硝化细菌的分离与鉴定范文

硝化细菌的分离与鉴定

要筛选生长速度快、硝化作用强的硝化细菌用于水产养殖水处理。硝化细菌包括亚硝化

菌和硝化菌两个生理菌群，分别可将水中的氨态氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。实验结果

表明经5周培养，亚硝化菌可使培养液中的氨氮含量下降到60％，硝化菌可使培养液中的亚硝酸盐含量下降到60％。实验可通过测定培养液中亚硝酸盐的含量变化来测定细菌的氨转化作用或硝化作用。

关键词：硝化菌，亚硝化菌，硝化作用，筛选。

氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强烈的治癌物质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。

硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其

主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。可通过NH4+→NO2- → NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养

殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接

影响硝化效果和生物脱氨的效率。

研究表明，水体中硝化细菌的浓度对生物脱氨具有十分重要的意义，由于大多数硝化细

菌生长缓慢，硝化及脱氨效果欠佳，处理水产养殖污水的效果不是很好。因此筛选出生

长速率高硝化作用强度大的硝化细菌有很大的用途。

本文对硝化细菌的研究主要在富集培养和固定化细胞方面，能够有效提高硝化细菌的产

率和硝化细菌的利用率。通过富集培养的硝化细菌浓度是未经富集培养的12.5～20.0倍

，利用细胞固定化技术可使氨氮去除率提高16.5个百分点。国外在硝化细菌的培养方面

的研究已有一些专利技术，其中一些已形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须

不断向反应器中补充流失的硝化细菌。硝化作用包括两个步骤：氨转化为亚硝酸盐和亚

硝酸盐转化为硝酸盐，这两个步骤分别由亚硝化菌和硝化菌完成，至今还未发现有能将

氨直接转化为硝酸盐的细菌。

氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度

对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38

℃，高于20℃时硝化细菌的活性较高，但超过38℃消化作用将会消失。当环境气温低于

20℃时，氨的转化会受到影响。

一般认为，适宜硝化菌和亚硝化菌生长介质的pH值分别为6.0～8.5和6.0～8.0。水体DO

的高低影响到好氧、厌氧微生物的比例，大多数研究人员认为DO的浓度应当控制在1.0～

2.0 mg/L，低于0.5 mg/L时硝化作用明显减弱。另外，碳氮比、碱度等对硝化及脱氨均

有影响。

本文中筛选硝化细菌的依据主要是生长速率和硝化作用强度，生长速率主要采用活菌计

数，因为硝化细菌的液体培养基中有沉淀，用OD600测的值误差较大。氨转化效率和硝化

作用强度主要用比色法测定，利用亚硝酸根的显色反应。亚硝化菌测定其培养液中亚硝

酸根的增加量，硝化菌测定其亚硝酸根的减少量。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

由海洋中分离得到

1.1.2 培养基

亚硝化菌培养基(NH4)2SO4 0.5g NaCl 0.3g FeSO4•7H2O 0.03g K2HPO4 1g MgSO4•7H2O 0.03g CaCl2 7.5g 蒸馏水1000ml PH 自然固体培养基加5％琼脂硝化菌培养基NaNO2 1g MgSO4•7H2O 0.03g MnSO4•4H2O 0.01g K2HPO4

0.75g Na2CO3 1g NaH2PO4 0.25g 蒸馏水1000ml PH 自然固体培养基加5％琼脂肉汤培养基牛肉膏0.5％蛋白胨1％氯化钠0.5％琼脂2％

1.1.3 试剂

牛肉浸膏上海长阳生化制药厂蛋白胨上海东海制药厂磷酸氢二钾浙江临平化工试剂厂

磷酸二氢钠南京化学试剂一厂磷酸氢二钠南京化学试剂一厂氯化钠南京化学试剂一厂

MnSO4•4H2O 南京化学试剂一厂琼脂江苏疾病预防控制中心微生物试剂厂（NH4）

2SO4 南京化学试剂一厂FeSO4•7H2O 上海试剂二厂MgSO4•7H2O 上海试剂

四厂CaCl2 华东师范大学化工厂Na2CO3 上海虹光化工厂NaNO2 淮安化工二厂磺胺酸

天津瑞金特化学品有限公司α-萘胺上海泗联化工厂

1.2 实验方法

1.2.1 硝化细菌的分离

将采集到的海水样本分别放在两个培养皿中，分别加入亚硝化菌液体培养基和硝化菌液

体培养基，放在24℃地培养箱中培养5天，然后取培养液在固体培养基上进行分区划线，得到单菌落，再挑取单菌落进行分区划线分离。

1.2.2 形态结构鉴定

（1）将分离得到的单菌落分别接种到肉汤培养基的平板上看其是否生长（硝化细菌是严

格的自养菌，在肉汤培养基上不能生长）。

（2）镜检观察：单染色法

（3）在培养液中加入格利斯试剂，亚硝化菌培养液变红即可判断为阳性，硝化菌的培养

液需比色计算出其亚硝酸根浓度是否降低，才能判断是否为硝化菌。

1.2.3 细菌的培养（摇瓶、发酵罐）

（1）摇瓶培养：将初步鉴定是硝化细菌的菌落接种到摇瓶中20-28℃培养，200转/分钟

，每隔五天取样一次测硝化作用强度和菌浓度。

（2）发酵培养：将培养5天的种子加入发酵罐中，于20-28℃培养，其中pH控制在6.0以上。每隔12小时取样测亚硝酸根浓度和菌浓度。

1.2.4 硝化作用测定

1.2.4.1 试剂

（1）格利斯试剂溶液Ⅰ：称取磺胺酸0.5g，溶于150ml醋酸溶液（30％）中，保存于棕色瓶中。溶液Ⅱ：称取α-萘胺0.5g，加入50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％的醋酸溶液150ml中，保存于棕色瓶中。

（2）2%醋酸钠溶液将2g无水醋酸钠加入到100ml蒸馏水中，混匀溶解。

1.2.4.2 方法

☆标准曲线的绘制

①称取4.500g分析纯亚硝酸钠于干燥的小烧杯中，加蒸馏水溶解后洗入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度定容，摇匀，溶液中NO2-的浓度为30mg/ml，用时稀释至NO2-为0.03

mg/ml。