡胚或低母源抗体的鸡胚。从 实践看，法氏囊炎病毒对抗体相当敏感，所以要 用无母源抗体的鸡胚；而新城疫病毒、禽流感病 毒等可抵御母源抗体的作用而得以繁殖致死鸡胚 。
法氏囊病毒的分离
取疑似感染病毒的法氏囊，称重，按1:5（w/v）加入 生理盐水，研磨，-20℃，反复冻融2次；每次冷冻时 间以研磨物结冰为准；
将冻融物转入离心管中，3000转/分，离心5分钟，将 上清取出，使用无菌滤器过滤
2.接种
鸡胚接种的方法有几种：
绒毛尿囊腔内接种
★★
绒毛尿囊膜接种
羊膜腔接种
1.鸡胚胎2.羊膜腔3.绒毛尿囊膜4.羊膜
卵黄囊内接种
选择6-8日龄的鸡胚 ，照蛋检查，划出气 室和胎位，并以气室 向上竖立在蛋托上， 气室端的蛋壳经消毒 后以打孔器钻一小孔 ，将注射针头刺过小 孔，沿着卵的纵轴刺 入约3cm，然后注入 0.2ml的病毒接种液 ，用氧化锌胶布及石 蜡封口后放回孵化器 中培养。
鸡卵的人工孵育及鸡胚的壳外培养
• 第二次检蛋目的是检出中途停止发育的胚 胎。正常发育的蛋此时除气室外，卵蛋布 满血管，呈均匀黄色。鸡蛋尖端也有血管 明显分布。 • 第三次检蛋目的是检出不正常发育的蛋， 同时为孵化出壳做准备。
实验技术：
一、实验材料的准备 1、取新鲜的受精鸡蛋，置于温度为37-39℃，相对 湿度为60-70%的孵育人工箱。 2、取孵育3天的鸡蛋，用浸有75%酒精棉花擦拭鸡 蛋外壳，晾干备用。 3、取消毒过的1.5×9.5cm培养皿及2.5×12cm培 养皿（带盖）数付，在小的培养皿中加10ml的 Haward氏生理盐水。为防污染，加入100单位/ml 的庆大霉素和制霉菌素。
• 2. 受精蛋的选择和保存： • 为保证较高的孵化率，必须对蛋进行选 择。最好选用刚产出一周以内的蛋。蛋的 形态要正常。过圆、过长或畸形蛋都会影 响孵化率。蛋壳的厚薄要均匀一致。壳上 具凹凸不平条纹的蛋，也不宜使用。用照 蛋灯检查时，要选气室小，无裂纹，卵白 浓稠的蛋。卵黄浮起，卵黄破散，蛋内有 黑点或血块的蛋均不能使用。
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器 官 原 基
鸡 胚
—
鸡的胚外结构
• 3. 孵育前蛋的消毒及升温处理： • 入孵前将蛋从10℃冰箱中取出，先放在 20多度的室温下平衡温度3-4小时，使之逐 渐升温，再用温水（30-40℃）浸洗干净蛋 壳上的污物。便可按孵蛋框大小或实验要 求的数量立即放入孵蛋箱中。每个蛋壳上 要用铅笔注明日期，作好记录。
• 4. 孵育的日常管理： • 孵育管理是保证鸡胚正常发育的外界条件中的 重要环节。外界条件主要指孵育温度、湿度、氧 气的供应与转蛋等。氧气的供应，应该随孵育时 间而增加，通气窗也应随孵育的进程而开大。 • （1）转蛋：鸡蛋孵育时，胚胎浮于卵黄上面， 如果不随时转蛋，胚胎易与蛋壳粘连，影响出壳。 为了防止粘连，每天需转蛋四次。转蛋角度45-50 度。转蛋还可使蛋受热均匀，起调节局部温度的 作用。
鸡胚培养法
鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。
鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。
根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。
本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。
鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材SPF鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。
二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。
