蛋白质印迹技术及实验中常见问题分析
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质印迹法实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质印迹法的基本原理和操作步骤。
2. 学习如何利用蛋白质印迹法检测目标蛋白的表达水平。
3. 掌握蛋白质印迹法的实验操作技巧，为后续相关实验奠定基础。
二、实验原理蛋白质印迹法（Western Blot）是一种常用的蛋白质检测技术，通过特异性抗体与待测蛋白结合，实现对目标蛋白的高灵敏度和高特异性检测。
实验原理如下：1. 蛋白质提取：从组织、细胞或体液中提取总蛋白质，避免蛋白质的降解和失活。
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上。
4. 免疫反应：用特异性抗体与转移至固相载体上的目标蛋白结合，然后与酶或同位素标记的第二抗体发生反应。
5. 显色或放射自显影：通过底物显色或放射自显影等手段，实现对目标蛋白的检测和定量。
三、实验材料1. 细胞株：大鼠原代脊髓星形胶质细胞2. 主要试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清、裂解液、PBS、NaCl、SDS、聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜、PVDF膜、特异性抗体、酶联第二抗体、底物、显影液等。
3. 仪器：玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、-20低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床等。
四、实验步骤1. 细胞培养：将大鼠原代脊髓星形胶质细胞在DMEM/F12培养基和胎牛血清的条件下培养，直至达到实验所需状态。
2. 蛋白质提取：用裂解液提取细胞总蛋白质，并进行蛋白质浓度测定。
3. SDS-PAGE：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
4. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。
5. 免疫反应：将转膜后的膜与特异性抗体进行孵育，然后用酶联第二抗体进行孵育。
6. 显色：加入底物，观察目标蛋白条带的出现，并通过扫描成像系统进行定量分析。
SDS-PAGE电泳、westernblotting过程中常见问题以及解决方法
SDS－PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE 电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
WB常见问题分析
WB常见问题分析蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB )是很常规的生物学实验，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
嗯，听起来不错，不过真正在实验室里做实验的小伙伴恐怕都遇到过各种实验结果不完美的状况，做了很久的WB，走了很多弯路，但是WB想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。
下面我们列举一些常见问题一个个分析。
1胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
1）二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；2）ECL底物中H2O2不稳定，失活；3） ECL底物没覆盖到相应位置；4）一抗选择不当；5）二抗失活。
2背景高咋回事？答：可能的原因有：•膜没有完全均匀湿透,建议使用100% methanol浸透膜；•洗膜不充分，可以增加洗液体积和洗涤次数；•电极不平衡或者加样位置偏斜，可以调整电极和加样；•封闭物用量不足，可以提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜；•封闭物使用不当，比如检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭；•封闭时间不够，一般情况下室温37度封闭1小时以上或者4度封闭过夜；7）抗体非特异性结合，可以降低抗体浓度，减少孵育时间8）一抗稀释度不适宜，可以对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度9）一抗孵育的温度偏高，建议4℃结合过夜10）抗体浓度过高或洗涤不够，建议降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间11）化学显色底物过多，建议按说明书加入适量的显色底物3为啥条带形状不好看？答：可能的原因有：1）胶凝的不均匀或聚合不好，建议灌胶前将溶液充分混匀2）某些样品盐浓度较高，建议除盐或将样品盐浓度调成一致3) 缓冲液陈旧，成分改变,可以重配4) 凝胶下面有气泡,电泳前要先将气泡赶走5）电泳时温度过高，可以降低电流或电压6）样品中含有不溶性颗粒，建议样品充分搅拌混匀4蛋白条带位置（大小）不对咋整？答：可能的原因有：•胶浓度不对，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，可以调整浓度•抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度，延长孵育时间3）酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。
蛋白质免疫印迹技术常见问题分析 (1)
常见问题分析一.无信号一抗和二抗不匹配：二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。
没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白：使用高浓度抗体。
4 °C 延长孵育时间（如过夜）。
