ATP荧光技术检测细菌生长

ATP荧光技术检测细菌生长

ATP荧光法是根据萤火虫发光原理开发的快速检测技术。萤火虫会发光是由于它能合成将化学物质的化学能转变为光能的生物催化剂，萤火虫荧光素酶（简称虫光素酶，luciferase）、虫荧光素（D-luciferin）以及ATP(三磷酸腺苷，所有细胞生物都能产生的能源物质)。在有

氧条件下，虫荧光素酶催化虫荧光素生成氧化荧光素并发出荧光。如果具备上述条件，即使在萤火虫体外的系统也可以发出荧光。早在20世纪50年代末，美国太空总署就已经利用

萤火虫荧光素酶建立了快速超微量ATP检测技术，60年代末曾对地球土壤样本的ATP进行了检测，并分别在日后探测月球、火星是否存在生命中得到应用。基于虫光素酶的ATP检

测商业应用则始于80年代后期。最初，是通过养殖萤火虫幼虫获得虫光素酶，随着基因工程技术的发展和应用，科学家从萤火虫细胞中取出编码萤火虫酶的基因，并将其引入细菌细胞。这样，通过生物发酵在短短的十几个小时内就可以得到大量的虫光素酶。

2003年沈阳中科靓马引入由中科院发育所金振华教授发明的“含荧光素酶基因的新型菌株及虫光素酶的生产”专利项目，经过几年的产业化探索，终于在2005年后开始批量生产

拥有自主知识产权的虫光素酶、虫荧光素制剂，并于2007年完成相关检测产品的配套，实现了食品样品的细菌总数快速检测。基于虫光素酶的ATP荧光检测原理虫光素酶只有在ATP 存在时才会催化虫荧光素发生反应，并产生荧光。因此，如果在虫光素酶、虫荧光素过量的情况下，萤光强弱将只取决于反应系统中ATP的数量。以样品中细菌检测为例，细胞数越多，ATP数量也越多，发出的荧光就越强。也就是说，在特定条件下，荧光值与ATP的数

量是呈线性相关的；而且，荧光值很容易通过光度计准确计量。所以，在排除样品中非细菌ATP干扰的情况下，只要得到相对荧光值和细菌细胞数的关系曲线，然后根据纯ATP的相

对荧光值与细胞数的标准曲线，就能快速确定样品中细菌的细胞数。

ATP快检系统的组成部件及其作用目前，依据萤火虫发光原理并用于生物量、酶和代谢产物检测的应用系统已经有很多种。尽管各类检测系统的应用目的、操作方法、样品来源各不相同，但在组成上都包括以下几个部分。

1．试剂系统试剂系统包括促使荧光反应发生所需的所有反应试剂和ATP有效提取试剂。具体包括体细胞裂解试剂组、细菌细胞裂解试剂组和荧光反应试剂组。体细胞裂解试剂组可以专一有效地裂解样品中的非细菌细胞（体细胞）并释放ATP出ATP，然后通过过滤比色

杯底部的滤膜将其排除。细菌细胞裂解试剂组主要作用是，有效地裂解细菌细胞并释放出ATP以便检测。同时，为了避免ATP降解而影响检测结果的真实性，细菌细胞裂解试剂应能使ATP降解的酶迅速失活。荧光反应试剂组则包括能与样品中细菌ATP相互作用并发出荧光的虫萤光素和虫光素酶。

2．取样器及样品预处理装置该部分包括可以定量取得不同物理状态待检样品的取样器，用于加压排出体细胞ATP的加压器、供反应用的带膜比色杯，杯架以及用于样品浓缩的专

用浓缩器等。

3．微量光度计微量光度计，即微量荧光检测仪器。按具体需要，光度计除了用于计量、显示荧光值的屏幕外，还具备与个人电脑或自动打印机联用的外接口，以便记录、储存有关数据资料以供产品质量或卫生监控趋势分析。

