酶偶联显色比色法测定胰脂肪酶

酶偶联法测定血清血管紧张素转换酶

中华医学检验杂志 CHINESE JOURNAL OF MEDICAL LABORATORY SCIENCES 1998年第6期 No.6　November 科技期刊酶偶联法测定血清血管紧张素转换酶金化民　张茨　陈葳　陈谦【摘要】　目的　建立一种测定血管紧张素转换酶(ACE)的酶偶联法。方法　血清与底物马尿酸双甘肽(Hip-Gly-Gly)混合温育30分钟，生成马尿酸(Hip)与双甘肽(Gly-Gly)，再加入L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺(GGCN)和γ-谷氨酰基转移酶(GGT)，催化GGCN与Gly-Gly偶联，产生的3-羧基-4-硝基苯胺于410 nm波长测定其吸收度。结果　当底物pH8.0，GGCN1.0 mmol/L，GGT 6.7 kU/L时，ACE活性与吸收度值有良好线性。55份健康人血清ACE(±s)289±83 U/L，CV：批内4.6%；批间4.8%。10份肉样瘤患者血清ACE(±s)748±34.9 U/L，批内CV3.9%，回收率96%～103%。结论　酶偶联法测定ACE活性具有操作简便、迅速、重复性好，适用于手工操作或自动化分析，可用于诊断早期肺损伤和人类免疫缺陷病毒感染。【关键词】　酶偶联法 γ-谷氨酰基转移酶血管紧张素转换酶活性 Determination of serum angiotensin-converting enzyme by enzyme coupling spectrophotometry Jin huamin Zhang Ci, Chen Wei, et al. First Affiliated Hospital ， Hubei Medical University, Wuhan 430060 【Abstract 】　Objective To establish a new method to measure ACE activity using the coupled reaction which is catalyzed by γ-glutamyl-transferase (GGT). Methods GGT was added as catalyts after the mixture of serum and substrate hippurylglycyl-glycine had been incubated for 30 minutes at 37℃, it participated from as receptor substrate for a γ-glutamyl group transfered from a donor substrate, L-γ-glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide was measured at 410 nm. Results The ACE activity and absorptance was linearly related when pH was 8.0, GGCN was 1.0 mmol/L, and GGT was 6.7 U/L. The mean value (±s) of serum ACE in 55 normal and 10 sarcoid specimens was 289±83 U/L, and 748±34.9 U/L respectively, and the within-run and between-run CV was 4.6% and 4.8% respectively. The later within-run CV was 3.9%, and the recovery rate was 96%～103%. Conclusion ECS is a simple, quick, and reliable method, and it can be used for early detection of the infection of HIV and the damage of the lung. 【Key words 】　Enzyme coupling spectrophotometry Gamma-glutamyltranspeptidase Angiotensin-converting enzyme Activity 血管紧张素转换酶(Angiotensin-Converting Enzyme, ACE∶EC为3.4∶15.1)，又名激肽酶Ⅱ，按系统命名法为肽酰二肽水解酶，属于羧基外肽酶。它的生理功能是催化血管紧张素Ⅰ(ATⅠ)水解成为血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)，释放出组-亮二肽；也可水解缓激肽，释放出苯丙-精二肽。 ACE是一种血管内膜细胞核膜糖蛋白，在体内分布很广，几乎遍布人体各个脏器，归纳起来分为血管内和血管外两类。血管内ACE主要分布在肺血管床；血管外ACE主要分布在肾近曲小管和小肠绒毛的刷状缘。在某些疾病，一些由单核细胞分化而来的细胞可产生大量的ACE并释放入血，引起血清ACE活性升高，在临床上具有诊断意义。国外已将ACE测定列为结节病上皮样肉芽肿，高雪病的诊断和预后估计的常规项目［1］。血清ACE活性变化在诊断急性肺损伤及人类免疫缺陷病毒(HIV)感染方面已受到极大重视。相继建立了荧光光度法、放射性同位素法、高效液相色谱法和分光光度法。这些方法都是基于ACE水解基质马尿酸-组氨酰-亮氨酸或马尿酸双甘肽(Hip-Gly-Gly)，产生马尿酸(Hip)和组氨酰亮氨酸或双甘肽(Gly-Gly)，然而这些方法有的要用有机溶剂提取［2］，有的需要衍化或去除血清蛋白，还有的需要特殊设备或接触放射性试剂［3］，因而推广应用受到限制。近年来，Groff等［4］报告一种由γ-谷氨酰基转移酶(GGT)作指示酶的酶偶联法测定血清ACE，认为是目前测定ACE的理想方法。该法操作简单，重复性好，既可用于手工操作，又可用于自动化分析。我们根据国内条件作了一些改进和探讨，报告如下。材料与方法一、试剂 1.HEPES缓冲液(50 mmol/L)：取HEPES(Sigma产品)1.191 g加双蒸水100 ml溶解，用于配制GGT、GGCN和基

