酶偶联显色比色法测定胰脂肪酶
临床生物化学检验-第7章 临床酶学检验技术
酶活性的国际单位定义； 酶活性测定的连续监测法的概念、计算和分 类；酶活性测定的影响因素及最适条件的确定原则。
血清酶变化的病理机制；酶动力学参数的含义；电泳法和免疫抑制法 测定同工酶的原理。
酶蛋白质量测定的优点；定时法测定临床常用诊断酶的原理和评价； 同工酶的其他检测方法。
2
第一阶段（1908 ~ 1950） ：利用化学和有机化学的反应原理测定酶促反应生成量或底物消耗量定 时法测定AMY (1908年， Wohlgemuth)、 LPS、ALP、ACP等几种酶。
2. 国际酶学委员会将每种酶用4个数字加以系统编号： 数字前冠以EC ，数字之间用黑点 隔开。第一个数字表示酶的类别 ，第二个表示亚类 ，第三个表示亚-亚类 ，第四个表示 酶的编号序数：如EC1.1.1.27 LD (乳酸脱氢酶)。
3. 同工酶：催化相同化学反应， 但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的
心梗、肌病、颅脑损伤、肿瘤 心梗、肌病、肺梗死、肝病、肿瘤 肝胆疾病、骨病、妊娠、结肠炎、肿瘤
红细胞、前列腺、溶酶体 γ-GT1、 γ-GT2、 γ-GT3、γ-GT4
前列腺癌、血液病、骨肿瘤 肝癌、梗阻性黄疸
P-AMY(P1、P2、P3)、S-AMY(S1、 S2、 S3、S4) ALT、 mALT AST、 mAST
18
连续监测法（continuous monitoring assay）： 在多个时间点连续测定产物生成量或底物消耗量 ，选取线性期的速率来
计算酶活性 ，又称速率法。将酶与底物在特定条件 (缓冲液、温度等) 下孵育 ，每隔一定时间 (2s∼60s) 连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信 号的变化 ，从而计算出每分钟的信号变化速率 ，求 出酶活性浓度。 尤其适合在自动化分析仪上使用
体液总脂肪酶(lipase)活性比色法定量检测试剂盒产品说明
体液总脂肪酶（lipase）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途体液总脂肪酶（lipase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物三丁酸二巯基丙醇受到脂肪酶水解，释放出巯基基团，使用Ellman试剂，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用比色法来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心改良、成功实验证明的。
其适用于各种动物和人体各种体液包括尿液、脑脊液、唾液、精液等样品脂肪酶的总活性检测。
产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景脂肪酶（lipase；EC3.1.1.3）是可溶性糖蛋白分子，催化不溶性脂质分子的酯键（ester bond）的水解。
在人体中，其来源于胰腺产生。
在消化系统中，脂肪酶（Lipase），裂解脂肪分子，例如甘油三酯（triglyceride；TAG），产生1个分子甘油（glycerol）和3个分子游离脂肪酸分子（fatty acid）。
脂肪酶异常增高与胰腺炎、胰腺管阻塞、胰腺癌、肾病、唾液腺炎症、肠道阻塞等相关；异常降低则与胰腺中脂肪酶产生细胞的永久性损伤有关。
脂肪酶的活性检测是临床诊断的指标之一。
基于脂肪酶在水分子的参与下，催化三丁酸二巯基丙醇（dimercaptopropanol tributyrate；DMPTB或BALB）的水解，产生二巯基丙醇（dimercaptopropanol；DMP），并释放出巯基基团（－SH），进而与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析脂肪酶的活性。
脂肪酶反应系统为：产品内容缓冲液（Reagent A）毫升反应液（Reagent B）毫升底色液（Reagent C）微升补充液（Reagent D）微升产品说明书1份保存方式保存反应液（Reagent B）和底色液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent C）避免光照，有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于样品操作的容器微型台式离心机：用于样品制备恒温水槽：用于孵育反应比色皿或96孔板：用于反应和比色的容器分光光度仪或酶标仪：用于比色分析实验步骤一、样品准备1．准备好1.5毫升离心管2．移取1毫升液体（尿液/脑脊液/唾液/精液等）到离心管3．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）4．小心移取上清液到新的1.5毫升离心管5．即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存6．（选择步骤）移取10微升进行蛋白定量测定（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HL30030.1）二、测定准备1．准备好待测样品，置于冰槽里2．设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长412nm，间隔10分钟，读数4次（共30分钟），并置零3．缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度三、背景对照测定1．移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿2．加入xx微升底色液（Reagent C）3．上下倾倒数次，混匀4．在37℃温度下孵育3分钟5．加入50微升待测样品（或100微克蛋白）（注意：样品须清澈）6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）7．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（30分钟读数－0分钟读数）四、样品测定1．移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿2．加入xx微升反应液（Reagent B）3．加入xx微升底色液（Reagent C）4．上下倾倒数次，混匀5．在37℃温度下孵育3分钟6．加入50微升待测样品（或100微克蛋白）（注意：样品须清澈）7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（30分钟读数－0分钟读数）五、计算样品活性[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 1（体系容量；毫升）]÷[0.05（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 30（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克单位＝微摩尔DMPTB/分钟六、酶标仪测定1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品2．分别移取xx微升缓冲液（Reagent A）到所有孔里3．加入xx微升反应液（Reagent B）到样品孔里4．加入xx微升阴性液（Reagent D）到背景对照孔里5．分别加入xx微升底色液（Reagent C）到所有孔里6．轻轻摇动96孔板7．在37℃温度下孵育3分钟8．分别加入10微升待测样品（或20微克蛋白）到所有孔里（注意：样品须清澈，且pH为7.2）9．轻轻摇动96孔板10．即刻放进酶标仪检测，包括（0分钟初始读数和30分钟读数）11．活性计算注意事项1．本产品为20次（96孔板，包括20次样品和20次背景对照）和5次（比色皿，包括5次样品和5次背景对照）操作2．本产品检测范围是40至1600毫单位/毫升3．建议样品采集后3小时内制备完成4．操作时，须戴手套5．每次样品测定，需要背景测定一次6．样品须澄清，至关重要7．样品中避免含有EDTA、TWEEN20、NP40、巯基乙醇、DTT等，否则干扰检测8．孵育反应完成后即刻进行比色测定9．比色测定后，比色皿须清洗彻底10．建议待测样本的蛋白浓度为100微克/50微升（本公司提供Bradford蛋白质浓度定量试剂盒HL30030.1）11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度12．酶活性单位浓度定义：在37℃下，pH 7.5的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解1微摩尔三丁酸二巯基丙醇13．本公司提供系列医学生化检测试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定检测敏感。
幽门螺杆菌感染与血糖、血脂及谷丙转氨酶的相关性分析
甘肃医药2020年39卷第12期Gansu Medical Journal ，2020，Vol.39，No.12幽门螺杆菌（Hp ）寄居于人的胃部，是引起胃部疾病的重要致病因子，国内研究证实，Hp 感染与慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴样组织（MALT ）淋巴瘤及胃癌的发生发展密切相关［1］。
近年来，Hp 感染在消化道外的作用备受关注，有研究表明，Hp 感染与冠心病、脑梗死及糖尿病等的发生发展存在相关性［2-3］。
本研究在健康体检人群中展开调查，了解Hp 感染状况，探讨Hp 感染与血糖、血脂及谷丙转氨酶的关系。
1资料与方法1.1一般资料2018年1月至2019年12月在甘肃省疾病预防控制中心体检中心参加健康体检的2755人，既往检查未发现Hp 感染；本次检查前未确诊糖尿病、糖代谢受损或胰岛素抵抗，未曾使用过口服降糖药及胰岛素；无糖尿病家族史；无心肝肾功能不全；无恶性肿瘤，特别是消化道恶性肿瘤病史。
其中男性1679人，占60.94%；女性1076人，占39.06%。
年龄20~69岁，平均（42.36±11.23）岁。
1.2仪器与试剂仪器为日立7020型全自动生化分析仪，所有生化试剂、标准品均为原装配套，采用浙江东欧诊断产品有限公司的产品，质量控制品由英国朗道公司生产；幽门螺旋杆菌IgG 抗体检测试剂盒由爱博生物医药公司提供。
1.3方法1.3.1标本采集。
所有体检者均空腹8~12h ，于次日清晨抽取静脉血5mL 置于真空生化类试管中，及时分离血清，2~3h 内由全自动生化仪进行检测项目的测定。
1.3.2检测指标。
总胆固醇（TC ）、甘油三酯（TG ）采用酶偶联比色法检测、空腹血糖（FPG ）采用氧化酶法检测、谷丙转氨酶（ALT ）采用速率法检测、幽门螺杆菌IgG 抗体采用乳胶法检测。
1.3.3诊断标准。
