蔬菜中硝酸盐与亚硝酸盐的检测方法

1 光谱法
测定硝酸盐和亚硝酸盐的国标方法是镉柱法[4]。其原理为：在弱碱性条件下， 用热水从样品中提取亚硝酸离子（NO2-）和硝酸离子（NO3-），然后用亚铁氰化钾 和乙酸锌沉淀蛋白、过滤。分取两整份溶液。一份直接加磺胺和萘乙二胺盐酸盐， 在波长 538 nm 处测量生成红色复合物的吸光度，计算样品中原有的亚硝酸离子 （NO2-）含量；另一份用金属镉还原硝酸离子（NO3-）为亚硝酸离子（NO2-），然后 同上显色，测量样品中原有亚硝酸离子（NO2-）和硝酸离子（NO3-）还原生成亚硝 酸离子（NO2-）的总量，由二者之差计算硝酸离子（NO3-）含量。镉柱法虽然结果 准确，但是操作复杂，时间较长，不适宜大批量样品的检测，且其还原剂镉对环 境构成很大威胁。
————————————— 基金项目：江苏省农产品安全全程质量监控技术研究与开发项目支助（锡科计[2005]104 号） 作者简介：孙震（1966-），女，江南大学食品学院副教授。 E-mail: zhsun@ 通讯作者：钱和 收稿日期：2006-06-25
粮农组织（FAO）在 1973 年制订了食品中硝酸盐的限量标准，提出蔬菜中硝 酸盐积累程度分为四级[1]。一级≤432 mg/kg，允许生食；二级≤785 mg/kg，不 宜生食，允许盐渍和熟食；三级≤1440 mg/kg，只能熟食；四级≥3100 mg/kg， 不能食用。作为无公害蔬菜，其硝酸盐含量应达到一级标准甚至更高。
Andradea 等人（2003）采用流动注射结合光谱检测的方法测定了蔬菜中的 亚硝酸盐和硝酸盐[5]。其原理为：先将硝酸盐和亚硝酸盐还原为一氧化氮，在酸
性环境下，一氧化氮会和铁（II）、硫氰酸盐反应，生成 FeSCNNO+复合物。该复 合物在 460 nm 处有最大吸收，且与硝酸盐和亚硝酸盐的浓度成正比。一氧化氮 的生成分成两个阶段：（1）硝酸盐在镉铜还原剂作用下生成亚硝酸盐；（2）在亚 硝酸盐在硫酸介质中还原成 NO。该方法可以测定的亚硝酸盐和硝酸盐浓度范围 分别为 0.30～3.00 mg/L 和 1.00～10.00 mg/L。样品量为 5 g 时，每小时可分 析 30～40 个样品。该法对硝酸盐和亚硝酸盐的检测限分别为 20 mg/kg 和 13 mg/kg，方法精确性和准确性与 AOAC 方法相当。此外，Zatar 等人（1999）建立 了一种采用磷钼蓝复合物的分光光度法来测定硝酸盐和亚硝酸盐的方法[6]。其原 理为：先用硫化钠将磷钼酸还原为磷钼蓝复合物，该复合物可以被亚硝酸盐氧化， 蓝色会降低。蓝色物质吸光值（814 nm）降低的数值与加入亚硝酸盐的量成正比。 这两种方法与国标法及 AOAC 法相近，具有相同的特点，即操作较为复杂，时间 较长，易受色素等干扰，结果有时偏高。
研究发现，高效液相色谱利用紫外检测虽能同时测定蔬菜中的硝酸盐和亚硝 酸盐，但分离效果不如离子色谱。以离子色谱/电导检测法测定蔬菜中的 N03-和 N02-，回收率为 96%～104%和 97%～102%；线性范围分别为 1.0～200 mg/kg 和 0.25～10.0 mg/kg；检出限分别为 5.0 mg/kg 和 1.25 mg/kg[12]。
蔬菜中硝酸盐与亚硝酸盐的检测方法
Determination methods of nitrite and nitrate in vegetables
孙震
钱和
蒋将