脂肪酶的概述及应用

脂肪酶的概述与应用一脂肪酶概述、脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。酶是一种活性蛋白质。因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。

脂肪酶活检测原理及方法

脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法 1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。 2. 所需试剂有： CAS 碳链长度出货号价格名称830-03- 5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁酸酯 1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯 1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯 1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯 14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司 3. 标准曲线绘制： a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。方法一： b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。 b.标准曲线的绘制：分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和 (全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、 4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L 的磷酸缓冲液溶解）中。 5、（二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用0.1 mol/L HCl溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。 4、用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。 5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。

脂肪酶活检测原理及实际方法：

脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法 1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。 2.所需试剂有： CAS 碳链长度出货号价格名称 830-03-5 C2 N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C8 21742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8 C18 N3627-1G ￥2621.97 对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma公司 3.标准曲线绘制： a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L): 称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。方法一： b.标准曲线绘制：分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。 b.标准曲线的绘制：分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 Last revision date: 13 December 2020.

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。 5、（二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。

脂肪酶活力测定方法及其比较

万方数据

苯萃取后进行比色测定．酶的活力单位定义同平板法．酶活计算同铜皂法．１．３．３对硝基苯酚法对硝基苯酚法是以对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解底物产生具有颜色的对硝基苯酚，在４２０ｎｍ波长下测出其吸光光度值，再对照对硝基苯酚吸光度工作曲线得出脂肪酶活力．这样可以使操作更加简单同时可以避免金属离子的干扰［２．１８｜．酶的活力单位定义为检测条件下每分钟产生１ｂｔｍｏｌ对硝基苯酚所需的脂肪酶量，其计算公式为：脂肪酶活力一ＶＮ（Ｃ（样）一Ｃ（空白））／丁／Ｖ（稀释酶液）．式中。Ｖ反应总体积，Ｎ稀释倍数，Ｃ根据吸光度Ａ求出的对硝基苯酚的浓度，ｔ反应时间，ｙ（稀释酶液）稀释酶液的体积．２３种方法的比较２．１实验仪器和操作难易程度的比较平板法所使用的主要仪器是超净工作台，微量注射器。培养皿，恒温培养箱，价格便宜，操作简单Ｌ２?１３］；滴定法仅需要酸碱滴定管、试管、恒温水浴锅、酸度计、高速组织捣碎机等一些比较常见，操作简单［”］；比色法包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法．铜皂法使用的主要仪器是分光光度计。超声波装置，仪器较常见，但操作繁琐［１５］；微乳液法使用的仪器主要是分光光度计，操作简单。精确度高Ｌ１６—１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器主要是分光光度计。操作简单［２?１８］（表１）．２．２实验试剂及精确度的比较平板法使用的试剂主要有维多利亚蓝、三丁酸甘油脂、罗丹明Ｂ等，该实验反应时间长且精确度差［１１］．滴定法所使用的主要试剂有氢氧化钠、酸碱指示剂、聚乙烯醇、橄榄油等［１３｜．滴定中酸碱指示剂不能很好地指示反应终点，即使用酸度计代替酸碱指示剂控制反应终点，产物中丙酮酸的干扰使实验的结果偏大［１ｌ’１９］．铜皂法中的底物有３种：榄橄油，三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂［１５］．其中榄橄油作为底物，精确度不高，当用三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂作为底物检测脂肪酶的活性。精确度较高．微乳液法使用的试剂有三油酸甘油脂，吐温一８０和正己烷，实验重复性好，精确度高Ｌ１６。１７｜．对硝基苯酚法使用的试剂主要是对硝基苯酚，稳定性好且非常精确［２．１８］（表１）．２．３各种方法的适用范围平板法所使用的仪器十分常见、所使用的试剂也比较便宜，但该种方法的误差较大同时需要的时间很长．因此该种方法主要应用于产脂肪酶菌种的筛选及批量酶样品的快速测定［１１］；滴定法所使用的仪器常见、操作简单，所使用的试剂比较便宜，精确度较高，适合于学生实验和具备简单仪器的实验室测定脂肪酶的活性［２］；铜皂法所使用的仪器较常见、操作繁琐、稳定性不高。但实验精确度高且试剂较便宜，大部分实验室和生物技术公司用该种方法测定脂肪酶的活性［１５］；微乳液法所使用的仪器常见、操作简单，重复性好，但试剂价格偏高，主要适用于实验室和生物技术公司对酶活性的精确测定［１６－１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器常见，但试剂对硝基苯酚价格昂贵且有毒，主要适用于实验室对酶活性的精确测定［２．１８］（表１）．表Ｉ平板法、滴定法及比色法的比较３结论在脂肪酶活性检测时，可根据实验目的、实验设施及节约成本的原则选择适宜的方法和底物来检测脂肪酶活性．在活性检测过程中，酶活力单位的计算尽量在最适温度、最适ｐＨ、酶浓度以及适宜的底物浓度下进行。从而使测定的脂肪酶活性达到最大值，使结果更加准确和可信．另外，由于酶的活力单位可以根据计算和记录的方便而自行定义。给交流和工业生产造成麻烦，建议在测定脂肪酶的活力时，尽量使用国际单位来计算?４４?酶活．致谢本文受到贵州省教育厅重点扶持学科基金和凯里学院植物学重点学科基金资助．参考文献：［１］ＧＵＰＴＡＲ，ＧｕｐｔａＮＲａｔｈｉＰ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｐａｓｅｓ：ａｎｏ’ｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ—ｇＹ。２００４，６４（６）：７６３—７８１．万方数据

