细胞培养—无菌操作.ppt
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细胞培养—无菌操作课件
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洁净级别—无菌药品生产所需的洁净 区可分为4个级别
• A级：高风险操作区，如灌装区、放置胶塞桶和与无菌制剂直接接 触的敞口包装容器的区域及无菌装配或连接操作的区域，应当用单 向流操作台（罩）维持该区的环境状态。单向流系统在其工作区域 必须均匀送风，风速为0.36-0.54m/s（指导值）。应当有数据证明 单向流的状态并经过验证。在密闭的隔离操作器或手套箱内，可使 用较低的风速。
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无菌操作—器皿的消毒
• 所有用到的器皿（买时已灭菌的除外）都必须经过高压灭 菌烘干后才能放入超净台内
• 已灭菌的、外包装完好的培养瓶、离心管、冻存管等可以 表面经75%酒精擦拭后直接放入超净台
• 凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的 瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面
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生物安全柜
• 生物安全柜一般是做致病菌，霉菌，酵母菌，病毒来用，操作区域 是负压，简单说是往上处抽风的，当然致病菌也不是直接抽出排到 室外，是过滤在生物安全柜的顶部漏器上，从排风量上可以分为， 50%外排型，75% 以及100%外排型。在生物安全柜内所形成的几乎没 有微生物的环境中，尽量避免使用明火，酒精灯的火焰可能会影响 室内的气流平衡。
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洗手和着装
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洗手和着装
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洗手和着装
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洗手和着装
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无菌操作—个人防护
• 在实验室工作时必须使用个体防护装备 • 个人衣服和普通实验服不能穿入细胞培养室内 • 实验室内不能穿长摆裙，短裙及短裤，不得在实验室内穿露脚趾的鞋
动物细胞培养技术ppt课件
常用的排除微生物污染的方法
抗生素排除法：采用5～10倍于常用量的冲击法，加入高浓 度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养物，有时可能奏 效。
加温除菌：根据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的 细胞至于41摄氏度作用5～10h（最长可达18h），以杀灭支 原体。
动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或 腹腔内，利用动物的免疫功能消灭污染的微生物，而肿瘤细 胞却能在动物体内继续生长，待一定时间后从体内取出肿瘤 细胞进行培养
2、上皮型细胞：
名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同
来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍 生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤
形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形， 中有圆形核
生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层— 铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个 活动
3、游走细胞型：
呈散在生长，一般不连成片，胞质常 突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规 则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细 胞相区别。
4、多型细胞型：
有一些细胞，如神经细胞难以确定其 规律和稳定的形态，可统归于此类。
（二）悬浮型：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。 胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易 大量繁殖。
(二) 细胞的营养
培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增 殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞 营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还 提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