特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。
将鸡卵置于380C---390C孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。
受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。
若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。
也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。
如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。
2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。
死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。
3绒毛尿囊膜发育界限：生活良好的胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜，与胚胎的另一面形成良好的界限须将上面三个方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张，或折断沉落，绒毛尿囊界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。
鸡胚培养方法
4. 注入病毒材料
• 用1mL注射器抽取接种物； • 针头垂直刺入注射部位1-1.2cm即达尿囊腔内； • 注入待接种的新城疫病毒：接种量为0.1~0.2mL。
5. 封孔
• 用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔。
6. 孵育与观察
• 气室朝上于37℃温箱中孵育； • 以后每天检卵1~2次。 • 弃去24h内的死亡鸡胚： – 机械损伤、细菌或霉菌污染等引起。
• 组织分化程度低； • 细胞代谢旺盛； • 适于许多病毒的生长增殖， 尤其是禽类病毒。
② 鸡胚培养的优点： • 来源充足；
• • • • 价格低廉； 操作简单，无需特殊设备； 易感病毒谱较广； 对接种的病毒不产生抗体。
③ 鸡胚培养的缺点： • 非SPF鸡胚，可能含有某些家
禽病毒的母源抗体，甚至还可 能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形 体、鸡白血病等病毒。
④ 鸡胚接种的方法：
• 尿囊腔接种： • 绒毛尿囊膜接种 • 卵黄囊接种 • 羊膜腔接种 • 静脉接种
④ 鸡胚接种的方法：
• 尿囊腔接种 • 绒毛尿囊膜接种： • 卵黄囊接种 • 羊膜腔接种 • 静脉接种
④ 鸡胚接种的方法：
• 尿囊腔接种 • 绒毛尿囊膜接种 • 卵黄囊接种： • 羊膜腔接种 • 静脉接种
7. 病毒的收获与鸡胚的观察
① 收集24h后死亡鸡胚，置4℃冰箱过夜，以免收获时流血; ② 取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面； ③ 用镊子击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜； ④ 以眼科镊镊住绒毛尿囊膜，用吸管吸取 尿囊液，置无菌容器中保存备用。 一般能尿囊液6-10mL。 ⑤ 取出鸡胚胎，于平皿内观察胚胎有无病 理变化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。
四、实验内容
以尿囊腔接种为例，介绍新城疫病毒的接种方法： 1. 照胚：
鸡胚小肠上皮细胞体外培养与纯化
参考文献