根据2007年中国成人血脂异常防治指南［4］，TG ≥2.26mmol/L 为增高，TC ≥6.22mmol/L 为增高；根据2003年美国糖尿病协会（ADA ）标准［5］，FPG ≥6.9mmol/L 为增高；ALT>40μL/L 为增高。
脂肪酶酶活测定方法
脂肪酶是一种特殊的水解酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中，是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。
其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。
近年来，随着非水酶学和界面酶学的不断深入，脂肪酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，应用前景广阔。
脂肪酶在微生物中有广泛的分布。
脂肪酶催化的反应是:甘油三酸酯+水→甘油二酸酯+游离脂肪酸→甘油酸酯+游离脂肪酸→甘油+游离脂肪酸。
脂肪酶只能在异相系统，即在油-水界面上作用，对水溶性底物无作用，这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性。
1 滴定法（参照国家标准，适用于脂肪酶制剂）1.1 脂肪酶活力定义为1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度的pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。
1.2 测定原理脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示反应终点，根据消耗的减量，计算其酶活力。
反应式为：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O。
1.3 仪器设备恒温水浴箱，移液枪，高速匀浆机，pH计，电磁搅拌器1.4 试剂溶液95％酒精4%聚乙烯醇（PVA，聚合度1750±50）：称取4g PVA，加蒸馏水80mL，沸水中加热，并不断搅拌，使其完全溶解，慢速搅拌，以免产生过多气泡，冷却后定容至100mL，用双层纱布过滤后备用。
橄榄油(分析纯)底物溶液：按4%聚乙烯醇：橄榄油=3:1比例混合，用高速匀浆机处理6min（分两次处理，间隔5min，每次处理3min）。
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及方法脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。
2. 所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司3. 标准曲线绘制：a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和(全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。
上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm 下测定吸光值, 以 1 min 内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol 对硝基苯酸(p-NP) 所需的酶量为 1 个酶活单位(U)。
酶标法实验报告(3篇)
第1篇一、实验名称酶标法检测实验二、实验目的1. 掌握酶标法的基本原理和操作步骤。
2. 了解酶标法在生物化学和免疫学中的应用。
3. 通过实验验证酶标法检测的准确性。
三、实验原理酶标法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种基于抗原-抗体反应原理的免疫检测技术。
其基本原理是利用酶催化底物反应的特性，将抗原或抗体标记上酶，形成酶标抗原或酶标抗体。
当酶标抗原与相应抗体结合时，通过酶催化底物反应产生颜色变化，从而实现对抗原或抗体的定量或定性检测。
四、实验材料1. 试剂：酶标抗体、抗原、底物、洗涤剂、缓冲液等。
2. 仪器：酶标仪、移液器、离心机、冰箱等。
五、实验步骤1. 样本处理：将待测样本进行适当的处理，如离心、稀释等。
2. 包被：将抗原或抗体包被在96孔板中，室温下孵育过夜。
3. 洗涤：用洗涤剂将未结合的抗原或抗体洗去。
4. 加酶标抗体：将酶标抗体加入96孔板中，室温下孵育1小时。
5. 洗涤：用洗涤剂将未结合的酶标抗体洗去。
6. 加底物：将底物加入96孔板中，室温下孵育15分钟。
7. 显色：用显色剂显色，观察颜色变化。
8. 测定吸光度：用酶标仪测定各孔的吸光度值。
六、实验结果与分析1. 结果记录：将各孔的吸光度值记录在实验记录表上。
2. 数据处理：将实验数据输入计算机，进行统计分析。
3. 结果分析：- 比较各孔的吸光度值，判断抗原或抗体的存在。
- 计算标准曲线，根据吸光度值确定抗原或抗体的浓度。
七、讨论与结论1. 讨论：- 分析实验结果，讨论酶标法的优缺点。
- 讨论实验中可能出现的误差及原因。
- 探讨酶标法在生物化学和免疫学中的应用前景。
2. 结论：- 酶标法是一种灵敏、特异、简便的免疫检测技术。
- 通过本实验，掌握了酶标法的基本原理和操作步骤。
- 酶标法在生物化学和免疫学中具有广泛的应用前景。
八、注意事项1. 实验操作要规范，避免交叉污染。
2. 试剂要新鲜，避免使用过期试剂。
生化基础物质检测—酶活性检测
反应进程曲线（速率
时间（s）
法） 317 334 351 368 385 402