血清：血清是细胞培养液中最重要的成分之一， 含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养 成分 。
其它成分（条75%酒精泡2—3秒钟 （时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再 用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置 平皿中。
细胞培养技术培训ppt课件版
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下 生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。
细胞在生长期常有1-2个核仁，在细胞机能 状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。
若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等， 表明细胞代谢不良。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
倒 置 显 微 镜
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严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
液 氮 罐
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严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
细胞培养无菌操作
细胞实验考核要点一、准备工作1、清点超净台中仪器物品（垃圾桶、饭盒中三种管、橡胶塞、蓝枪头、移液枪、电子枪、50ml离心管、镊子、剪刀、marker笔、打火机、卫生纸、6孔板、平衡50ml内含1ml离心管），合理布置台面。
2、超净台灭菌：酒精喷洒超净台面，紫外照射20min左右。
3、预热：将PBS、10%FBS、胰酶装进PE手套中，37℃预热备用。
二、实际操作1、点燃酒精灯2、从水浴锅中取出预热的三种液体，喷酒精后放入超净台，用卫生纸擦拭瓶壁酒精。
撕开三个封口膜。
瓶口在外焰烧灼烧，拧松三个瓶盖，以备用。
3、手喷酒精后，旋松并取出T25瓶。
在显微镜下观察细胞长势，若细胞密度达到了80%-90%，则可以进行传代。
注意若显微镜没有人用过，需要在载物台附近喷洒酒精后擦拭。
4、将T25拿到超净台里面。
手进入台面内需酒精喷洒消毒（后不赘述）。
打开吸泵。
5、来回灼烧吸泵铁头。
旋开T25瓶，注意灼烧瓶盖，瓶盖扣放。
铁头插上两个蓝枪头，瓶身倾斜吸去瓶中原培养基。
灼烧瓶盖和瓶口后盖盖，不要盖太紧。
6、取1ml移液枪，将T25竖起来，向未生长细胞的侧壁打入5ml PBS冲洗。
盖盖后左右上下稍移动。
将PBS吸出。
关吸泵！7、向瓶中加入500ul胰酶。
稍混合均匀。
放入培养箱中消化2min。
计时。
8、2min内需完成的操作（1）取出一个50ml离心管。
（2）烧套管：镊子在火上过一下，套管盒稍稍开一小口，用镊子取出一个套管，火上来回灼烧，然后放置在离心管架上。
（3）烧弯头吸管：从烧瓶中用镊子取出一个塞子。
弯头吸管盒稍开一小口，确定是不是塞棉花的一头。
镊子稍稍过火灼烧，开一小口，镊子夹出塞棉花一头，放下镊子，拿出吸管。
盒子放回原处。
将塞子塞入弯头吸管中。
手持塞子来回在火上灼烧，完毕后放入套管中。
9、取出培养箱中消化的细胞，显微镜及肉眼观察消化是否合适。
若在显微镜下看到细胞质壁分离呈球形，大部分细胞已经脱离瓶壁游走在视野中，肉眼观察有白色的成片细胞脱落，说明消化完成。
《无菌技术》ppt课件
利用噬菌体（一种病毒）感染并 杀死细菌的方法。
酶灭菌法
利用酶分解微生物细胞壁或蛋白 质，使其失去活性。
PART 03
无菌技术的实际应用
医疗领域
手术室
无菌技术应用于手术室，确保手 术进程中使用的器械、敷料等物 品的无菌状态，下落术后感染的
风险。
注射与输液
无菌技术应用于注射器和输液器的 生产、储存和使用，确保药物不被 污染，保证患者的安全。
奶制品的无菌处理
奶制品容易受到微生物污染，因此需要进行无菌处理。通 过高温瞬时灭菌、超高压灭菌等技术，可以杀灭奶制品中 的微生物，延长保质期并保证食品安全。
罐头的无菌包装
罐头食品是典型的无菌包装食品之一。通过高温、高压等 工艺，可以在密封的罐头中杀灭所有微生物，使食品长期 保存而不变质。
实验室的无菌技术应用案例
202X-2026
ONE
KEEP VIEW
XXX
XXX
《无菌技术》PPT课 件
XXX
XXX
WENKU
REPORTING
汇报人：XXX
202X-12-录
• 无菌技术的定义与重要性 • 无菌技术的操作方法 • 无菌技术的实际应用 • 无菌技术的挑战与未来发展 • 无菌技术的案例分析
无菌技术应用于方便食品 的生产，如方便面、速冻 食品等，提高产品的卫生 质量。
实验室
微生物实验
无菌技术应用于微生物实验中， 如细菌培养、病毒分离等，确保 实验结果不受外界微生物的干扰
。
细胞培养
无菌技术应用于细胞培养实验中 ，如干细胞培养、肿瘤细胞培养 等，保证细胞的生长和繁育不受
污染。
分子生物学实验