[1] ZHANG H H，LIDF，LIU L I，et al. Cellular compo sition and differentiation signaling in chicken small intsstinal epithelium*]. Animals (Easel) , 2019,9(11) ： 870.
7 • O I X 、翌 ) 囹 同 W
图7小肠上皮细胞生长曲线
8讨论
在鸡胚小肠上皮细胞的培养研究中，细胞来源 多采用15胚龄〜20胚龄的鸡胚[8-13+，也有采用1月 龄鸡的报道「⑷；细胞来源选择不同的原因可能是各 研究采用的细胞分离方法不同。本研究选用16胚 龄的鸡胚作为细胞来源，该阶段鸡胚发育成型，小
在超净工作台内，用体积分数为75%的乙醇擦 拭种鸡蛋外壳，破碎蛋壳后，取出鸡胚％将鸡胚的 小肠取出，放入无菌平皿内；用Hanks平衡盐溶液 （含100 U/mL青霉素和0. 1 mg/mL链霉素）反复 洗涤小肠组织，直至洗涤液体清亮％ 1.3.2 上皮细胞体外分离
剥离小肠的肠系膜，用灭菌的剪刀将小肠组织 剪碎，呈匀浆状，然后用移液枪转入离心管中，再向 离心管中加入含胎牛血清的DMEM细胞培养液 [45 mL DMEM细胞培养液+ 5 mL胎牛血清+ 500 “L青霉素-链霉素混合溶液（100X ）5 mL,室 温静置3 min。弃上清液，将2 mL的1 mg/mL V 型胶原酶加入到离心管中，37 =水浴消化40 min （期间，每5〜10 min轻轻吹打1次）；1 000 r/min 离心10 min,弃上清液％再向离心管中加入DMEM 细胞培养液5 mL,静置5 min后，利用移液枪小心 吸出悬浮细胞的上层液，以1 200 r/min离心5 min，
鸡胚原壳体外培养研究
鸡胚原壳体外培养研究郝志明;马文芝;祁茂铜;闵亨辉【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2005(033)009【摘要】以种蛋原壳为鸡胚体外培养的孵化蛋壳,就开孔位置、开孔大小以及鸡胚胚龄对鸡胚体外培养效果的影响进行了研究.结果表明:(1)小头侧面开孔明显优于小头顶端开孔(P＜0.01),小头侧面开孔的已孵化3 d鸡胚的孵化率为80.0 %,而小头顶端开孔的则只有60.0 %;(2)随着开孔直径的增加,鸡胚孵化率呈下降趋势,开孔直径为0.5,1.0和1.5 cm时的孵化率分别为80.0 %,30.0 %和16.7 %;(3)在小头侧面开孔且孔直径为0.5 cm时,X期鸡胚和已孵化3 d鸡胚的体外培养孵化率差异达极显著水平(P＜0.01),已孵化3 d鸡胚的体外培养孵化率为80.0 %,X期鸡胚的孵化率则为0.【总页数】4页(P35-38)【作者】郝志明;马文芝;祁茂铜;闵亨辉【作者单位】天津农学院,动物科学系,天津,300384;天津农学院,动物科学系,天津,300384;天津农学院,动物科学系,天津,300384;天津农学院,动物科学系,天津,300384【正文语种】中文【中图分类】S831.3+2【相关文献】1.鸡胚盲肠上皮细胞体外培养纯化方法的研究 [J], 古少鹏;王敏霞;赵素芬;郑明学2.鸡胚大头开孔原壳体外培养方法的建立 [J], 郝志明;马文芝;宋太富;刘学敏;高旺龙;张洋3.空气对X期鸡胚原壳发育的影响 [J], 郝志明;马文芝;祁茂铜;闵亨辉4.鸡胚大头开孔加抽泵清原壳体外培养的研究 [J], 高旺龙;郝志明5.柔嫩艾美耳球虫在鸡胚盲肠上皮细胞中体外培养营养条件的研究 [J], 古少鹏;侯金环;陈赵英;李宝钧;郑明学因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鸡卵的人工孵育及鸡胚的壳外培养ppt课件
• 2 Dpf鸡胚
气室、卵壳膜、胚盘等
• 7～8 Dpf鸡胚
鸡蛋的结构
1蛋壳；2气室；3内壳膜；4外壳膜；5系带层蛋白；6胚盘； 7卵黄；8卵黄膜；9浓蛋白；10稀蛋白；11脐带；12潘氏核； 13卵黄心颈部；14卵周隙；15卵黄心；16白卵黄层；17黄卵黄层
