现代生物技术在食品检测中的应用

现代生物技术在食品检测中的应用

潘云娣　杨文鸽

(宁波大学生命学院,宁波　315211)

摘　要:　介绍了DNA探针、PCR技术、免疫检测技术在食品微生物及转基因成分检测中的应用。着重阐述了PCR技术的工作原理、应用及其发展前景。同时简要介绍了生物芯片及其在食品检测中的应用前景。

关键词:　DNA探针　PCR技术　免疫检测技术　生物芯片

The Application of Modern Biological T echnologies in Food T esting

Pan Yundi　Yang Wenge

(L if e College Ni ngbo U niversity,Ni ngbo　315211)

Abstract:　The application in food microorganisms and GMO identification of four modern molecular biology tech2 niques were introduced:DNA probes,PCR technique,immunological examination,biochip.The principle,application and development prospect of PCR technique were especially detailed discussed.The biochip and its application prospect were also presented.

K ey words:　DNA probes　PCR technique　Immunological examination　Biochip

随着我国食品科学技术的发展以及对外贸易的需要,食品的检测与分析工作已经提高到一个极其重要的地位。特别是为了保证食品的标准品质,开展食品科学技术研究,寻找食品污染的根源,人们更需要对食品进行各种有效营养物质和对人体有害、有毒物质的检验和分析。我国目前采用的食品检验方法还比较落后,已不能适应人们对食品卫生和安全的需求。因此,改进和完善食品检测技术已迫在眉睫。

自1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋模型,揭示了遗传密码的奥秘。进入20世纪70年代,各种分子生物学技术不断出现,主要包括核酸分子杂交技术、PCR技术和现代免疫技术等,目前这些技术在食品检测和分析等方面已经得到了较好的应用;另外,生物芯片技术也在食品检测方面显示了较好的应用前景。本文就这些技术尤其是PCR技术在食品检测方面的应用与特点作一探讨。

1　DNA探针法

两条不同来源的核酸链如果具有互补的碱基序列,就能够特异性的结合而成为分子杂交链。若在已知的DNA或RNA片断上加上可识别的标记(如用32P同位素标记),就可制成DNA探针,用以检测未知样品中是否具有与其互补的序列[1]。

目前使用的DNA探针杂交方法总体上可以分为2类:一类是异相杂交(即固相杂交技术)。二是同相杂交(即液相杂交技术)。近年来DNA探针杂交技术在食品微生物检测中的应用研究十分活跃,目前已可以用DNA探针检测食品中的大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(S al monella)、志贺氏菌(S higella spp)、李斯特氏菌(L isteria monocyto2 genes)、金黄色葡萄球菌(S taphylococcus an2 rens)[2,3,4]等。

1991年周志江[5]等用生物素标记的编码大肠杆菌耐热毒素(ST)的DNA片断作为基因探针,检测了污染食品中的产ST大肠杆菌。1993年3月陈倩[6]等对自食品中以血清学初筛分离出的78株ESIEC菌株,以入rp2z基因探针检测其HPI毒力岛基因,结果检出7株,可鉴定为ESIEC大肠杆菌。本法特异、敏感而又没有放射性,且不需要进行复杂的扩增菌和获得纯化培养而节省了时间,从而减少了毒力丧失的机会,提高了检测的准确性。

2　PCR技术

PCR技术是1985年诞生的一项DNA体外扩增技术。该技术自问世以来,就以惊人的速度广泛

生物技术通报

・技术与方法・ B IO TEC HNOL O G Y　BULL ETIN 2004年第6期

地应用于生物及食品学科的众多领域,在食品中致病微生物及转基因成分的检测方面也有潜在的应用价值。

2.1　PCR技术的基本原理

简单地说,PCR的基本原理是在体外对特定的双链DNA片段(靶DNA)进行高效扩增,故又称基因体外扩增法。在体外合适条件下,先将靶DNA 变性成为单链,然后加入人工设计与合成的两段寡核苷酸引物,在热稳定的DNA聚合酶和4种dN TPs底物存在的条件下,这对引物沿靶DNA按5′→3′方向延伸,合成新的DNA双链。新合成的DNA双链又可作为扩增的模板,继续重复以上的DNA多聚酶链式反应。