封闭剂与一抗或二抗有交叉反应：使用温和的去污剂如吐温-20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶）。
一抗不识别待检物种的蛋白：参照说明书，比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应，设置阳性对照。
蛋白上样量不足：每条泳道蛋白上样量不低于20μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照。
组织中目的蛋白含量低：浓缩使信号最大化。
转膜不充分：使用可逆染色剂如丽春红检测转膜效果，检查转膜操作是否正确。
PVDF 膜需预先浸在甲醇中，然后浸到转移缓冲液中。
洗膜过度：勿过度洗膜。
过度封闭使目标蛋白不能显色：使用0.5% 奶粉或无奶粉代替5% 奶粉的抗体稀释液，或更换封闭剂，减少封闭时间。
一抗失效：使用新鲜抗体，重复使用有效浓度会降低。
二抗受叠氮钠抑制：避免叠氮钠和HRP 标记抗体一起使用。
检测试剂盒过期和底物失活：使用新鲜的底物。
二．背景高未进行非特异性封闭或封闭不充分：延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂。
一抗浓度过高：稀释抗体至合适浓度，以更高稀释度抗体延长孵育时间（耗时长但特异性结合最好）。
二抗与封闭剂非特异性结合或反应：设置二抗对照（不加一抗）。
未结合蛋白质洗涤不充分：增加洗涤次数。
选膜不当产生的高背景：硝酸纤维素膜比PVDF 膜背景低。
膜干燥：在孵育过程中防止膜变干，每一步都要保证膜有充分的反应液，可放入搅拌子不断搅动或轻轻振荡使膜浸在溶液里。
三．多带现象细胞传代次数过多，蛋白表达不同：使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照实验。
体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等：参考文献，使用试剂使样品去磷酸化、去糖基化来证明翻译后的修饰。
蛋白样本降解（蛋白质分子量降低）：在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。
WB实验常见问题与解决方案
一、WB基本原理的理解
Western Blot（WB）原理：
通过电泳区分不同组分，并转移至固相支持物，通过 特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白 质的WESTERN 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固 相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1~5ng （最低可到10~100pg）中等大小的靶蛋白。
含SDS 不含SDS
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗的种属来源： 一般市面上主要的一抗来源是鼠和兔，一抗的选择 应与你现有的二抗相匹配，例如：
如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选 ，
抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）； 如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体或者兔 单抗，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
很好
细胞核转录因子提取 很好
含蛋白酶抑制剂
是
含磷酸酯酶抑制剂
是
主要用途
WB, IP,co-IP
很好 是 是 WB, IP
很好 是 是 WB, IP
很好 是 是 WB, IP, co-IP
很好
很好
是
是
是
是
WB, IP,coIP
WB, ChIP
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
样本中蛋白酶抑制剂的使用
WB
一、WB基本原理的理解
基 本 原 理 示 意 图
红色箭头：目标抗原 绿色箭头：靶抗体 黄色箭头：标记二抗
WB
一、WB基本原理的理解
基 本 过 程 示 意 图
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
WB样本来源：大部分细胞或组织裂解物
蛋白位置 全细胞
胞浆（可溶性蛋白）
WB过程中常见问题和处理方法
5、转膜不充分,或洗膜过度
• 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,
需正确的转膜操作,勿过度洗膜
• 6、曝光时间过短
延长曝光时间 更换更灵敏的发光液
背景有白色/黑色斑 1、转膜时有气泡或抗体分布不均 尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动
2、抗体与封闭剂结合 过滤封闭剂
放映结束 感谢各位的批评指导！
3、抗体孵育温度过高 ——4℃孵育
4、二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应 ——设置二抗对照<不加一抗>,降低二抗浓度 5、洗膜不充分 ——增加洗涤次数,增加洗膜次数
没有阳性条带或很弱
1、一抗、二抗等不匹配
订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与 二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体 及底物. 可通过设置内参可以验证二级测系 统的有效性
拖尾 样品溶解不好
• 纹理〔纵向条纹 • 样品中含有不溶性颗粒
• 条带偏斜
电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散 加样量过多
Western blot 结果曝光问题
背景过高且不均匀 1、封闭不充分
——延长封闭时间； ——更换合适的封闭剂〔脱脂奶粉,BSA,血清等
2、一抗浓度过高 ——增加一抗稀释倍数；