血液透析
无菌技术应用于血液透析机的使用 ，确保血液在循环进程中不受外界 污染，提高透析效果。
酶灭菌法
利用酶分解微生物细胞壁或蛋白 质，使其失去活性。
PART 03
无菌技术的实际应用
医疗领域
手术室
无菌技术应用于手术室，确保手 术进程中使用的器械、敷料等物 品的无菌状态，下落术后感染的
风险。
注射与输液
无菌技术应用于注射器和输液器的 生产、储存和使用，确保药物不被 污染，保证患者的安全。
奶制品的无菌处理
奶制品容易受到微生物污染，因此需要进行无菌处理。通 过高温瞬时灭菌、超高压灭菌等技术，可以杀灭奶制品中 的微生物，延长保质期并保证食品安全。
罐头的无菌包装
罐头食品是典型的无菌包装食品之一。通过高温、高压等 工艺，可以在密封的罐头中杀灭所有微生物，使食品长期 保存而不变质。
实验室的无菌技术应用案例
202X-2026
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XXX
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XXX
WENKU
REPORTING
汇报人：XXX
202X-12-录
• 无菌技术的定义与重要性 • 无菌技术的操作方法 • 无菌技术的实际应用 • 无菌技术的挑战与未来发展 • 无菌技术的案例分析
无菌技术应用于方便食品 的生产，如方便面、速冻 食品等，提高产品的卫生 质量。
实验室
微生物实验
无菌技术应用于微生物实验中， 如细菌培养、病毒分离等，确保 实验结果不受外界微生物的干扰
。
细胞培养
无菌技术应用于细胞培养实验中 ，如干细胞培养、肿瘤细胞培养 等，保证细胞的生长和繁育不受
污染。
分子生物学实验
血液透析
无菌技术应用于血液透析机的使用 ，确保血液在循环进程中不受外界 污染，提高透析效果。
细胞间-无菌操作要点
进入细胞间前
细胞间内操作
（用酒精消毒代替酒精灯灭菌的工作方案）
实验结束整理灭菌
环境清洁：进入细胞间前半小时，超净工作台及细胞间紫外灭菌。
试剂物品进入细胞间需酒精充分消毒。
无菌溶液进入细胞间前检查是否有沉淀、絮状物或变色，如有以上情况，禁止进入细胞间。
无菌服穿戴：隔离衣、帽子、手套、口罩穿戴整齐，(帽子遮盖全部头发、手套需套住袖口)。
物品进入超净台：试剂、培养瓶及废液缸需酒精消毒
培养箱：
1.开门前，在手套及培养箱门上喷酒精；
2.缩短开门时间；减少开门次数
3.开门时细胞间内减少走动，实验室的门应为关闭状态
超净台内(不使用酒精灯，但需严格消毒)：
1.操作区域用酒精擦拭，保持整洁、宽敞，并打开超净台风扇运转通风
2.所有试剂、耗材进入前必须喷洒酒精，并充分擦拭，避免出现死角
10.取用无菌物品须用无菌持物钳（若持物钳污染，酒精棉球消毒后使用）
11.废液缸应放在远离操作区的最右侧靠外位置(弃废液动作轻柔，棉球擦拭载物台
2.观察完毕后，关闭显微镜
分类整理用品
1.试剂开封使用完，盖好盖子，封口膜封口
2.废液缸倾倒
3.隔离衣展开放置
离开前检查：
1.超净台是否关闭、台面是否恢复原样
2.显微镜、水浴锅是否关闭
3.恒温箱门是否关紧
3.无菌持物钳等工具在使用前紫外灭菌
4.无菌物品一经取出，即使未用，也不可放回。
5.手及袖口不能在无菌容器上方经过。
6.枪头盒随用随关
7.无菌容器盖的内面朝上放置于台面或拿于手中
8.任何液体（特别是培养基）洒落在器械或工作台上，应及时用酒精棉擦拭；瓶口外侧有试剂滴落，也应用酒精棉擦拭干净
细胞间内操作
（用酒精消毒代替酒精灯灭菌的工作方案）
实验结束整理灭菌
环境清洁：进入细胞间前半小时，超净工作台及细胞间紫外灭菌。
试剂物品进入细胞间需酒精充分消毒。
无菌溶液进入细胞间前检查是否有沉淀、絮状物或变色，如有以上情况，禁止进入细胞间。
无菌服穿戴：隔离衣、帽子、手套、口罩穿戴整齐，(帽子遮盖全部头发、手套需套住袖口)。
物品进入超净台：试剂、培养瓶及废液缸需酒精消毒
培养箱：
1.开门前，在手套及培养箱门上喷酒精；
2.缩短开门时间；减少开门次数
3.开门时细胞间内减少走动，实验室的门应为关闭状态
超净台内(不使用酒精灯，但需严格消毒)：
1.操作区域用酒精擦拭，保持整洁、宽敞，并打开超净台风扇运转通风
2.所有试剂、耗材进入前必须喷洒酒精，并充分擦拭，避免出现死角
10.取用无菌物品须用无菌持物钳（若持物钳污染，酒精棉球消毒后使用）
11.废液缸应放在远离操作区的最右侧靠外位置(弃废液动作轻柔，棉球擦拭载物台
2.观察完毕后，关闭显微镜
分类整理用品
1.试剂开封使用完，盖好盖子，封口膜封口
2.废液缸倾倒
3.隔离衣展开放置
离开前检查：
1.超净台是否关闭、台面是否恢复原样
2.显微镜、水浴锅是否关闭
3.恒温箱门是否关紧
3.无菌持物钳等工具在使用前紫外灭菌
4.无菌物品一经取出，即使未用，也不可放回。
5.手及袖口不能在无菌容器上方经过。
6.枪头盒随用随关
7.无菌容器盖的内面朝上放置于台面或拿于手中
8.任何液体（特别是培养基）洒落在器械或工作台上，应及时用酒精棉擦拭；瓶口外侧有试剂滴落，也应用酒精棉擦拭干净
细胞培养—无菌操作
细胞培养—无菌操作细胞培养是一种常见的生物技术操作，可以用来研究细胞的生理功能、细胞的增殖和分化以及生物化学反应等。
在进行细胞培养时，无菌操作至关重要，因为细胞非常容易受到外部微生物的污染，从而影响实验结果的准确性。
下面将介绍细胞培养的无菌操作步骤。
1.准备工作在进行细胞培养之前，需要准备好以下工具和试剂：-培养皿：使用符合实验要求的培养皿，常见的有培养瓶、细胞培养板等。
