分光光度法及分光光度计使用方法

I0 I
值大，表示溶液吸收光线较多；
当I 0时，lg I0 值无穷大，表示光线几乎被溶液完全吸收，即溶液不透光。 I
由此可见， lg I0 表示溶液对光吸收的程度，称作吸光度（absorbance）， I
用A表示，即A lg I0 I
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
如何求被测组分的含量
分光光度法
南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心
2012春季学期
内容
1 分光光度法的原理 2 如何求被测组分的含量
3
3 分光光度计的基本结构 4 分光光度计的使用与注意事项
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分光光度法
• 概念：是利用物质所特有的吸收光谱来 鉴别物质或测定其含量的一项技术。
lg Io k l ＋ lg Io k c ＝ lg Io k c l
I
I
I
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A k cl
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分光光度法的原理
lg Io k c l IΒιβλιοθήκη 公式的意义：当I
I
时，
0
lg
I0 I
0，表示溶液完全不吸收光线；
当I＜I0时，lg
若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然 得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线 。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测 定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。
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根据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度
。
A
0.8 0.6 0.4
测定管 标准管
各管测定次数
1
23
各管平均 A值
待测管
各管各测定3次，取其平均A值再代入公式计算。
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结果计算
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架上，拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按 100% 键校T=100.0
• 合上盖，按 MODE 键切换到A档 • 拉动拉杆，将标准、待测液依次放入光路中 ，即可读取其吸
光度A值。重复3次，记录3组数据。 • 读数后，将黑体放入光路中，开盖取出比色杯。 • 将参比液倒回原试管中，清洗比色杯并倒扣在滤纸上晾干 • 关机，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。
清洗。 • 测试结束要及时登记，仪器有问题及时报告。
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操作练习实验材料
• 试剂： CuSO4标准液 （8mg/ml） 待测CuSO4溶液 蒸馏水
• 器材：加样枪、刻度吸管、试管、试管架 V-1100型可见光分光光度计
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0%T
MODE ATCF切换键
PRINT
确认键
100%T
校零、下降键 校100、上升键
V-1100分光光度计操作步骤
• 开机，预热30分钟。 • 转动波长旋钮，调所需波长。按 MODE 键切换到T档。 • 将黑体放入光路中，合上盖，按 0% 键校零,T=000.0。 • 开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯
0.2
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0
1
2
34 5
C
标准曲线(浓度-吸光度曲线）
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V-1100型可见光分光光度计
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V-1100分光光度计键盘控制的使用说明
A T C F
MODE
PRINT
0.000
0%T
100%T
A：吸光度 T：透射比 C：浓 度 F：斜 率
根据定律得：Au KuCuLu As KsCsLs 因为：Ku Ks Lu Ls
所以As与Au之比值也等于两浓度之比值
即 Au Cu As Cs
Cu Au Cs As
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利用标准曲线计算测定物含量
先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出 它们的吸光度。然后以各管吸光度（A）为纵坐标，各 管的浓度（C）为横坐标，在方格坐标纸上作图。
V-1100分光光度计 使用注意事项
• 注意防震、防潮、防光和防腐蚀。 • 每台仪器所配套的比色皿不能与其他仪器的比色皿单个调
换。 • 不可用手指或毛刷摩擦比色杯的透光面。 • 盛装参比液时，达到比色杯的3/4即可，不宜过多，以防
溶液溢出。 • 比色杯外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸
拭净。 • 注意比色杯的清洁，用后应先用自来水冲洗，再用蒸馏水
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分光光度法的原理
• Beer定律
溶液浓度
入射光强度 I0
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C
L 液层厚度
lg Io k c I
I 透过光强度
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分光光度法的原理
• Lambert-Beer定律
如果同时考虑液层厚度和溶液浓度对光吸收的影响，将Lambert和Beer定律 合并，描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系。
1.利用标准管计算测定物的含量 2.利用标准曲线计算测定物含量 3.利用标准系数法求出待测溶液的浓度 4.利用消光系数法求出待测溶液的浓度
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利用标准管计算测定物的含量
在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS）， 同时也测定末知浓度（CU）的吸光度（AU），
操作练习步骤
分别取3支试管，做好标记，按下表操作：
加入物
B
S
U
蒸馏水
3ml
—
—
CuSO4标准液 — CuSO4待测液 —
3ml
—
—
3ml
以空白管B调零，在690nm处，读取标准管S和待测管U吸光度A值，记 录3组数据，取平均A值，代入公式计算。
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数据处理表格
• 特点：灵敏度高、精确度高、操作简便 、快速。对于复杂的组分系统，无须分 离即可检测出其中所含的微量组分的特 点。
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分光光度法的原理
• Lambert定律
溶液浓度
入射光强度 I0
透光率 T I I0
C
L 液层厚度
I 透过光强度
lg Io k l I