i一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极 易产生较高的背景
4、封闭
a 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白 标记的抗体一起使用,因为脱脂奶粉含有糖 蛋白和生物素
b如果封闭剂中含磷酸酶,用磷酸化特异性抗 体分析磷酸化蛋白受到影响,因为磷酸酶与 印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸 化
c检测磷酸化抗体时,不能使用酪蛋白/脱脂奶 粉作为封闭剂
转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转移液浸泡 20min；
蛋白质免疫印迹技术及常见问题34页文档
16、云无心以出岫，鸟倦飞而知还。 17、童孺纵行歌，斑白欢游诣。 18、福不虚至，祸不易来。 19、久在樊笼里，复得返自然。 20、羁鸟恋旧林，池鱼思故渊。
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WesternBlot蛋白免疫印迹原理及常见问题（FAQ）
WesternBlot蛋白免疫印迹原理及常见问题（FAQ）1. Western blot结果中的背景为什么较高?可能的原因及建议1.膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
2.一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
3.一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。
4.膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。
5.检测时曝光时间过长——减少曝光时间。
2. Western blot结果中杂带较多可能的原因及建议1.目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
2.查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
3.目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。
4.样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
5.上样量过高，太敏感——适当减少上样量。
6.一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。
7.一抗不纯——纯化抗体8.一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。
3. Western blot结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议1.检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
2.检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
3.转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
4.抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
5.一抗孵育时间不足——建议4℃结合过夜。
6.二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。
7.洗膜过度——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。
4. 其它现象：1.膜上多处出现黑点或黑斑——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。
Western Blot常见问题及解决方法
Western Blot（蛋白质印迹）技术是生物医学研究中常用的蛋白质分析技术之一，可以用于检测蛋白质样品中的特定抗原。
然而，在进行Western Blot实验时，可能会遇到一些问题，下面列举了一些常见问题及解决方法：1.电泳条带不清晰或无条带：解决方法：•检查样品质量，确保待检测样品是可用的，无降解或污染。
•调整电泳参数，如电压、电流和时间等，以优化电泳效果。
•更换抗体，确认抗体的特异性，避免非特异性结合。
2.膜上背景过重：解决方法：•在抗体孵育之前，使用封闭剂封闭膜上的非特异性位点，减少抗体非特异性结合。
•减少一抗和二抗的浓度，减轻非特异性结合。
•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和蛋白质。
3.目的蛋白信号弱或无：解决方法：•调整一抗和二抗的浓度，提高特异性结合的信号强度。
•选择更灵敏的显色方法，如化学发光法等。
•在转膜前，优化样品处理，如提取、纯化和浓缩等步骤。
4.非特异性条带：解决方法：•检查抗体特异性，确认抗体的特异性，更换抗体以减少非特异性结合。
•检查样品处理步骤，避免样品中的杂蛋白干扰。
•增加洗涤次数和时间，以清除未结合的抗体和非特异性结合的蛋白质。
5.显影后膜上条带处变为黄色或白色：解决方法：•可能是由于曝光时间过长或显影液浓度过高导致的，可以降低曝光时间和减少显影液浓度来解决问题。
•在膜清洗时使用甲醇或乙醇等有机溶剂，清除膜上的多余抗体和显色剂。
6.条带内无显影的白点：解决方法：•在转膜前检查是否存在气泡，气泡会影响转膜效果和条带形成。
•增加转膜时间和电流，以促进蛋白质的转移。
•检查显影液是否过期或存在质量问题。
7.存在散在小圆斑：解决方法：•这可能是由于封闭液中的杂质颗粒导致的，可以通过过滤封闭液来清除杂质。
•检查一抗和二抗是否含有杂质抗体或存在抗体污染的情况，更换抗体可以解决问题。
•检查显色液是否存在问题，如过期或存在杂质等，更换显色液可以解决问题。
8.条带变形或不均匀：解决方法：•检查电泳胶的质量和制备过程是否存在问题。
蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答
蛋白Westernblot电泳——试验中常见问题及解答蛋白质电泳与western blot1Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。
（1）原理（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题9. 条件的摸索10. 方法的介绍11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
（2）分类①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
（3）主要试剂1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
蛋白质的Western印迹分析
蛋白质的Western印迹分析一、实验注意事项：1、本实验所有操作避免用手直接接触PVDF膜，同时避免折划PVDF膜；2、实验过程中，要一直保持PVDF膜的湿润状态；二、实验流程1．蛋白质电泳：操作流程及注意事项参见《蛋白质的SDS－PAGE凝胶电泳》；2．SDS－PAGE凝胶转膜：1)将蛋白胶放于玻璃板上，测量大小，剪取相同大小的PVDF膜，做好标记，将膜放于100％甲醇内浸润超过10秒；2)剪取相同大小的六块滤纸，三张一份，与胶和PVDF膜放于转膜缓冲液内平衡；3)在转膜上将三张一份的滤纸放于最底层，依次放上蛋白胶、PVDF膜、另外三张滤纸，对齐用玻璃棒赶去所有气泡；根据目的蛋白大小凝胶浓度选择合适电流和时间恒流转膜(一般一块膜75mA,时间2hr)；3．蛋白质的免疫检测：1）在平皿内加入含5％脱脂奶粉的10ml PBS-T(或TBS-T)，脱色摇床摇动将膜封闭2-3hr；2）加入一抗稀释液10ml (含2.5％脱脂奶粉PBS-T)，一抗的稀释比例取决于所用抗体的效价和转到膜上目的蛋白的量，室温反应2小时或者4度过夜；3）大体积（约20ml）PBS-T洗膜3×5分钟；4）加入稀释好的二抗(含2.5％脱脂奶粉TBS-T)5）20 ml TBS-T漂洗3×10分钟；7）将膜放于碱性磷酸酶反应buffer内摇动平衡2分钟8）在一小培养皿中依次加入10 ml碱性磷酸酶反应Buffer、66ul NBT 、33ul BCIP混匀将膜放入，避光反应，并随时检测膜的颜色变化；9）目的条带出现后，大量自来水洗终止反应（或在50ml PBS-T内加入200ul0.5 mol/L EDTA，用之终止效果更佳），照相保存；三、实验所需试剂：1．转移缓冲液1L：39mM甘氨酸：2.9g48mM Tris：5.8g0.037%SDS：0.37g20%甲醇：200ml2．碱性磷酸酶缓冲液100ml：100mM NaCl5mM MgCl2100mM Tris-Cl pH9.53、PBS-T 1L pH 7.5：1M 磷酸二氢钠31.6ml1M 磷酸氢二钠68.4mlTween 20 0.1% 1ml水900ml，调pH后定容1L4、TBS-T 1L pH 7.6：Tris 2.42gNacl 8gTween 20 1ml水900ml，调pH后定容1L；5、封闭液100ml：100ml TBS-T内加入5克脱脂奶粉6、一抗稀释液100ml ：100ml PBS-T内加入3-5克脱脂奶粉7、二抗稀释液100ml ：100ml TBS-T内加入3-5克脱脂奶粉。
Wesern-bloing蛋白免疫印迹实验ppt课件
④ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
27
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
①测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋 白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白 变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2.结果分析
3.注意事项
四
实验室常见问题解答
20
蛋白样品制 备 蛋白含量测
定
21
在六孔板中，按照一 个孔添加150μL的比 例添加适量RIPA裂解 液，用枪吹打均匀以 充分接触细胞。
样品放置冰上 30min（中间混 匀5-6次）直至 裂解完全。
充分裂解后，1000014000g离心3-5分钟， 取上清，即可进行后续 的PAGE、Western和免 疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃 板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气
泡也可能使样品溢出。）
28
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟，可多跑几分钟； 分离胶180V电压跑 至底端。
疾病早期诊断
例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
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检测样品中特异性蛋白质是否
全自动蛋白印迹定量分析系统的使用及常见问题分析
全自动蛋白印迹定量分析系统的使用及常见问题分析全自动蛋白印迹定量分析系统是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域的先进技术。
它能够快速、准确地分析样品中的蛋白质含量，并且能够自动化地进行实验操作，大大提高了实验效率和准确度。
本文将介绍全自动蛋白印迹定量分析系统的使用方法以及常见问题的分析。
一、全自动蛋白印迹定量分析系统的使用方法1. 样品处理在使用全自动蛋白印迹定量分析系统进行实验之前，首先需要对样品进行处理。
通常情况下，样品需要经过蛋白抽提、浓缩和纯化等步骤，以确保样品中的蛋白质能够被准确地检测和分析。
2. 试剂配置在进行实验之前，需要准备好所需的试剂，并按照实验步骤进行适当的配置。