-培养基：根据实验需要选择适当的培养基，例如DMEM、RPMI-1640等。
-无菌操作台：无菌操作台提供一个无菌的工作环境，可以防止微生物的污染。
-显微镜：显微镜可以用来观察细胞的形态和增殖情况。
-移液器和吸头：用于移液操作，需要保持无菌。
-无菌培养液：例如乙醇、连苯三氯和消毒液等。
-消毒器材：例如灭菌器、高压蒸汽灭菌器和紫外线灭菌器等。
2.准备培养皿和培养基将培养皿放入无菌操作台的工作区域内，通过高压蒸汽灭菌器或紫外线灭菌器对培养皿进行灭菌处理，确保其表面无菌。
然后用无菌移液器加入适量的培养基到培养皿中，根据实验需要选择适当的培养基。
3.细胞接种将需要进行细胞培养的细胞按照预定的密度接种到培养皿中。
在进行细胞接种前，需要将细胞培养液中的细胞进行离心，去掉上清液，然后用适量的培养基将细胞悬浮液稀释到适当的细胞密度。
在接种细胞时需要注意，避免将培养皿的口部接触到任何表面，以免引入微生物污染。
4.细胞培养将接种好的细胞培养皿放入细胞培养箱或培养箱中进行培养，保持适当的温度和湿度。
通常将细胞培养箱设置在37摄氏度，5%二氧化碳的环境中，以模拟人体体内的条件。
在细胞培养过程中需要定期检查细胞的状态，观察细胞的形态和增殖情况。
5.细胞培养的无菌操作在培养细胞的整个过程中，需要保持无菌操作。
在进行任何操作之前，需要在无菌操作台上烧毁以杀死细菌和真菌。
接种细胞、更换培养基、观察细胞等一系列操作都需要在无菌操作台上进行，以减少细胞受到外部污染的机会。
无菌技术ppt课件
实验和治疗过程的安全性。
保障医疗质量
无菌技术应用于医疗、实验室和 制药等领域，通过减少或消除微 生物污染，保障医疗质量和产品
安全。
减少感染风险
无菌技术的目的是减少或消除感 染的风险，保护患者和医务人员
的健康，提高医疗服务质量。
无菌技术的重要性
防止感染
无菌技术能有效防止手术或治疗过程中的微生物污 染，降低感染风险。
空气质量监控
02 使用空气过滤器等设备，监控无菌区域内的空气质量，确保符合无菌要求。
人员进出管理
03 严格控制人员进出无菌区域，确保进入人员经过适当的消毒和防护措施。
03
无菌技术在医疗 行业中的应用
手术室的无菌管理
环境清洁与消毒
定期清洁手术室，保持无尘无 菌，对手术器械和物品进行灭
菌处理。
手术人员卫生
微生物实验的无菌技术
通过严格的操作流程和无菌器具的 使用，减少实验中的微生物污染风 险。
无菌技术确保微生物实验结果的准 确性和可靠性，避免假阳性或假阴 性的出现。
无菌技术保护实验者免受有害微生 物的感染，确保实验人员的安全和 健康。
防止污染
确保准确性
保护实验者
细胞培养的无菌要求
01 无菌操作环境
。
02
操作复杂性
无菌操作需要高度的技术 水平和专业知识，不易普 及和推广。
03
高成本
无菌技术需要大量的设备 和资源支持，成本较高， 不适用于所有情况。
无菌技术的创新与发展
01 创新技术
介绍新型无菌技术，如紫外线消毒、纳米乐超滤等技术， 为无菌操作提供更高效、安全的方法。
无菌技术ppt 课件
汇报人：XXX
01
无菌技术概述
保障医疗质量
无菌技术应用于医疗、实验室和 制药等领域，通过减少或消除微 生物污染，保障医疗质量和产品
安全。
减少感染风险
无菌技术的目的是减少或消除感 染的风险，保护患者和医务人员
的健康，提高医疗服务质量。
无菌技术的重要性
防止感染
无菌技术能有效防止手术或治疗过程中的微生物污 染，降低感染风险。
空气质量监控
02 使用空气过滤器等设备，监控无菌区域内的空气质量，确保符合无菌要求。
人员进出管理
03 严格控制人员进出无菌区域，确保进入人员经过适当的消毒和防护措施。
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无菌技术在医疗 行业中的应用
手术室的无菌管理
环境清洁与消毒
定期清洁手术室，保持无尘无 菌，对手术器械和物品进行灭
菌处理。
手术人员卫生
微生物实验的无菌技术
通过严格的操作流程和无菌器具的 使用，减少实验中的微生物污染风 险。
无菌技术确保微生物实验结果的准 确性和可靠性，避免假阳性或假阴 性的出现。
无菌技术保护实验者免受有害微生 物的感染，确保实验人员的安全和 健康。
防止污染
确保准确性
保护实验者
细胞培养的无菌要求
01 无菌操作环境
。
02
操作复杂性
无菌操作需要高度的技术 水平和专业知识，不易普 及和推广。
03
高成本
无菌技术需要大量的设备 和资源支持，成本较高， 不适用于所有情况。
无菌技术的创新与发展
01 创新技术
介绍新型无菌技术，如紫外线消毒、纳米乐超滤等技术， 为无菌操作提供更高效、安全的方法。
无菌技术ppt 课件
汇报人：XXX
01
无菌技术概述
细胞组织培养技术PPT幻灯片
过程
动物细胞培养应用
❖ 大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干 扰素、单克隆抗体）
❖ 作为基因工程中的受体细胞 ❖ 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，
判断某种物质的毒性 ❖ 为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依
据
植物胞具有全能性 这个理论，近几十年来发展起来的一项无性 繁殖的新技术。植物的组织培养广义又叫离 体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。 器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作， 在人工控制条件下进行培养以获得再生的完 整植株或生产具有经济价值的其他产品的技 术。