ADA 酶比色法

腺苷脱氨酶（ADA ）测定试剂盒（酶比色法）使用说明书【产品用途】本试剂用于测定血清、胸腹水、脑脊液中的腺苷脱氨酶活性。【临床意义】肝脏疾病时，本酶活性往往升高，有助于黄疸的鉴别诊断。在阻塞性黄疸时，此酶活性升高很少，而在肝实质性损伤时，此酶和转氨酶往往同时升高，特别在慢性活动性肝炎和肝硬变时，转氨酶阳性率较低，增高幅度也不明显，而ADA 活性的阳性率可达90%左右，增高程度也较明显。同时ADA 检测对白血病、伤寒、出血热也有辅助诊断作用。测定胸腹水及脑脊液标本中的ADA 活性，有鉴别诊断价值。结核性胸腹水中ADA 活力显著高于癌症及炎症胸腹水中ADA 活力，对早期诊断结核性胸、腹膜炎有较高的敏感性和一定的特异性。此外，脑脊液ADA 检测可作为中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断的重要指标，结核性脑膜炎ADA 活性升高，病毒性脑膜炎不升高。【适用范围】液体双试剂，即开即用，自动化分析仪用。【产品规格】 R 1 50ml ×2 R 2 50ml ×1 【试剂成份】 R 1 Tris-HCl pH8.0 50mM 4-AA 2mM PNP 0.1kU/mL XOD 0.2kU/mL POD 0.6kU/mL 稳定剂 R 2 Tris-HCl ph4.0 50mM 腺苷 10mM EHSPT 2mM 【检测原理】腺苷在腺苷脱氨酶作用下脱氨基形成次黄苷，次黄苷在PNP 作用下生成次黄嘌呤，次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶（XOD ）作用下转化为尿酸和过氧化氢（H 2O 2），H 2O 2与EHSPT 和4-氨基安替比林（4-AA ）反应生成醌色物，显色强度与ADA 活性成正比。腺苷?? ?→?ADA 次黄苷 + NH 3 次黄苷 + Pi ??→?PNP 次黄嘌呤 + 核酸-1-磷酸次黄嘌呤 + 2H 2O + 2O 2???→?XOD 尿酸+ 2H 2O 2 2H 2O 2 + 4-AA + EHSPT ??→?POD 醌亚氨染料+ H 20 【样本采集】新鲜非溶血血清或血浆，ADA 在4℃时可稳定1周。【测定方法】 1.试剂1、2在使用前恢复到37℃。 2.180μl R 1与5μl 血清（浆）样品混合，在37℃孵育3min-5min 。 3.加入90μl R 2孵育3min ，在540nm 或546nm 处测2分钟，计算每分钟平均光度变化△A/min 。【参考范围】血清：4~24U/L 胸腹水：0~35 U/L 脑脊液：0~6 U/L 各实验室应建立自己的参考范围; 【产品性能】 1.试剂空白吸光度：A 340nm(1cm) ≥0.800 2.本试剂线性范围：0-150 U/L 3.精密度：批内CV ≤5% 批间相对极差CV ≤8% 4.准确度：相对偏差≤±10% 【试剂保存】 R 1、R 2为液体试剂，直接使用。2-8℃避光稳定1年。【注意事项】 1.本方法特异测定ADA ，其它核苷与本方法不发生反应。 2.血清胆红素达20mg/dL ，血红蛋白100mg/dL ，甘油750mg/dL ，抗坏血酸4mg/dL 对实验无干扰。【单位意义】在37℃条件下，每分钟用于产生1 umol 次黄苷的量定义为一个单位的ADA 。【生产许可证】【注册标准号】【注册证号】