通常情况下，全自动蛋白印迹定量分析系统需要使用蛋白质标记试剂、洗涤缓冲液、显色底物等试剂，这些试剂的配置需要按照系统操作手册进行准确的配比和操作。
3. 样品加载将处理好的样品加载到全自动蛋白印迹定量分析系统的样品槽中，根据系统操作手册的指导进行操作。
通常情况下，系统会根据样品的特性，自动选择合适的分析方法和参数。
4. 实验操作启动全自动蛋白印迹定量分析系统，根据系统提示进行实验操作。
系统会自动进行样品的处理、标记、洗涤、显色等步骤，用户只需根据系统提示进行简单的操作即可。
5. 数据分析实验完成后，全自动蛋白印迹定量分析系统会自动生成实验数据，并进行数据分析。
用户可以通过系统提供的分析软件进行数据的处理和分析，得到样品中蛋白质含量的准确定量结果。
二、常见问题分析在使用全自动蛋白印迹定量分析系统的过程中，可能会遇到一些常见问题，下面对这些常见问题进行分析和解决方案的介绍。
1. 实验结果不准确实验结果不准确可能是由于样品处理或者试剂配置过程中出现了问题，或者是由于系统操作过程中出现了故障。
解决这一问题的方法是，首先检查样品处理和试剂配置的步骤，确保每一步都按照操作手册的要求进行操作。
检查系统操作过程中是否有异常情况发生，如系统报错或者系统参数设置错误等，及时进行调整和纠正。
蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析44页PPT
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的免疫印迹技术及常见问题分析
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
蛋白质免疫印迹技术及常见问题34页PPT
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
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36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
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Western blot ：
➢ 把电泳分离的蛋白质转移到固定膜上，并用抗原抗 体反应进行特异性目的蛋白的检测的过程。
➢ 是集电泳、转印和免疫标记为一体的蛋白质分离检 测技术,结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定 的特异敏感等特点，可检测到低至1～5ng（最低可 到10－100pg）的靶蛋白。
Western blot ：
在待分离蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互 作用的缓冲液都可以使用。常见的凝胶电泳缓冲液有两 种： Tris-甘氨酸：分离范围宽，可用于分离分子量
•快速5～15分钟， 颜色稳定； •深浅随不同蛋白质 变化; •标准曲线有轻微的 非线性
•较快40分钟内， •抗干扰能力强
二.SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE电泳，是在PAGE系统中引进SDS（十二烷基硫 酸钠）
同时电泳系统中存在强还原剂（DTT或β-巯基乙醇）能使半 胱氨酸之间的二硫键断裂，使得ＳＤＳ-ＰＡＧＥ的电泳中 的蛋白处于完全变性状态
概论
Sout概her论n blot
The Southern blot is used for DNA analysis and was routinely used for genetic fingerprinting and paternity testing prior to the development of microsatellite markers for this purpose.
考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合呈蓝 色，在波长595nm 吸收峰，在一定的 范围内与蛋白质的 含量呈线性关系
高 （约1～5μg/ml）,
BCA法基于双缩脲 很高 原理，碱性条件下 （0.5-20μg/ml ） 蛋白质将Cu2+还原 成 Cu+ ，BCA螯合 Cu1+ 作为显色剂， 产生兰紫色并在 562 nm有吸收峰
partnership with immunoprecpitation ）
Western Blot一般流程
➢ 蛋白样品的制备 ➢ SDS-PAGE 电泳 ➢ 转膜 ➢ 鉴定膜上特定蛋白
封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
Western blotting Isolation
Identification
➢ The method originated in the laboratory of Harry Towbin at the Friedrich Miescher Institute. The
name western blot was given to the technique by
W. Neal Burnette and is a play on the name Southern blot, a technique for DNA detection developed earlier by Edwin Southern.
RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer) 150 mM sodium chloride 1.0% NP-40 or Triton X-100 0.5% sodium deoxycholate 0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate) 50 mM Tris, pH 8.0
Ref:
Towbin H, Staehelin T, Gordon J. 1979 Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.
protein A. Analytical Biochemistry 112 (2): 195–203.