应用
❖ 在农业领域中的应用 自六十年代后期起，植物组织培养技术得到 了迅猛的发展，在农业上的应用主要包括以 下几个方面： 植物种质资源的保存、植物种质资源的创新、 植物优良品种的快繁、 应用植物培养细胞生 产次生代谢物
细胞培养的主要优点
➢ 可提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象， 比较经济，方便
➢ 可消除其他外界因素的影响，对疫苗生产来说其 抗原性更接近于自然流行株
➢ 可减少宿主蛋白成分，减少变态反应
细胞培养的基本条件
❖ 接种细胞量 ❖ 培养液 ❖ 氢离子浓度及气体条件 ❖ 温度 ❖ 无菌条件和培养器皿的清洁
另外，在培养液中加入氢离子缓冲剂，如 HEPES可使培养液有较强的缓冲能力。
温度
细胞培养的最适温度与细胞来源的动物 体温一致，温度增加2—3℃对细胞产生不 良影响，低温对细胞影响较小
无菌条件
细胞培养技术的关键之一是防止 污染，在细胞培养中，可能发生 污染的来源有： ➢组织培养液 ➢器皿 ➢组织本身 ➢工作者本身 ➢空气
度
酸碱度
细胞生长最宜的PH范围是7.0—7.4。细胞可忍 受较大的范围PH变化（PH6.6—7.8）培养环境偏酸 较偏碱更宜于细胞贴壁。培养液中的缓冲体系主要 是碳酸氢盐、磷酸氢盐和血清。其中碳酸氢盐/CO2 为主要的缓冲体系，如使用CO2孵箱，能提供稳定 的5%CO2，可自动调节细胞代谢引起的PH改变。
细胞培养无菌操作技术
一清洗一清洗在组织细胞培养中体外细胞对任何有害在组织细胞培养中体外细胞对任何有害物质都非常敏感物质都非常敏感均能影响培养细胞的生长均能影响培养细胞的生长微生物产品附带杂物微生物产品附带杂物上次细胞残留物上次细胞残留物非营养成分的化学物质非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗胶塞的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗塑料制品的清洗包括包括浸泡刷洗浸酸浸泡刷洗浸酸和和冲洗冲洗四个步骤四个步骤清洗后的玻璃器皿清洗后的玻璃器皿干净透明无油迹干净透明无油迹不能残留任何物质不能残留任何物质初次使用和培养使用后的玻璃器皿初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡以使附着物软化或被均需先用清水浸泡以使附着物软化或被新的初次使用的玻璃器皿在生产及运新的初次使用的玻璃器皿在生产及运输过程中玻璃表面带有大量的干固的输过程中玻璃表面带有大量的干固的灰尘且玻璃表面常呈碱性及带有一些灰尘且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等对细胞有害的物质等先用自来水简单刷洗然后用先用自来水简单刷洗然后用55酸液浸泡过夜中和其中的碱性物质酸液浸泡过夜中和其中的碱性物质再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质干固后不易洗掉用过的蛋白质干固后不易洗掉用后立即浸入水中要求完全浸入用后立即浸入水中要求完全浸入不能留有气泡或浮在液面上不能留有气泡或浮在液面上用毛刷沾洗涤剂刷洗以除去器皿表面附用毛刷沾洗涤剂刷洗以除去器皿表面附着较牢的杂质着较牢的杂质刷洗要适度过度会损害器皿表面光泽度刷洗要适度过度会损害器皿表面光泽度
❖ 塑料制品现多采用无毒并已特殊处理的包 装，打开包装即可用，多为一次性物品
❖ 清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗， 浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃ 清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁 液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏 水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备 用。
❖ 塑料制品现多采用无毒并已特殊处理的包 装，打开包装即可用，多为一次性物品
❖ 清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗， 浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃ 清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁 液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏 水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备 用。
细胞培养技术ppt课件
-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装或使用。
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二、培养细胞相关条件
（三）细胞培养用试剂
血清解冻后发现有絮状物出现，该如何处理?