脂肪酶、淀粉酶测定方法

脂肪酶测定——采用p-NPP法取0.5g样品，加去离子水10mL，40℃水浴浸泡2h，过滤。取滤液1mL于试管中，加入pH8.0缓冲液3mL和1mmol/L p-NPP溶液0.1mL 于40℃下精确反应3min，迅速置于冰上终止反应。在波长405nm处测定吸光度值。对照管酶液用等体积去离子水代替，其余试剂相同。Npp标准曲线Y=0.287x+0.0861 （y：吸光度x：NPP浓度（umol/L））试剂配制： 1mmol/L p-NPP溶液：称取0.0378g pNPP，加入1mL曲拉通-100与5mL异丙醇，用Tris-HCL（pH8.0）定容至100mL。 pH8.0 Tris-HCl：50mL 0.1M tris碱溶液与29.2mL 0.1M HCl溶液混合，加蒸馏水定容至100mL。淀粉酶测定称取六神曲0.5g，研细，用20mL去离子水40℃浸泡1h，过滤。取2只250mL的碘瓶，各加入5%的淀粉液25mL，10mL醋酸钠缓冲液（pH4.5），10mL蒸馏水，摇匀，40℃水浴预热5min。A管中加入滤液5mL，准确反应1h，立即加2mol/L HCl 1mL终止反应，B管中先加入HCl，再加滤液5mL。2只碘瓶分别加入0.05mol/L碘液10mL，0.1mol/L氢氧化钠45mL，边滴边振摇，暗处放置20min，加入1mol/L 硫酸2mL，用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。每份样品测定3次。记录消耗硫代硫酸钠的体积，计算得淀粉酶活力。