2.2　PCR技术在食品检测中的应用

2.2.1　PCR技术在食品致病微生物检测中的应用

PCR技术用于食品中致病微生物的检测较之传统方法具有快速、特异、敏感等特性,其优越性无可比拟,因而该技术在食品致病菌的检测方面具有很大的应用前景。

单核细胞增生性李斯特氏菌:单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)对牛奶等食品均有不同程度的污染,是食品中的主要病原菌。传统的检测方法存在周期长、操作繁琐等不足之处。孙焕东[7]等采用裂解法提取DNA,应用半套式PCR对其进行检测,设计合成的引物可特异地将其扩增,并对其它菌不产生反应,显示了较强的特异性。从敏感性看,检测限度可达到10个U FC以下,较之常规PCR检测有所提高;同时,检测只需要5～6h,较之传统方法快得多。杨百亮[8]通过对TaqDNA聚合酶和引物浓度等条件的标化,建立简便实用的快速检测牛奶中单核细胞增多性李氏菌试剂盒,具有良好的应用前景。

肉毒梭菌:食品中肉毒梭菌是引起肉类中毒的潜在因素。用常规方法从食品中分离鉴定肉毒梭菌至少需要4天,不能达到快速检测的目的。王颖群[9]等通过检索肉毒神经毒素的基因序列,选择保守区设计简并引物,用以同时扩增A、B、E和F型毒素的基因。由于肉毒梭菌中毒标本极少,因而用A、B、E和F型肉毒梭菌人工感染10种食品以制备模拟标本,采用适当方法处理后进行PCR检测,实现了快速、敏感、特异检测的检测结果。但由于肉毒梭菌中毒最终由肉毒神经毒素引起,而PCR只能检测肉毒梭菌的存在与否,因而对食品肉毒梭菌和毒素并存,或有菌无毒的情况,PCR检测不具确定的诊断结果,只具参考价值。

沙门氏菌:沙门氏菌是温、冷血动物的肠道菌,分布范围广泛,是食物中毒的常见原因之一。利用PCR技术对沙门氏菌进行检测同样具有传统常规培养法所不具有的快速、简便、特异性强等特点。P.Whyte[10]等人分别采用传统方法与PCR技术对生禽肉中沙门氏菌进行检测发现,采用传统方法检出了16%的样品被沙门氏菌污染,而运用PCR技术则检出了19%的污染样品,可见PCR技术的敏感性更强。而当两者结合使用时,这一数字上升到了23%。几乎所有的沙门氏菌都具有侵入性相关遗传因子(irvA),以此遗传因子为目标的沙门氏菌(Prime PCR screening kit)由日本鉴酒造株式会社在市场上销售,用它不需要特别的技术,就可以高灵敏度地检测出沙门氏菌遗传因子,从而检测出沙门氏菌。

弧菌:副溶血弧菌是海洋和盐湖中微生物区系的重要成员。水产品常常自身携带该菌,因而给该菌在水产品加工中的预防带来难度。有人[11]对相关食品进行副溶血弧菌增菌后,分别用新建的PCR 方法和常规培养法进行平行比对实验,以评价PCR 方法与常规生化法的符合程度,发现结果完全相符,说明PCR法的准确与可靠性。而PCR法在操作、周期长短、灵敏度、检测成本等方面显然具有更大的优越性。

除上述几种食品致病菌外,PCR技术还可用于顽固性梭状芽孢杆菌、葡萄球菌肠毒素等的检测[12],且同样具有较高的特异性、敏感性。

2.2.2　PCR技术在食品转基因成分检测中的应用

随着现代分子生物学技术的飞速发展,转基因食品日益走进我们的生活。但是随着转基因食品逐渐走上人们餐桌的同时,其安全性也日益受到普遍关注。这是由于转基因食品中通常会有新的遗传物质(NDA)和蛋白质,而这些物质在传统的食品中或许不存在[13]。因此,为了保障人类的身体健康,消除消费者顾虑,有利于国际贸易和商品流通,建立快速、简便、准确的转基因检测方法非常必要。

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2004年第6期 潘云娣等:现代生物技术在食品检测中的应用