卵本身是一个大的多卵黄的细胞，有限的细胞质区在 胚盘，其中包括细胞核。卵裂只在胚盘上进行，当鸡蛋产 出时，胚胎发育已处于原肠期，随着温度的降低，发育停 止。壳外培养用玻璃皿培养，器材简单，便于观察。
一、鸡卵的人工孵育
• 1. 孵蛋箱结构及使用方法： • 电热孵蛋箱：加热的电热丝，利用金属热
胀冷缩的原理控制电路的通断，以达到调 节温度的目的。箱内设有蛋架、出雏盘、 温度计、湿度计、盛水盘和照明灯。
3、将盛有鸡胚的培养皿放入大培养皿内，在大培 养皿内加入一层薄薄的蒸馏水，以保持湿度。盖上 大培养皿的盖子，置于37－39℃恒温箱中培养。 如果有二氧化碳培养箱则更好（二氧化碳浓度调到 5%左右），鸡胚存活率会更高，存活时间更长。 实验观察：
从培养日起，便可逐日观察，注意观察并记录 鸡胚的脑、眼睛、血管、肢芽。
未 孵 化 鸡 胚
3Dpf —
鸡 胚
器 官 原 基
鸡的胚外结构
二、破壳与培养 1、将鸡蛋置于（蛋座：小培养皿内放一些棉花） 上，先用小挫刀或刀片沿蛋的横轴挫出和割出4/5 的小裂缝，在无裂缝出沿蛋的纵轴贴上一块宽12cm，长3-4cm的胶布，在其对面，裂缝的两旁各 沿纵轴贴上一块宽1-2cm，长6-7cm的胶布，将无 裂缝处朝上，静置数分钟，待胚盘转向上方。 2、用大拇指按住无裂缝处，两手的食指和中指各 夹一边的一段胶布，平移至盛有生理盐水的培养 皿上方，轻轻把胶布往两旁一拉，蛋的内容即可 完整地流入培养皿中。
鸡胚胎换蛋壳培养
鸡胚胎换蛋壳培养
张文昌
【期刊名称】《中国家禽》
【年(卷),期】1991()6
【摘要】鸡的卵子一般自卵巢排出15分钟以内在卵管漏斗部与精子结合,移入膨大部形成浓、稀蛋白后,到达峡部形成内外两层壳膜。
在排卵后约4.5小时,受精卵在峡部开始卵裂,离开峡部前可达4—8细胞期。
然后进入子宫部,水分增加,蛋壳形成。
此时卵裂很活跃,受精卵在进入子宫部4小时内细胞数增至256个。
【总页数】2页(P31-32)
【关键词】鸡;胚胎;换蛋壳;培养
【作者】张文昌
【作者单位】内蒙哲里木畜牧学院畜牧系
【正文语种】中文
【中图分类】S831.2
【相关文献】
1.鸡胚胎代用蛋壳及异体胚盘移植孵化的研究 [J], 李碧春;赵东伟;陈国宏;王克华;钱菊汾
2.用异源蛋白和蛋壳体外培养鹌鹑胚胎的研究 [J], 张文昌;李玉芳;庄益芬
3.代用蛋壳培养体系对鸡胚骨组织中碱性磷酸酶活性的影响 [J], 李赞东;樱井富士郎;李海昌;黄劲松;李相芝;张曼夫;齐顺章
4.利用鸡胚胎或鸡胚胎加适量鸡胚绒毛尿囊膜生产鸡传染性喉气管炎活… [J], 齐铁英;张亚华
5.鸭胚胎代用蛋壳培养的研究 [J], 张文昌;徐国正;庄益芬;王垚锟
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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4、准备工作：
（1）取新鲜的受精鸡蛋，置于温度为37-39℃，相对湿度
为60-70%的孵育箱中孵育。 （2）取孵育3天（72小时）的鸡蛋，用浸有75%酒精的棉 花擦拭鸡蛋外壳，晾干备用。 （3）取消毒过的1.5×9.5cm培养皿及2.5×12cm培养皿 （带盖）数付，在小的培养皿内加10ml的Haward氏生理盐 水。为了防止污染，也可同时加入100单位/ml的庆大霉素
• 通过壳外培养，可以直接观察鸡胚发育过程，观察胚胎与
胎膜的关系、胚胎的行为及循环模式等。 • 另一方面，易于进行各种鸡胚的外科手术，如切除肢芽， 破坏神经管及尿囊绒毛膜移植等。对于发育的行为学、畸 胎学、生理学研究，也是一种良好方法。 • 近年也有学者将鸡胚壳外培养方法应用于肿瘤诱导的血管 形成，中枢神经系统的培养，哺乳类早期胚胎培养、尿囊