淀粉酶活力是指1g六神曲粉末在一定条件下(T=40℃，pH=5.0)，1h 内催化可溶性淀粉水解生成葡萄糖的毫克数。计算公式: 淀粉酶活力=［c×(vB－vA)·M·N］/2×m·t 式中:c为硫代硫酸钠的浓度(mol/L)，M为葡萄糖的摩尔质量(g/mol)，N为酶液稀释倍数，V A为样品滴定值(mL)，VB为空白滴定液(mL)，m为六神曲的取样量(g)，t为反应时间(h)，淀粉酶活力单位为mg/(g·h) 。试剂配制 pH4.5醋酸钠缓冲液：18g醋酸钠加9.8mL冰醋酸，定容至1000mL。1mol/L硫酸溶液：量取6mL浓硫酸，倒入适量水中，用水稀释至100mL。 0.1mol/L碘液：取碘13.0g，加碘化钾36g与水50ml溶解后，加盐酸3滴与水适量使成1000ml，摇匀，用垂熔玻璃滤器滤过。蛋白酶活力测定称取六神曲1g，研细，加蒸馏水20ml，于40℃水浴放置1h，间断搅拌，过滤，滤液以磷酸钠缓冲液稀释1倍。取1mL稀释液置离心管中，于40℃水浴预热5min，加入预热的酪蛋白1mL，保温10min，立即加入0.4 mol / L 三氯醋酸2 ml，终止反应，继续置水浴中保温20 min，使残余蛋白质沉淀后离心滤过。取1 mL滤液，加入0.4 mol/L 碳酸钠溶液5 mL，福林试液1 mL，蒸馏水2 mL，摇匀，置水浴锅中，40 ℃保温显色20 min。以试剂溶液为空白，于763 nm 波长处测定吸光度。在40℃时每1min水解酪蛋白产生1g酪氨酸的酶量，定义为1个蛋白酶活力单位。

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液） 2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III 液） 4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下） 5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、??4度搅拌12小时 7、??静置10小时（4度） 8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L 的溶液。 2、??加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、??用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、??按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。 5、?? （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、??用 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。 2、??滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。

影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施

影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施酶联免疫（EliSA）是检验科目前常用的免疫学检测方法之一，其操作方便、简单，不须要特殊设备，使其在各级医院都可应用。但如果忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性的结果。因此了解影响结果的因素，是减少差错事故发生很必要的。 1实验室操作人员的基本素质因素实验室人员的素质主要包括五个方面：思想素质、文化素质、技术素质、心理素质、身体素质。因为我们是为人服务的，所以我们的职业道德水平直接关系到人们的生命健康和生命安全。如果在工作中出现了张冠李戴，就有可能造成严重后果。其次文化素质和技术素质很重要，我们必须熟练掌握本专业的基本理论和操作技术。还要不断努力学习新的理论知识，努力提高业务水平。有良好的心理素质勇于面对工作中的挫折，在繁忙工作中有条不紊。所以人员素质问题对检验结果有重要的影响因素。 2标本处理因素实验室人员收到标本后应：“三查七对”，对不符合要求的标本和申请单拒收，合格标本及时分离血清，避免溶血。提取血清时不能混有大量纤维蛋白或细胞成分，对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始记录。从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，充分混匀再用。 3操作过程的影响因素 3.1 操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度（保持在18～25℃），反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，各种条件必须符合要求。 3.2 正确使用加样器，加样器应垂直加入标本或试剂，避免摩擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要一次性使用，加样次序要与说明书一致，否则易发生错误，造成实验重复性差。 3.3 手工洗板加洗液时冲击力不能太大，洗涤次数不超过说明推荐的次数，洗涤液在反应孔内滞留的时间不宜太长。不要让洗液造成孔间污染，导致假阴性和假阳性。 3.4 要保证加液量一致，我们在使用时感觉加样器比滴瓶加样准确，滴瓶加液量不准造成显色不一，造成判断错误。 3.5 显色液的量不可过多，加样的工作环境不能阳光直射，加显色液后避光反应，显色液量要合适。 4试剂的影响因素应选用有国家批准文号，质量保证的产品。试剂要妥善保存于4℃冰箱内，在使用时先恢复至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。试剂打开后要在一周内用完，剩余试剂下次用时先检查是否变质，显色剂如被污染变化将造成全部显色，导致错误结果。过期试剂不宜，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。 5采取措施，避免差错事故的发生创造一个良好的工作环境，实验室工作人员应团结友爱，互相关心，互相学习自然心情舒畅，工作情绪高涨。再就是建立完善的质量保证体系，以书面的形式发给每位成员以及临床科室，做到人人熟悉，人人重视影响实验结果的因素，并在操作过程中时刻注意，将质控贯穿到整个实验过程中。制定一系列的制度，用制度管人，明确责任，这样才能提高质量，避免错误结果的发生。