SUN Zhen QIAN He JIANG Jiang （江南大学食品学院教育部食品科学与安全重点实验室,江苏 无锡 214036） （School of Food Science and Technology, Southern Yangtze University,
尽管亚硝酸盐在改善肉制品的色泽和货架期方面发挥了重要作用，但是硝酸 盐和亚硝酸盐对人体的不良影响已引起人们的关注。一方面，硝酸盐经生物转化 生成亚硝酸盐等产物，降低血液的载氧能力，导致高铁血红蛋白血症（Phillips， 1971）[2]；另一方面，亚硝酸盐还可与人体中的次级胺（仲胺、叔胺、氨基酸） 反应，在胃腔中（pH = 3）形成强力致癌物——亚硝胺，从而诱发消化系统癌变 （Kelley，2003）[3]。因此，了解影响硝酸盐在蔬菜中积累的规律，采取有效措 施控制蔬菜中的硝酸盐含量，建立准确、快速的检测方法，对发展无公害蔬菜生 产和提高人民的生活质量与健康水平有着重要的意义。
上世纪 80 年代中期，德国 Merck 公司生产的硝酸盐速测试纸条和后来推出 配套使用的反射仪，使硝酸盐的测定可在短时间内迅速完成。硝酸根试纸-反射 仪法使用的反射仪体积小，便于携带，稳定性好，适合田间操作及在基层工作使 用。试纸条上无腐蚀性化学试剂，不会对人体安全和健康产生威胁。另外，反射 仪还具有存储功能，并带有输出端口，可以将所测得的数据直接传入计算机进行 处理，效率更高[8]。
2 色谱法
色谱法用于硝酸盐和亚硝酸盐的检测已有较长的历史，可以实现蔬菜中阴离 子的多残留检测，同时测定蔬菜中痕量的硝酸盐和亚硝酸盐。目前用于蔬菜中硝 酸盐和亚硝酸盐检测使用的色谱法主要有高效液相法和离子色谱法。早在 1984 年，Jackson 等建立了一种 HPLC 法来测定肉制品中的硝酸盐和亚硝酸盐含量[11]。 他们采用一种阴离子交换柱为固定相，用氯甲磺酸盐缓冲液来洗脱，在波长 210～214 nm 范围内检测。该法快速灵敏，精确性好，在多种样品中获得满意的 回收率。采用该法可以弥补普通分光光度法的不足，得到准确的结果。
离子色谱法是 20 世纪 70 年代中期发展起来的一项新的液相色谱技术，作为
一种新型的色谱分析方法，离子色谱法不仅可以同时测定蔬菜中的硝酸盐和亚硝 酸盐，还可以根据不同的研究目的，同时定量测定多种阴离子组分的含量，如氟、 氯、甲酸、乙酸、草酸、抗坏血酸、柠檬酸、硫酸、磷酸根等离子，以满足同一 样品多阴离子组分的同时定量测定。
总之，光谱法是当前测定硝酸盐和亚硝酸盐的主要方法。经典的紫外可见分 光光度法具有结果准确、费用低等优势，但时间较长，所用试剂往往有一定危险， 在测定色素较多的样品时容易产生误差，目前还在不断的改进。快速检测方法的 主要优势是其测定速度快，便于携带，可用于准确度要求不太高的现场测定。荧 光检测的费用相对紫外可见分光光度法高，但是检测限低，方法灵敏，有较大的 发展空间。
近年来，硝酸盐和亚硝酸盐现场快速检测方法有所发展，常见的包括目视比 色法、硝酸盐试粉法和硝酸根试纸—反射仪。目视比色法测定蔬菜（鲜菜）中的 硝酸盐含量，方法简便、快速，但结果准确性不够。硝酸盐试粉法主要用于植株 体内硝态氮的定性测定。改进的试粉法以水作为提取溶剂，混合试粉（柠檬酸∶ 一水硫酸锰∶无水对氨基苯磺酸∶N - 1 - 萘乙二胺盐酸盐∶细锌粉= 30∶4∶ 116∶018∶1）加入量为 0.1g，可用于新鲜蔬菜中硝酸盐的定量测定，不需任何 仪器，重现性好，测定结果准确可靠，操作简便、快速、颜色稳定[7]。硝酸盐试 粉法测定的是样品中硝酸盐和亚硝酸盐总含量。对新鲜蔬菜、水果而言，其中亚 硝酸盐含量极低（8～10 ppm ）（ ppm 已不用，请将其换算为 mg/L 或 mg/kg）， 相对硝酸盐含量可忽略不计，此时测定值可直接作为硝酸盐测定值。但非新鲜蔬 菜的测定，则要在测定总值中减去亚硝酸盐的含量才是硝酸盐的含量。