• 第十三天：胎儿开始大量吞食蛋白 羊水（将羊膜道是输送蛋白至浆羊 膜腔的细长通道。粘稠的蛋白由于 尿囊的包围和收缩，像挤牙膏一样 不断进入将羊膜腔，与羊水混合， 这种含有蛋白的羊水，称为蛋白羊 水）。 • 第十四天：尿囊血管充分发育并紧 贴壳膜，通过内外壳膜、蛋壳排出 二氧化碳和水蒸气，吸进氧气；尿 囊液增加，主要集中于羊膜周围， 新陈代谢旺盛，胎儿增重迅速。
10日龄鸡胚的结构图
胚龄解剖图
• 第一天： 经过24小时的孵育，
胚盘变大变厚，明区和暗区同时 增大，在卵黄上可见到椭圆形的 盾称为胚盾，是未来的胚区。
• 第二天：胚盘已扩展一倍并被红
色的血管围成樱桃形或椭圆形， 这些血管即胚胎的卵黄囊循环的 边缘血管----缘窦。胚盘中心有 一变曲的透明体----胚胎，透明 体中可见一搏动着的小红点，即 原始心脏。
• 第十七天：蛋白基本上向羊膜腔输 送完毕，胎儿仍被蛋白的羊水包围。 胎儿由于从蛋白和卵黄中摄取了全 价蛋白体重增加，外形和羽毛的发 育，与出壳的雏鸡差异不大。从孵 化的第12天至17天是尿囊发育的第 三阶段，尿囊的合拢导致胎儿可以 完全吞食蛋白。
• 第十八天： 残存的蛋白羊水被吞 食完毕，尿囊液减少，气室增大， 尿囊增厚并收缩。 由于蛋白利用 较好，胎儿的羽毛像缎子一样覆盖 在鸡体表面。此后胎儿的营养来源 只有一种----卵黄。
• 第十五天：尿囊所包围的长迅速，颈部羽毛 长度达12毫米，身体各部羽毛生 长整齐，胫、趾鳞片开始形成。
• 第十六天：尿囊所包围的蛋白进一 小减少，尿囊液颜色变混，有少量 尿酸盐积由于吞食白、胚胎代谢产 物增多，排泄的尿酸盐贮存在尿囊 中。 胎儿体重继续增大，羽毛加 长变丰，颈部羽毛长度达15毫米。
绒毛膜壁对钙离子的吸收和转运，以及Ca2+对鸡胚各器官
发育的影响等研究。
鸡胚模式图解
1、卵壳：上有细孔，进行气体交换。
2、卵壳膜：使气体分子和液体分子在内外两方面进 行气体交换。
3、气室：呼吸和调节压力。
4、绒毛尿囊膜：起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交 换是在膜的血管内通过卵壳空而进行的。
• 5、尿囊腔：胚胎的排泄器官，内含尿囊液，初为透 明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中尿酸盐 迅速增加，胚胎发育到12-13天后尿囊液开始变得混 浊。
• 第十九天：气室继续扩大，尿囊液与
羊水继续减少，尿囊血管鲜红，表明
尿囊仍司呼吸器官的职能。孵化第19 天在气室中可见展翅，少数雏鸡的喙
已穿破内壳膜而达于气室。可听到雏
鸡的鸣叫声。 部分卵黄已收入腹腔， 一旦雏鸡的喙的喙进入气入气室，即 开始肺的呼吸，此时雏鸡尿囊和肺的 呼吸并存，并逐渐由前者过渡到后者。 呼吸量大，代谢热产量大增，通常在 这一天“落盘”。 • 第二十天：剩余部分卵黄收入腹腔，
迅速发育，已经覆盖羊膜与部分
卵黄，但较卵黄囊血管细；卵黄 囊血管分布在卵黄面积达2/3以
上。胚体已初具翼和腿的外型，
已眼睛黑色素更多。
• 第七天：卵黄体积达到最大程度， 以后将逐渐缩小，卵黄囊虽然也 增大，仍有1/4卵黄未被覆盖；尿 囊比第6天增长约两倍；胎儿的外 形已具备禽类的特点，头和眼所 占的比例相当大，前后肢分化明 显。
• 第十天：尿囊在胚胎的背面迅 速向下端发展，将蛋白逐渐包 围起来。当孵化的第10天结束 时，皮肤的羽毛原基遍及全身， 翼和腿部羽毛的尖端已微露。 胎儿的位置靠近气室。
• 第十一天：由于尿囊完全包围了 卵黄、胚体和蛋白、尿囊血管已 在小端吻合，从第8天到第11天 是尿囊发育的第二阶段。尿囊的 合拢与否意义重大，只有合拢完 善，才能保证胎儿吞食蛋白。 • 第十二天：图中尿囊在蛋白端尚 有一小孔未合拢，对于12天的胚 胎发育似乎嫌慢。由于个体差异， 这种情形并不罕见，鸡胚短羽已 遍与爪已角质化。蛋白呈淡黄褐 色，粘稠，浆羊膜道形成。