ATP快速检测技术的优势一般来说，要实现快速检测有赖于待检样品在反应过程能够产生易于检测的声、光、磁等信号。ATP荧光快速检测就是由于产生了容易检测的荧光而实现的。在卫生监测方面，它具有常规检测无法比拟的优势。实践和文献资料都表明，用快检系统检测到的荧光值，即总ATP值（指来自细菌和事物残渣两部分的ATP）作为卫生监测指标，无论是“时效性”或实际效果都大大优于通过目测或细菌平皿计数的效果。因此，有观点认为，可以用ATP的总量作为判断卫生状况是否良好的一个标准。

1．快速、准确常规平皿计数法检测细菌总数，是让细菌在LB培养基上培养成肉眼可见的细菌菌落。由于样品稀释不均等原因，一个菌落往往由两个或多个细菌细胞构成，而且LB培养基只适合需氧或半需氧细菌的生长。因此，只能得到此类细菌的数量。采用ATP荧光快检法可检测到所有细菌、真菌和藻类，且1-5分钟即可得到实时检测结果，操作简单，时间短。平皿计数法则需要1-5天，所得结果难以反映实际卫生状况。

2．样品量少由于虫光素酶对ATP的反应非常灵敏，通过发光反应能够检测低于0.1皮克分子（10-12mol）ATP，因此，可用于低细菌含量样品的检测。例如经过0.45um膜过滤除菌后的啤酒细菌含量很低，不是常规方法所能检测出的，而通过ATP荧光法的浓缩处理可以检出。ATP快速检测技术的应用“ATP荧光法细菌总数快速检测系统”在全程监测中的应用自20世纪90年代至今，根据萤火虫发光原理研发成功并投放市场的产品已有多种，如中科靓马开发的“ATP荧光法细菌总数快速检测系统”可用于食品、饮料、乳品加工生产的全程监测：在生产加工前，可用于生产设施清洁、消毒效果的检测，原辅料细菌总数的检测；在加工生产过程中，可用于生产设备关键控制点（例如供水、通风阀门）的卫生学监测，影响乳品发酵饮料、酒类特殊微生物总数的检测；在加工生产后，可用于成品污染细菌总数的检测。另外也可用于环保、水政、海关检疫等执法部门对各种样品中微生物（细菌总数）的快速检测。ATP快检在HACCP中的应用通过对食品生产线或周边卫生环境的研究发现，如果用平皿计数法得到的生产线上某点的细菌总数很少或无菌，而通过ATP荧光检测法得到的ATP值很高，那么该检测点在之后容易大量滋生微生物。经过分析后认为，通过ATP荧光检测得到的ATP总值来自残渣和微生物两部分。并且多数情况下，来自微生物的比例较小。因此，可以通过ATP荧光检测的ATP值判断检测点是否会被重新污染，而不必通过依据细菌细胞ATP值折算的细菌菌落总数来判断，但是关键是要确定不同生产线不同检测点的ATP临界值。据此，发达国家已经将ATP荧光法检测用于HACCP中，对食品原料及经过清洁、消毒后的食品原料接触表面是否达到卫生标准做出评估；然后对容易引起微生物污染的关键部位实施重点监控。例如，通过ATP快速检测，可以判断已经达到卫生标准的部位或表面，在常规消毒后到新一轮生产的间歇时间，是否存在污染的可能性；进而制订出既符合本单位情况，又符合卫生要求的ATP数值范围。掌上ATP快速检测仪的应用目前，掌上ATP快速检测仪已经应用于生活的方方面面，在食品方面的应用主要是对饭店、列车上的餐具进行卫生状况的检测。我国铁道部决定，在2008年奥运会之前，将在列车上采用沈阳中科靓马生物工程有限公司掌上快速检测仪代替之前采用间接检测氯离子的方法对餐具进行卫生检测。此外，基于虫光素酶的ATP快速检测还可应用于其它更多领域和目的的检测，如用于自来水检测、桶装水无菌状况的检测、部队野战饮食中炭疽杆菌的检测及环境监测、临床检测等。