Western blot测定的不是目的蛋白的绝对含量， 只是相对含量,它可以用于目的蛋白：
the presence, relative abundance, relative molecular mass, posttranslational modification, the specific interaction of proteins (in
•适用于脂类含量较高 的样品测定， •能耐受相当浓度的去 垢剂如SDS。 •受硫酸铵；Tris缓冲 液；甘氨酸；各种硫 醇干扰
易受强碱性缓冲液， TritonX-100，SDS等 去污剂的影响
•不易受一般浓度去污 剂的干扰 •可受螯合剂、略高浓 度的还原剂的影响
•耗费时间长40～60 分钟； •操作要严格计时； •颜色深浅随不同蛋 白质变化; •标准曲线不是严格 的直线形式，专一 性较差
蛋白印迹技术
Western blot 实验技术
概论 概 论 印迹法(blotting): 将样品转移到固相载体上，利用
相应的探测反应来检测样品的一种方法。
southern blot: 1975年，Edward M. Southern 建立了 该方法, 将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，然后用DNA－RNA杂交检测特定的DNA 片段。
RIPA是广泛用于提取膜蛋白和细胞全蛋白的 裂解液，但更多是用来制备核蛋白。 它能破坏蛋白之间的相互作用，所以不适合 用于免疫沉淀实验。
有研究者建议可在以下范围对裂解液成分进行调整： Salt concentrations:0-1M Non-ionic detergents:0.1-2% Ionic detergents:0.01-0.5% Divalent cation concentrations:0-10mM EDTA concentrations:0-5mM,and PH 6-9
通过加入核酸酶或采取不同提取策略 5）样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
裂解液
Nonidet-P40 (NP40) buffer
150 mM NaCl 1.0% NP-40 (Triton X-100 can be substituted for NP-40) 50 mM Tris, pH 8.0 Nonidet-P40 (NP40) buffer广泛用于裂解胞液蛋白，膜结合蛋白 以及细胞全蛋白的裂解液
凝胶浓度的选择
SDS－PAGE电泳分离只取决于蛋白质的大小，因此 凝胶浓度的正确选择尤为重要。 不同分子量范 围的蛋白质应选用不同浓度的凝胶浓度。
浓度太大，孔径太小，电泳时样品分子不能进入凝胶。
浓度太小，孔径太大，则样品中各种蛋白分子均随着缓冲 液流向前推进而不能得以很好地分离。
凝胶浓度与蛋白分离范围
之后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印 迹分析。
Sir Edwin Mellor Southern, FRS ,is an English, 2005 Lasker Award winning molecular biologist. His award was for the invention of the Southern blot , now a common laboratory procedure, when he was working at the University of Edinburgh.
DN概A m论icroarray
Southern founded Oxford Gene Technology (OGT), a company that developed DNA microarray technology. OGT won a 1999 patent infringement lawsuit against Affymetrix based on his patent holdings in microarray technology.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA 76
(9): 4350–54
Burnette WN. 1981 Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate— polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated
蛋白酶和磷酸酶抑制剂
2.蛋白质浓度测定
通过稀释使不同样品具有相同浓度，必要时需要 对蛋白进行浓缩。常用的蛋白浓度测定方法包括： ➢ Bradford法， ➢ Lowry法， ➢ BCA法
方法
原理
灵敏性
干扰因素
优缺点
Lowry法 Folin－酚试剂 法
Bradford法
BCA法
蛋白质在碱性溶液 较高 中肽键与Cu2+螯合， （约5μg/ml） 形成蛋白质一铜复 合物，还原酚磷钼 酸产生蓝色化合物， 蓝色深浅与蛋白质： 打开蛋白质的非共价键，并形成蛋白质-SDS复合物(在一定件 下, 多数蛋白质与SDS的结合比为1.4 g SDS/g蛋白质) 。 SDS所带的负电荷量远超过蛋白原有的电荷量，掩盖了蛋白质 间原有的电荷差异。
使蛋白质具有相似的形状： SDS与蛋白质结合引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复 合物在水溶液中的形 状近似于长椭圆棒。
➢凝胶交联度（C％）：凝胶溶液中交联剂 占单体和交联体总量 的百分数 C％＝5％时胶的孔径最小
凝胶浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；凝胶浓度太低时， 凝胶稀软，不易操作。 SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按 “Bis～Arc” 为 1：29 配制，研 究表明它能分离分子量大小相差只有3% 的蛋白质。
电泳缓冲系统
不同蛋白质-SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白 质Mr大小成正比地变化。