原因：脂蛋白的变性；
血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一） 在血清解冻后，也会存在于血清中，也是造成 絮状物的主要原因之一。这些絮状物的产生不 会影响血清本身的质量。
二级：提供工作人员、环境和产品的保护。
A（A1和A2）
B（B1和B2）
三级：生物安全3、4级实验室用。
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生物安全柜
ESCO ppAt课C件2完-整4S1
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生物安全柜
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三级生物安全柜
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10
二、培养细胞相关条件
3.相关仪器设备 （1）CO2培养箱 （2）倒置显微镜、普通显微镜及照相系统 （3）冰箱（4度，-20度，-80度） （4）超纯水系统（电阻率≥ 18.2MΩ.cm ） （5）细胞存储器（液氮罐，深低温冰箱、-80
清，胎牛血清本身是需要穿刺取血的，而国内都是 剖腹产出胎牛，8小时左右取血，然后，进行过滤 分装。
5、其他血清 新生牛血清，小牛血清，一般国产的。
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二、培养细胞相关条件
（三）细胞培养用试剂 （2）血清
使用：5 ～ 20%。 保存：–20～-70℃储存；
4℃存放勿超过一个月。 解冻步骤：
去除方法：可以将血清分装至无菌离心管
内，以400g 稍微离心，将上清液加入培养基内
一起过滤。我们不建议您直接过滤血清以去除
这些絮状物，因为它可能会阻塞过滤膜。
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二、培养细胞相关条件
（三）细胞培养用试剂
血清解冻后发现有絮状物出现，该如何处理?
原因：脂蛋白的变性；
血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一） 在血清解冻后，也会存在于血清中，也是造成 絮状物的主要原因之一。这些絮状物的产生不 会影响血清本身的质量。
二级：提供工作人员、环境和产品的保护。
A（A1和A2）
B（B1和B2）
三级：生物安全3、4级实验室用。
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生物安全柜
ESCO ppAt课C件2完-整4S1
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生物安全柜
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三级生物安全柜
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二、培养细胞相关条件
3.相关仪器设备 （1）CO2培养箱 （2）倒置显微镜、普通显微镜及照相系统 （3）冰箱（4度，-20度，-80度） （4）超纯水系统（电阻率≥ 18.2MΩ.cm ） （5）细胞存储器（液氮罐，深低温冰箱、-80
清，胎牛血清本身是需要穿刺取血的，而国内都是 剖腹产出胎牛，8小时左右取血，然后，进行过滤 分装。
5、其他血清 新生牛血清，小牛血清，一般国产的。
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二、培养细胞相关条件
（三）细胞培养用试剂 （2）血清
使用：5 ～ 20%。 保存：–20～-70℃储存；
4℃存放勿超过一个月。 解冻步骤：
去除方法：可以将血清分装至无菌离心管
内，以400g 稍微离心，将上清液加入培养基内
一起过滤。我们不建议您直接过滤血清以去除
这些絮状物，因为它可能会阻塞过滤膜。
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细胞培养基本技术PPT课件
细胞培养基本技术ppt课件
目录
• 细胞培养技术简介 • 细胞培养的基本条件 • 细胞培养的常用技术 • 细胞培养的实验操作 • 细胞培养的注意事项与安全防护
01 细胞培养技术简介
细胞培养技术的定义
细胞培养技术是指将活体组织或细胞 从生物体中分离出来，在模拟体内环 境的条件下，进行培养、繁殖和维持 生命活动的一种技术。
