第六章植物愈伤组织培养

2、 组织原有的倍数性
Sacristan(1971) 研究指出，供体植株原有的倍数性 在培养细胞多倍化过程中起着重要作用。 比较了在长期培养的还阳参单倍体细胞系和二倍体 细胞系中发生的细胞学变化，发现单倍体组织的二倍化 比二倍体组织的四倍化现象更为常见，表明在培养中处 于二倍体水平上的细胞比处于单倍体水平上的细胞较为 稳定。
因此初生愈伤组织可能是一个异质细胞群，它既反
映了原外植体中的染色体状况，又是愈伤组织诱导期 间核变异的结果。
1、初生愈伤组织
当把外植体接种到人工培养基上以后，细胞核内可 能出现3种不同的过程： ①正常有丝分裂； ②先进行核内复制，然后进行有丝分裂； ③先发生核碎裂（无丝分裂），然后进行有丝分裂。 在愈伤组织和悬浮细胞生长期间，染色体数目还可能 发生进一步变异。一般来说，在愈伤组织和悬浮培养 物中核的状态可以有以下几种类型:二 倍 体 、 多 倍 体 、 单倍体、非整倍体和染色体结构变异体等。
2、培养基
培养基的各种成分及物理性质，都对愈伤 组织的培养和器官发生产生一定影响，但起决 定作用的仍然是植物生长调节剂，特别是生长 素和细胞分裂素的配比。
生长调节剂
细胞分裂素和生长素的比例是控制芽和根形成 的重要条件之一。细胞分裂素和生长素的比例高 时，有利于芽的形成；而比例低时，有利于根的 诱导。这样通过变换激素的种类、浓度和配比， 即可有效地调节培养组织的器官分化。 不同种类的生长素和细胞分裂素，对生根和长 芽的效果是不同的。
第一阶段诱导形成愈伤组织，应在固体琼脂培养基上进行培养； 第二阶段细胞和胚状体的增殖，需在液体培养基中完成； 第三阶段由胚状体发育成可移植的植株，又应转移到固体琼脂培 养基上进行培养。
培养基的渗透压对细胞增殖和胚状体的形成有明显的影响。
无机营养元素
在植物组织培养中与整体植物一样，细胞的生长 也要求满足植物生长的必需元素，若完全缺乏或过 多或不足，也会影响细胞生长和分化。不过其影响 不如激素明显。 各种类型的植物、器官所需要的每种元素的量， 特别是大量元素是有区别的。如生根培养要求无机 离子浓度小一些，所以常用1/2MS或White培养基。 如有些植物要求的氮，以硝酸态形式供应为佳，而 有些植物要求的氮，以铵态氮的形式供应为佳。
4、分化期
分化期 (differentiation stage)是指停止分裂的细胞发 生生理代谢变化，导致形成由不同形态和功能的细胞组 成的愈伤组织。 分化期愈伤组织的主要表现如下： ① 细胞分裂部位和方向发生改变。 ② 分化组织瘤状结构和维管组织的形成。 ③ 细胞的体积不再减小，形成分化时的一个最好开 端，并在此以后，保持相对不变。
1、外植体
③ 年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组 织，而且也容易诱导分化成植株。 如油菜植株的自下而上的茎段培养结果表明， 下部的器官形成频率低，越往上部，苗的分化频率 越高。年龄也有明显影响，年龄越老，当转移到分 化培养基上生长时，其苗分化频率越低。 因此在组织培养中，要及时转移已形成的愈伤 组织进行分化培养，可大大提高苗的分化频率。
第三节 愈伤组织培养条件与定向变异
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植物愈伤组织的培养条件 不同用途愈伤组织的定向诱导 愈伤组织的形态发生方式 愈伤组织培养的具体过程
一、植物愈伤组织的培养条件
1、外植体
不同基因型或同一植株不同部位的细胞外植体在 离体培养中的反应可能不同： ① 材料的基因型对愈伤组织的器官分化有决定性 的影响。 不同植物种的器官分化明显不同，如烟草、胡萝 卜和矮牵牛等植物容易诱导器官形成，而禾谷类、 豆类、棉花等就比较困难。 ② 通常同一种植物的不同器官或组织所形成的愈 伤组织，在生理和形态上的差别都不大，但有些植 物情况不同。
三、植物愈伤组织的形成过程
从单细胞或一块外植体形成典型的愈伤组织，大 致要经历4个时期:
诱导期 分裂期 形成期 分化期
1、诱导期 (起动期)
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诱导期 (induction stage)是细胞准备进行分裂的 时期,通过一些刺激因素和激素的诱导作用，使处 在静止状态的细胞合成代谢活动加强，迅速进行 蛋白质和核酸物质的合成。此期间细胞的大小变 化不大。