脂肪酶实验方案

脂肪酶实验方案富集培养基( %) :酵母膏0. 02 , Na2HPO4 0.35 , K2HPO4 0. 15 , MgSO4·7H2O 0. 05 , NaCl 0.05 , 橄榄油1. 0 , pH 7. 0. 溴甲酚紫筛选平板分离培养基 ( %) : 牛肉膏0. 5 , 蛋白胨1. 0 , NaCl 0. 5 ,葡萄糖0. 3 ,聚乙烯醇1. 0 ,橄榄油2. 5 , 琼脂1. 5 ;灭菌后加入过滤灭菌的溴甲酚紫(50 mg/ 100 mL) 0. 4 mL , pH 6. 0 ,7.0 ,8. 0. 种子培养基( %) :葡萄糖2. 0 , (NH4 ) 2SO4 0.5 , K2HPO4 0. 1 ,MgSO4·7H2O 0. 05 , 蛋白胨2. 5 ,橄榄油1. 0 , pH 7. 0. 发酵培养基( %) :蛋白胨2. 0 , 蔗糖0. 5 , 橄榄油1. 0 , (NH4 ) 2SO4 0. 1 , MgSO4 〃7H2O 0. 05 ,K2HPO4 0. 1 ,pH 自然产脂肪酶菌株的筛选：将细菌接种到种子培养基上，于30 ℃,200 r/ min 摇床培养24 h，划线于溴甲酚紫筛选平板分离培养基上。观察已生长的菌落周围有无透明圈,有红色水解圈的菌落对应的菌株即为产脂肪酶菌株。脂肪酶高产菌株的筛选：（1）产脂肪酶菌株发酵培养：将产脂肪酶菌液按1 %的接种量接入50 mL 发酵培养基中(250 mL 三角瓶) ,30 ℃,200 r/ min 摇床培养48 h；（2）上清液的制备：经6000 rpm/min离心10 min，收集上清液，用0.20 μm滤膜对上清液过滤除菌，滤液分装后-20℃保存待用；（3）(i)度法测定各菌株产酶相对大小：在pH7.5, 30℃条件下, 每分钟释放 1 μmol 对-硝基酚( ρ- nitrophenol) 所需的酶量, 定义为一个活力单位。脂肪酶催化对- 棕榈酸硝基苯酯分解产生ρ- nitrophenol, 在该过程中不断测定其光吸收值的变化。根据单位时间产生ρ- nitrophenol 的量来反应脂肪酶的活力。（本实验采用如下方法：分别向各菌株等量上清液中加入等量过量的对- 棕榈酸硝基苯酯，在反应过程中不断测定其光吸收值的变化，根据吸光值变化幅度确定产酶量大小。） [A液:16.5mmol/L的对硝基苯棕搁酸酯(p一NPP)的异丙醇溶液(冷藏，两周内使用)。B液:含有0.4%Trilonx一100和0.1%阿拉伯树胶的50mmol/L的Tris一HCI缓冲液(pH8.0)。测定时，将相应的A液与B液1:9混和，取100ul适当浓度的酶液加人900ul的上述混和液中，混匀，37℃反应10min后，用可见分光光度计(410nm)读取A值。在此反应条件下，对硝基苯的消光系数是1.46x105cm3/mol。1个单位的脂肪酶活力定义为每分钟分解p一NPP并释放出1umol对硝基苯所需的酶量。] (ii)平板法：采用三丁酸甘油脂平板鉴定法,鉴定板含2 %的三丁酸甘油脂乳化液和2 %的琼脂粉。取10μl粗酶液加入鉴定板上各小孔(直径0. 20cm) 中,特定温度下放置12h 后,通过水解透明圈的直径大小来测定脂肪酶酶活性大小。菌株产酶条件的优化碳源对产酶的影响；分别选用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、玉米粉、糊精、玉米淀粉、大豆油、橄榄油为碳源(均为2 %) 进行发酵,以平板透明圈法测定其产酶情况。