有特定功能的细胞。
细胞克隆技术的优点是能够筛 选出具有特定功能的细胞，缺 点是需要花费大量时间和精力
进行筛选。
细胞融合技术
细胞融合技术是通过将两个或多个细 胞融合成一个新的细胞，用于生产单 克隆抗体、制备杂交瘤细胞等。
细胞融合技术的优点是能够制备出具 有两个或多个细胞特性的杂交瘤细胞， 缺点是需要筛选出具有所需特性的杂 交瘤细胞。
染条件。
04 细胞培养的实验操作
细胞接种与扩大培养
细胞接种
将少量细胞悬液加入培养容器中，轻 轻旋转使细胞均匀分布。
扩大培养
将已生长的细胞从原培养容器中取出 ，按比例加入新鲜培养基，继续培养 。
细胞的观察与检测
细胞形态观察
定期观察细胞形态变化，如生长状态、分裂速度等。
细胞数量与密度检测
使用细胞计数板或流式细胞仪测定细胞数量和密度。
传代细胞培养需要定期进行细胞 分裂和繁殖，以维持细胞的生长
和生产能力。
传代细胞培养的优点是能够大量 生产具有相同特性的细胞，缺点 是细胞的生长和生产能力会随着
传代次数的增加而降低。
细胞克隆技术
细胞克隆技术是通过将单个细 胞培养成一个个独立的群体， 用于筛选具有特定功能的细胞。
细胞克隆技术需要使用适当 的筛选方法来识别和分离具
细胞识别与鉴定
目录
• 细胞培养技术简介 • 细胞培养的基本条件 • 细胞培养的常用技术 • 细胞培养的实验操作 • 细胞培养的注意事项与安全防护
01 细胞培养技术简介
细胞培养技术的定义
细胞培养技术是指将活体组织或细胞 从生物体中分离出来，在模拟体内环 境的条件下，进行培养、繁殖和维持 生命活动的一种技术。
有特定功能的细胞。
细胞克隆技术的优点是能够筛 选出具有特定功能的细胞，缺 点是需要花费大量时间和精力
进行筛选。
细胞融合技术
细胞融合技术是通过将两个或多个细 胞融合成一个新的细胞，用于生产单 克隆抗体、制备杂交瘤细胞等。
细胞融合技术的优点是能够制备出具 有两个或多个细胞特性的杂交瘤细胞， 缺点是需要筛选出具有所需特性的杂 交瘤细胞。
染条件。
04 细胞培养的实验操作
细胞接种与扩大培养
细胞接种
将少量细胞悬液加入培养容器中，轻 轻旋转使细胞均匀分布。
扩大培养
将已生长的细胞从原培养容器中取出 ，按比例加入新鲜培养基，继续培养 。
细胞的观察与检测
细胞形态观察
定期观察细胞形态变化，如生长状态、分裂速度等。
细胞数量与密度检测
使用细胞计数板或流式细胞仪测定细胞数量和密度。
传代细胞培养需要定期进行细胞 分裂和繁殖，以维持细胞的生长
和生产能力。
传代细胞培养的优点是能够大量 生产具有相同特性的细胞，缺点 是细胞的生长和生产能力会随着
传代次数的增加而降低。
细胞克隆技术
细胞克隆技术是通过将单个细 胞培养成一个个独立的群体， 用于筛选具有特定功能的细胞。
细胞克隆技术需要使用适当 的筛选方法来识别和分离具
细胞识别与鉴定
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生物安全柜
? 生物安全柜一般是做致病菌，霉菌，酵母菌，病毒来用，操作区域 是负压，简单说是往上处抽风的，当然致病菌也不是直接抽出排到 室外，是过滤在生物安全柜的顶部漏器上，从排风量上可以分为， 50%外排型，75% 以及100%外排型。在生物安全柜内所形成的几乎 没有微生物的环境中，尽量避免使用明火，酒精灯的火焰可能会影 响室内的气流平衡。
消毒
? 新洁尔灭消毒液 ? 原理：新洁尔灭灭菌原理为破坏细胞膜、改变其渗透性而起杀菌作用
? 84消毒液 ? 84消毒液是一种以次氯酸钠为主的高效消毒剂，主要成分是次氯酸钠， 次氯酸钠的漂白性是其与水反应生成的次氯酸所带来的，因次氯酸具 有极强的氧化性，能够将大多数物质氧化，使其变性，因而能起到消 毒作用
消毒
? 75%酒精消毒原理
? 酒精之所以能消毒是因为酒精能够吸收细菌蛋白的水分，使其脱水变 性凝固，从而达到杀灭细菌的目的。如果使用高浓度酒精，对细菌蛋 白脱水过于迅速，使细菌表面蛋白质首先变性凝固，形成了一层坚固 的包膜，酒精反而不能很好地渗入细菌内部，以致影响其杀菌能力。 75%的酒精与细菌的渗透压相近，可以在细菌表面蛋白未变性前逐渐不 断地向菌体内部渗入，使细菌所有蛋白脱水、变性凝固，最终杀死细 菌，酒精浓度低于75%时，由于渗透性降低，也会影响杀菌能力。
超净工作台
? 超净台是做一般对人体没有直接伤害的 常规细菌的操作实验，正压送风，工作 台工作区域的气流形成为水平层流型。 区内空气经初效过滤器过滤后，由风机 压入静压箱，再经高效过滤器过滤，由 此送出的洁净气流，以一定的均匀断面 风速通过操作区将尘埃颗粒带走，从而 形成高洁净的工作环境。超净空气的流 速为２４～３０ｍ／ｍｉｎ，这已足够 防止附近空气可能袭扰而引起的污染， 这样的流速也不会妨碍采用酒精灯或本 生灯对器械等的灼烧消毒