3、形成期
若诱导条件不同，愈伤组织的形态和物理性质也有 一定的变化，有的紧密坚实，有的疏松脆弱。加入高 浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆;反 之，减低或除去生长物质，则松脆愈伤组织可以转变 为坚实。 松脆的愈伤组织是进行悬浮培养最适合的材料，稍 经机械振荡，即可使组织分散成单细胞或由少数几个 细胞组成的小细胞团，在培养中细胞迅速增殖； 而坚实愈伤组织中的细胞间被果胶质紧紧地粘着， 因而往往不能形成良好的悬浮系统。
2、建成愈伤组织
就染色体数来说，在培养的愈伤组织细胞中异常现 象主要有2种类型： ① 整倍性 增加的染色体数是基本染色体数的整倍数 (2n，3n，4n，5n等) ② 非整倍性 细胞所具有的染色体数不是基本染色体数的整倍数 （如2n-1，2n-2，2n+1，2n+2等）。
在组织培养中，由于选择作用的结果，在最终形成 的细胞群体中占优势的只是一种主要的核型，即一种 染色体数。这种选择作用受培养基成分和培养类型的 影响，同时也受到一个异质群体中细胞间的竞争和互 作的影响。 Smith和Street(1974) 把取自生长速率相同的胡萝卜 二倍体细胞系和四倍体细胞系的细胞等数混合，混合 后经反复继代培养，四倍体细胞的频率不断增加，最 后整个培养物都成了四倍体的细胞系。
植物愈伤组织的形态结构
优良的愈伤组织通常必须具备以下特性:
⑴ 高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织
得到再生植株。
⑵ 容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮 系，并且在需要时能从中分离出全能性原生质体。
⑶ 旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立
大规模的愈伤组织无性系。 ⑷ 经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对 它们进行各种遗传操作。
二、影响愈伤组织变异的因子
在离体培养中，愈伤组织细胞的核型变异受 许多因素影响，组织自身的变异倾向是一方 面，另外还有若干其他因子，其中最重要的是 培养基成分。
1、培养基
① 培养基成分的化学成分 Toney(1961)曾经指出，通过改变培养基成分，可以 有选择地诱导和保持倍性较高的细胞的分裂。在只加 2,4-D的培养基上，豌豆根段培养物中二倍体细胞发生 分裂，但当培养基中除2,4-D之外还含有激动素和酵母 浸出液时，则能有选择地诱导四倍体细胞发生分裂。 激动素和酵母浸出液也能提高多倍体细胞有丝分裂的 频率。 ② 培养基的物理状态 有研究表明，在悬浮培养的条件下，选择压有利于二 倍体细胞，而在半固体培养的条件下，四倍体细胞出 现的频率较高。
愈 伤 组 织
愈伤组织诱导不定芽
不定芽的生根培养
二、植物愈伤组织的形态结构
愈伤组织是许多异质细胞集合而成的一个无一定形 态结构的细胞聚集体。根据其性质和细胞组成的特 点，可以分为致密和松脆两种结构类型。 松脆愈伤组织都有大量的分生组织中心，进行活跃 的细胞分裂，愈伤组织内有大量的细胞间隙，细胞排 列完全无序。 坚实致密愈伤组织内无大的细胞间隙，而由管状细 胞组成维管组织。
诱导期的长短和诱导分裂的难易程度，因植物 种类、外植体的生理状况和外部因素而异。 外源生长调节物质对诱导细胞开始分裂效果最 好，最常用的有2,4-D、NAA、IAA和细胞分裂素 等。
•பைடு நூலகம்
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2、分裂期
分裂期 (division stage) 是不断增生子细胞的过程。 其特征是:细 胞 分 裂 快 ， 结 构 疏 松 ， 缺 少 有 组 织 的 结 构，颜色浅而透明。主要表现如下:
四、植物愈伤组织的继代培养
一般在愈伤组织长到直径2～3cm时才将其与外植体分 离，单独培养，并将其切成4-8个小块继续培养，此即继代 培养。用继代培养维持愈伤组织生长，是长期保存愈伤组 织的一种方法。 继代培养可选取生长迅速的部位。从外表看，生长迅速 的愈伤组织多呈浅色、质地松散。若要进行愈伤组织的分 化和再生，则应选生长较慢的愈伤组织。 每二次继代培养的时间取决于愈伤组织的生长速度。一 般可在4-6周继代一次。