总之，色谱分析法虽然准确，但是测定速度一般，在大批量测定时才可体现 其优势。色谱法一般需昂贵的仪器，所以只有当色谱仪在国内广泛普及后才有较 大的应用空间。
3 电化学法
电化学分析法是分析化学中一个重要分支，采用离子选择电极法测定蔬菜中 硝酸盐含量是硝酸盐分析方法的重要发展。它可以通过简单的电位测量，直接测 定溶液中某一种离子活度，由于测定所用的设备简单，而且能进行连续快速的测 定，所以这项技术被广泛应用于化工、农业、地质、医药等部门的样品分析。目 前用于测定蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐的电化学方法主要有 N03-离子选择电极法、 极谱法和毛细管电泳法等。姚建武等(2006)采用硝酸根电极测量了蔬菜中的硝酸 盐含量，其原理是依据待测液在添加标准溶液前后的 2 次电位(E1 和 E2)不同，从 而可以计算出待测液中硝酸根的浓度[13]。硝酸根电极测定蔬菜硝态氮的主要干扰 离子是 Cl-和 NO2-，使分析结果偏高。待测液中加入混合缓冲液，使 Cl-、NO2-分 别与 Ag2SO4 和 NH2SO3H 作用，生成沉淀或遭到破坏而排除其干扰。
硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法还在不断的发展和完善之中，荧光法是其中比 较成功的尝试。Li 等（2004）建立了一种采用荧光探针 1,3,5,7-四甲基-8-(4’氨基苯)-4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮-s-indacene(TMABODIPY)来检测肉制品和 蔬菜中痕量亚硝酸盐的方法[9]。亚硝酸盐与 TMABODIPY 先后在酸性和碱性环境下 反应，可以生成重氮酸盐，这种物质是一种稳定的强荧光试剂，因此，该测定方 法具有特异性高、敏感性高和简单的优势。检测范围为 8～300 nmol/L，检测限 0.65 nmol/L。其用于水和蔬菜中亚硝酸盐的测定不必提取。Huang 等(2006)建 立了一 种采用荧光探针 1,3,5,7-四甲基-2,6-二乙酸基-8-(3’,4’-二氨基 苯)-二氟化硼二氮-s-indacene (TMDCDABODIPY)检测肉制品和蔬菜中亚硝酸盐 的方法[10]。TMDCDABODIPY 本身的荧光性很弱，但是与亚硝酸盐在水相介质中常 温下反应后，生成了一种强荧光三唑物质，具有很好的特异性和敏感性。在亚硝 酸盐浓度 9～300 nmol/L 的浓度范围内，荧光强度与亚硝酸盐的浓度呈线性关系， 检测限为 0.21 nmol/L。该方法用于检测食品中痕量亚硝酸盐时，样品回收率为 94.62%～105.48%。
Wuxi,Jiangsu 14036,China）
摘要：综述了亚硝酸盐和硝酸盐的检测方法，指出了各检测方法的优劣及其应用
前景，对于监控蔬菜生产加工中硝酸盐和亚硝酸盐的含量，检测蔬菜产品的品质
等具有参考意义。
关键词：无公害蔬菜；亚硝酸盐；硝酸盐；检测