细胞培养之无菌操作
目录
实验器具和材料的准备 培养室的消毒 洗手和着装 无菌操作 污染及防治
? 无菌 ? 定义：对一个环境所谓的无菌，是指在环境中一切有生命活动的微生物的营养 细胞及其芽胞或孢子都不存在
? 无菌技术 ? 定义：无菌技术是细胞工程的基本技术包括实验器具和材料的准备、培养室和 超净台的消毒、洗手和着装、无菌操作等
无菌操作—器皿的消毒
? 所有用到的器皿（买时已灭菌的除外）都必须经过高压灭 菌烘干后才能放入超净台内
? 已灭菌的、外包装完好的培养瓶、离心管、冻存管等可以 表面经75%酒精擦拭后直接放入超净台
? 凡是带入超净工作台内的酒精、 PBS、培养基、胰蛋白酶的 瓶子均要用 75％酒精擦拭瓶子的外表面
无菌操作—细胞处理
? B级：指无菌配制和灌装等高风险操作A级洁净区所处的背景区域。
? C级和D级：指无菌药品生产过程中重要程度较低操作步骤的洁净区。
实验器具和材料的准备
? 在开始实验前要制定好实验计划和操作计划，有关数据的计算要事先 做好。根据实验要求，准备各种所需耗材物品及试剂，清点无误后将 其放置在操作场所进行消毒处理。
球擦拭超净工作台的台内、边台的台面、倒置显微镜的载物台等 ? 实验所用物品尽可能一次性准备好，避免多次出入
洗手和着装
实验人员进入净化车间流程：非净化区域 →换拖鞋→进 入更衣室→放个人物品→洗手烘干→戴上帽子→消毒双手
→进入更衣室→穿净化服→穿净化鞋→戴口罩→戴手套
洗手和着装
洗手和着装
洗手和着装
? 凡是需要带入安全柜（超净台）的培养基、胰酶、培养皿（培养瓶） 等耗材和试剂在经过消毒处理之后再用75%的酒精棉球擦拭表面。
培养室的消毒
? 进入无菌实验室前先穿好无菌服、戴帽子及口罩 ? 无菌实验室每周用0.2%的新洁尔灭拖洗地面、粘尘杆去除灰尘，再用
臭氧消毒 ? 室内台面要保持洁净，做完实验后用75％酒精或千分之三新洁尔灭棉
? 意义：因体外培养细胞没有抗感染能力，防止污染则是决定培养成功与否的首 要条件，即便是在设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范， 也会导致污染。为在一切操作中尽可能保证无菌，每一项工作我们都必须做到 有条不紊和完全可靠。
? 消毒灭菌 ? 消毒：是指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。通常用化学的 方法来达到消毒的作用。用于消毒的化学药物叫做消毒剂。
洁净级别—无菌药品生产所需的洁净 区可分为4个级别
? A级：高风险操作区，如灌装区、放置胶塞桶和与无菌制剂直接接触 的敞口包装容器的区域及无菌装配或连接操作的区域，应当用单向 流操作台（罩）维持该区的环境状态。单向流系统在其工作区域必 须均匀送风，风速为0.36-0.54m/s（指导值）。应当有数据证明单向 流的状态并经过验证。在密闭的隔离操作器或手套箱内，可使用较 低的风速。
无菌操作—个人防护
? 在实验室工作时必须使用个体防护装备 ? 个人衣服和普通实验服不能穿入细胞培养室内 ? 实验室内不能穿长摆裙，短裙及短裤，不得在实验室内穿露脚趾的鞋
子 ? 实验室内严禁处理和配戴眼镜 ? 严禁穿着细胞培养室专用防护服离开实验
? 超净台经过 30min紫外灭菌后，才能打开通风装置
? 开始工作的第一步就是点燃酒精灯，之后的一切操作都需 在火焰近处并经过烧灼进行，动作要轻、准确，不能乱碰。 如吸管不能碰到废液缸，继续使用的器皿（如瓶盖、滴管） 要放在高处，使用时仍要过火
? 灭菌：杀灭或除去特定环境或物品中一切微生物的过程。目前标准规定，灭菌 过程必须使灭菌物品污染的微生物存活率减少到10-6及以下。
消毒剂种类
? 依据化学成分主要分为9种 ? 醛类消毒剂 ? 杂环类消毒剂 ? 含氯消毒剂 ? 过氧化物类消毒剂 ? 含碘消毒剂 ? 季铵盐类消毒剂 ? 酚类消毒剂 ? 胍类消毒剂 ? 醇类消毒剂 ? 重金属类消毒剂 ? 生物类消毒剂
? 超净工作台台面每次实验前要用 75%酒精擦洗，然后用紫外 线消毒 30min
? 在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫 外线
? 消毒时工作台面上用品不可过多堆放，否则会遮挡射线降 低消毒效果
? 一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用 75% 酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