• 第八天： 从第4天到第8天是尿囊 发育的第一阶段，胚胎由卵黄囊 呼吸转化为尿囊呼吸。胎儿外形 发育趋于完善，胸腹腔尚未封闭， 心、肝、胃都暴露于体腔外。羊 水与尿囊液迅速增多。
• 第九天：尿囊沿内膜迅速向下 端发展，包围了胎儿和卵黄， 并包围部分蛋白。胎儿皮肤透 明度下降，皮肤表面出现排列 整齐的小点，即羽毛原基。胸 腹腔已封闭，心、肝、胃等器 官已包入体腔。
和制霉菌素。
三、实验步骤
1、将鸡蛋置于蛋座（小培养皿内放一些棉花）上，先用小挫刀或 刀片沿蛋的横轴挫出和割出五分之四的小裂缝，在无裂缝处沿 蛋的纵轴贴上一块宽1-2cm，长3-4cm的胶布，在其对面，裂缝 的两旁各沿纵轴贴上一块宽1-2cm，长6-7cm的胶布（胶布的一 端与裂缝边缘齐，另一端留下一段），将无裂缝处朝上，静置 数分钟，待胚盘转向上方。 2、用大姆指按住无裂缝处，两手的食指和中指各夹一边的一段胶 布，平移至盛有生理盐水的培养皿上方，轻轻把胶布往两旁一 拉，蛋的内容物即可完整地流入培养皿中。 3、将盛有鸡胚的培养皿放入大培养皿内，在大培养皿内加入一层 薄薄的蒸馏水，以保持湿度。盖上大培养皿的盖子，置于3739℃恒温箱中培养。如果有二氧化碳培养箱则更好（二氧化碳 浓度调到5%左右），鸡胚存活率会更高，存活时间更长。
• 第三天：由孵化的第一天开始，蛋白
中的水分通过半透性卵黄膜向卵黄中
移动，使卵黄中水分含量大增，新进 来的水分并不与卵黄液全融合而主要
存在于胚区。胚胎与伸展的卵黄囊血
管形似蚊子，白壳种蛋通过照视可见 蚊状的血管区，俗称“蚊虫珠”。 • 第四天： 卵黄体积继续增大，颜色 变淡，卵黄囊血管包围卵黄近1/3，
雏鸡蓄积力量，准备出壳。
• 第二十一天： 蛋壳被啄破，雏鸡可直
接由外界呼吸，此时尿囊膜开始枯萎， 但仍有血管在工作。卵黄大部分收入 腹腔，只有少部分露在腹外。
二、实验材料及准备工作
1、实验材料： 受精鸡蛋。 2、实验仪器： 恒温箱、单面刀片、1.5×9.5cm培养皿、2.5×12cm小 培养皿、胶布、棉花、剪刀。 3、实验药品： 75%酒精、庆大霉素、制霉菌素、蒸馏水 Haward Ringer氏液： NaCl 7.3g CaCl(2H2O)2 0.17g KCl 0.37g 蒸馏水 1000ml
5. 在培养过程中，若发现有卵黄流出的鸡胚，或发生污染的鸡胚， 将其取出弃之。
6. 在培养过程中注意给大培养皿内添蒸馏水，小培养皿中添加消 毒过的生理盐水，以免水份蒸发影响湿度。
作 业
• 1. 从培养日起，便可逐日观察。注意观察并记录鸡胚
的脑、眼睛、血管、肢芽、啄、胚胎外膜（包括羊膜、 浆膜和尿囊）、羽毛等的形成和发育，血液循环方式， 鸡胚运动等，绘制三个不同鸡胚发育时期图。 • 2. 鸡胚若不能粗略运动，血液停止流动，即为死亡， 记录死亡时间。
实验五 鸡胚的壳外培养
一、实验目的及意义
• 鸡胚作为生物学的实验材料，其历史已经相当悠久。鸡蛋 取材方便，孵育条件简单，且一年四季都有新鲜材料可取，
是胚胎学、发育生物学教学、科研的良好材料。
• 近代，鸡胚已被大量地用于发育的研究。但鸡胚在壳内发 育，观察、实验又有其不便之处，鸡胚的壳外培养可以克 服这些困难。
由于卵黄液化膨胀的压力，使卵黄囊
血管紧贴于内壳膜，可与外界进行气 体交换。尿囊是一个很小的水泡，眼
睛开始沉积黑色素。
• 第五天：胚胎被包围在一个透明
的水泡（羊膜）中，羊膜内充满 羊水，胚体弯曲，眼睛黑色素大
量沉积。卵黄囊已包围1/2的卵
黄，肉眼已可见到尿囊，直径6 毫米左右。 • 第六天：尿囊增长迅速，一天之 内增长了约4倍，尿囊血管系统
四、注意事项
1. 生理盐水最好先置于温箱中，使其温度与鸡胚孵育的温度相同， 有利于鸡胚的存活。 2. 每次观察和实验时间不宜太长，亦不能使温度下降过多，并要 防止污染。 3. 经孵育3天的鸡胚，卵黄囊已经开始液化，破壳时需注意，不 能用力过大，否则极易损伤卵黄囊。卵黄囊一旦受损，则无法继 续存活。 4. 实验时若卵黄流出鸡胚，弃之不用，在培养皿中若胚胎朝下， 也不能存活。