卫生专业技术资格考试真题

卫生专业技术资格考试真题精选一、以下每一道考题下面有A、B、C、D、E 五个备选答案。请从中选择一个最佳答案，并在答题卡上将相应题号的相应字母所属的方框涂黑。 1.下列哪种方法不属于血糖检测方法 A.氧化酶法 B.已糖激酶法 C .邻甲苯胺法 D上匕浊法 E. 干化学法答案：D 2.下列何种情况干扰血清总蛋白的双缩脲法测定 A.血清呈乳糜状 B.高血糖 C.高血钾 D.高血钠 E.高血钙答案：A 3.紫外法测定蛋白含量的波长应为 A.280nm或215/225nm B.280nm或340nm C.15/225nm 或405nm D.340nm或405nm

E.260nm或280nm 答案：A 4.下列关于血气分析质控物的叙述中哪项不对 A.质控物在室温平衡后，再用力振摇两三分种才能开瓶使用 B.开启安瓿后，应立即注入仪器中检测 C.检测质控数据如偏离参考范围，应检查原因 D.过期的质控物不能使用 E.质控物中的物质在气液两相中的平衡受温度影响小答案：E 5.钙测定的参考方法是 A.火焰光度法 B.原子吸收分光光度法 C.邻甲酚肽络合酮法 D.过锰酸钾测定法 E.EDTA络合滴定法答案：B 6.门冬氨酸和a -酮戊二酸可以作为下列哪种酶的反应基质物 A.ALT B.AST C.ALP D.GGT E.AMY

答案：B 7.不与碱性苦味酸试剂反应的有 A.胆红素 B.乙酰乙酸和丙酮 C.丙酮酸 D.氨基酸 E.维生素C和葡萄糖答案：D 8.目前全自动生化分析仪测定尿素最常用的方法是 A.尿素酶-谷氨酸脱氢酶偶联法 B .酚-次氯酸盐显色法 C .纳氏试剂显色法 D.二乙酰一钙法 E.脲酶一波氏比色法答案：A 9.胆红素分子量为584,在453nm时摩尔吸光度为60700,如果有一胆红素溶液浓度时5mhg/L，以453nm，光径为1cm条件测定时，其吸光度应是多少 A.1.04 B.0.52 C.0.13 D.0.06 E.0.01 答案：B

粮食脂肪酶活力、脂肪酸及其组成测定

粮食脂肪酶活力、脂肪酸及其组成测定试验方法脂肪酶活力的测定参考文献(Aizono et al.，1973)的方法。准确称取6.00g糙米粉，加入Tris-HCl (pH7.5)定容至25mL，振荡均匀，置于4℃下浸提1 h，然后于4℃下10000 r/min 冷冻离心15min，过滤。取滤液l.5mL于试管中，依次加入l mL 0.5 mol/L KCl，l mL 5 m mol/L CaCl2，0.5mL Tris-HCl (pH7.5)，然后置于37℃恒温水浴摇床中保温10 min，加入l mL三乙酸甘油酯在37℃恒温水浴摇床中震荡反应l h，沸水浴灭酶10min。以酚酞-乙醇为指示剂，采用0.05 mol/L NaOH滴定至微红，记录滴定所消耗的体积V。脂肪酶活力定义为：在上述反应条件下，每分钟消耗0.05 mol/L NaOH 0.01mL为1个酶活力单位U。酶活力(U) = (V-V0)×l00 / t 其中：V为样品所消耗NaOH的体积(mL)，V0为空白消耗NaOH的体积(mL)，t为反应时间(min)，100为NaOH体积转化为酶活力单位的系数。数据处理以每克绝干糙米中脂肪酶活力进行分析。游离脂肪酸含量的测定参考GB/T15684-1995的方法。准确称取5.00 g糙米粉于250 mL锥形瓶中，加入40 mL无水乙醇在25 ℃恒温振荡10 min，过滤。取25 mL滤液用标准KOH-乙醇溶液滴定。以每100g绝干稻谷消耗的KOH毫克数表示游离脂肪酸的含量。脂肪酸组成的测定样品处理：准确称取糙米粉10.00g置于100mL锥形瓶中，加入20mL氯仿-甲醇溶液(体积比为2：l)，用均质机均质20s，然后用5mL氯仿-甲醇溶液洗涤均质

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