有机成分
在培养基中加了糖、硫胺素、烟酸、吡哆素、肌醇和 甘氨酸等，可以满足愈伤组织的生长和分化的要求。糖 不仅可作为碳源，而且也是培养基渗透调节剂。各种氨 基酸和生物活性物质，可以促进愈伤组织生长和向器官 分化。在组织培养过程中加一些植物器官的汁液，也常 常产生良好的效应。
物理性质
培养基的物理性质 (固体状态或液体状态，渗透压和pH 值)对形态发生有明显的影响。 在胡萝卜和石刁柏的培养过程中，需要改变培养基的形 式，才能顺利地分化出苗。其方法是：
三、愈伤组织染色体变异与形态发生的关系
有些愈伤组织起初具有形态发生能力，但经过反复 继代培养之后，这种形态发生能力常常逐渐下降，有 时甚至完全丧失。此外，在由老龄培养物分化出来的 器官中，有很大一部分可能是形态异常的。 造成这些问题的原因有生理的和遗传的两个方面。 生理方面的原因主要是继代世代数多引起生理衰退。 遗传方面的原因主要是多倍性、非整倍性和染色体结 构变异。
① 细胞的数目迅速增加。 ② 每个细胞平均鲜重下降。
③ 细胞体积小，细胞内无液泡
④ 细胞核和核仁增至最大
⑤ 细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。
⑥ 组织的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成 极快。
3、形成期
形成期 (formation stage)是指外植体的细胞经过诱导、 分裂形成了无序结构的愈伤组织的时期。 这一时期愈伤组织内细胞有以下特点是: ① 大而不规则、高度液泡化，整个组织是比较松散的。 ② 表面以下约5～10个细胞是细胞生长的中心这些中 心是愈伤组织的主要生长部位。
4、分化期
④ 出现各种类型的细胞。例如薄壁细胞、分生细胞、 管胞、石细胞、纤维细胞、色素细胞、毛状细胞、细胞 丝状体等。 ⑤ 愈伤组织的颜色。生长旺盛的愈伤组织一般呈乳 黄色或白色，有光泽，也有浅绿色或绿色的；而老化的 愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。
以上对愈伤组织形成过程的时期的划分并不具有 严格的意义，实际上，特别是分裂期和分化期往往可 以出现在同一块组织上。 另外，虽然细胞脱分化的结果在大多数情况下是 形成愈伤组织，但这绝不意味着所有细胞脱分化的结 果都必然形成愈伤组织。相反，越来越多的试验证 明，一些外植体的细胞脱分化后可直接分化为胚性细 胞而形成体细胞胚。
• 在愈伤组织培养中，经常发现细胞的生理 行为和形态发生行为有自发变异的现象。 原因可能是核的异常，也可能是其他原因。 • 很多物种在活体中的组织分化并不导致细 胞多倍性，但离体条件下却容易发生多倍 化现象。
组织培养物在细胞学上的异质性可能由2个因子引起：
① 原来存在于外植体中染色体倍数性和遗传组成 不同的细胞，经诱导后都能发生分裂； ② 培养条件可能引起新的不规则性。 而且这2个因子常常同时发挥作用。
愈伤组织一般只在不与琼脂接触的表面增殖生长，与 琼脂接触的一面极少有细胞增殖。因此，由于愈伤组织 的迅速增殖，整个愈伤组织小方块变成了一个不规则的 馒头状的组织块。
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第二节 植物愈伤组织与遗传变异
• 愈伤组织的遗传变异 • 影响愈伤组织变异的因子 • 愈伤组织染色体变异与形态发生的关系
一、愈伤组织的遗传变异
第六章 植物愈伤组织培养
本章主要内容
• 植物愈伤组织及形成过程 • 植物愈伤组织与遗传变异 • 植物愈伤组织培养条件与定向变异
第一节 植物愈伤组织及形成过程
• 植物愈伤组织的概念
• 植物愈伤组织的形态结构 • 植物愈伤组织的形成过程
• 植物愈伤组织的继代培养
一、植物愈伤组织的概念
愈伤组织 (callus)，原是指植物在伤口表面形成 的一团薄壁细胞。在组织培养中，愈伤组织指在人工 培养基上由外植体组织的增生细胞产生的一团不定形 的疏松排列的薄璧细胞。 通过愈伤组织培养再分化产生再生植株是植物组织 培养的主要形式之一。几乎所有高等植物的各种器 官，如根、茎、叶和花等，以及各种组织，如皮层、 茎髓和形成层等，离体后在适当条件下都能产生愈伤 组织。