吸光度（A） 1.253 1.204 1.178 1.146 1.126 1.097
据此计算此酶的∆A/min
419 1.048
1.450
1.400
1.350
延滞期
1.300
预孵育期
终点法
1.250 1.200
速率法
线性期
指示酶
Ex
Ea
Ei
A
B
C
P
待测物质 中间产物
终产物
酶偶联反应的原理：
在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有 恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期 可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定
常用指示酶及其指示反应
1.脱氢酶 用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱
反应如下：
色原物质
Trinder反应：
POD
2H2O2 + 4-AAP + 酚
醌亚胺（红色） + 2H2O
应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）
等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通 过Trinder反应加以测定
酶偶联法测定ALT的吸光度变化图
吸光度(A）
氢酶，例如LDH、MDH、G-6-PD、GLDH等，它们催化下 列反应：
P + NAD(P)H + H+ PH2 + NAD(P)+ 可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定
应用：ALT、AST、CK等酶活性测定
2.过氧化物酶（POD）
参考文献
三甲医院考察资料近期，我科去市里各三甲医院考察，看了各医院的项目、布局，现根据我院实际情况现总结如下：项目方面：（一）生化组：（1）检查急腹症、胰腺炎：可以将血、尿淀粉酶、血清脂肪酶联查。
（收费46元）优点：脂肪酶在胰腺炎的诊断上更具有特异性和更灵敏，是其特异性指标。
两种酶进行联查可以区分是急性胰腺炎还是其它急腹症。
解释：在胰腺炎时，血清脂肪酶比淀粉酶升高更早，下降更晚，且升高幅度大，因此比淀粉酶对急性胰腺炎的诊断敏感而且更具有特异性。
腮腺炎和巨淀粉酶血症、除急性胰腺炎外的其它急腹症时淀粉酶升高、血清脂肪酶不升高。
测定方法：血清酶偶联显色比色法试剂盒；试剂包装要小包装。
（2）本院做免疫五项项目解释：统计3个月的外检项目：1月份免疫五项18人次；2月份9人次（春节）；3月上半个月18人份。
应临床需求量的增大，可以进行开展。
（3）糖尿病患者进行两项组合检查（血糖、糖化血红蛋白）。
（4）心肌酶项目AST、LDH、HBDH、CK、CK-MB、Mb项目中AST去掉，建议更换为IMA(缺血修饰白蛋白)。
解释：AST与肝功项目重复，且特异性较差；而IMA(缺血修饰白蛋白)是诊断早期心肌（二）免疫组（1）女性肿瘤五项中可以把β2微球蛋白去掉，改为Ca153，筛查女性乳腺肿瘤。
（2）内一科和妇科建议：对于糖尿病人和孕妇可以实施TSH单查。
解释：有利于甲状腺七项的开展带动作用。
（3）INS+TSH联查用于孕妇和不孕人员检查。
（4）可以针对人群建议开展肿瘤全项，包括：男性（13项，收费：982 ）：AFP、CEA、CA199 、PSA 、FPSA 、NSE、角蛋白抗原211、铁蛋白、CA724、CA242、降钙素（CT）、鳞癌细胞抗原、β2微球蛋白。
女性（14项，收费：1078 ）：AFP、CEA、CA199 、CA125 、CA153、NSE、角蛋白抗原211、铁蛋白、CA724、CA242、降钙素（CT）、鳞癌细胞抗原、β2微球蛋白、人附睾蛋白HE4。
酶偶联比色法测定血清门冬氨酸氨基转移酶
生！也』ｂ业旦ｉ§鲤ｚ皇Ｐ鲤：２盟２：！丝§：№：２
门冬氨酸氨基转移酶广泛地存在于人体组织 中，心肌、肝和骨骼肌中含量较多，对心肌梗死的辅 助诊断有意义，目前测定血清门冬氨酸氨基转移酶 的比色方法主要是赖氏比色法，此方法的主要缺点 是底物浓度低，不能保证酶反应的充分进行，造成结 果的准确性不好。本文采用酶偶联比色法测定血清 门冬氨酸氨基转移酶活性，克服了赖氏比色法的不 足，提高了线形范围，与酶速率法相比，ｒ＝ｏ．９９８， 线形范围达８５０Ｕ／Ｌ。 １材料与方法 １．１试剂 谷氨酸脱氢酶，心肌黄酶购自美国 ＳＩＧＭＡ公司，酶速率法试剂购自美国贝克曼公司。 其他试剂均为国产分析纯试剂。 １．２仪器 美国Ｂｅｃｋｍａｎ ｃ“全自动生化分析 议。 １．３反应原理 门冬氨酸＋ａ一酮戊二酸４草酰乙酸＋谷氨酸 谷氨酸＋ＮＡＤ＋昼幽ａ一酮戊二酸＋ＮＡＤＨ＋Ｎ地＋ ＮＡＤＨ＋ＮＢＴ ２垫甲胃苷＋ＮＡＤ＋ １．４标本来自本院门诊和住院患者。 １．５试剂配制 １．５．１门冬氨酸氨基转移酶标准谷氨酸配成一 定浓度的水溶液，其中含适量的尿酸等物质。在 Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｘ４全自动生化分析仪上应用酶速率法对 一份ＡｓＴ质控血清连续测定５次，取其平均值作为 该质控血清的靶值，然后用本法对一定浓度的谷氨 酸溶液和质控血清同时测定５次，取其平均值作为 测定值，换算出此浓度的谷氨酸相当于ＡｓＴ活性的 单位数，作为本方法测定ＡｓＴ活性的标准。 １．５．２试剂Ｉ用０．１５Ｎ ＤＨ８．５的Ｔｒｉ８一ＨＣｌ缓冲 液配制，各物质含量为：谷氨酸脱氢酶２０００ｕ／Ｌ，心 肌黄酶ｌ０００ｕ／Ｌ，氧化型辅酶Ｉ ３．ｏｇ／Ｌ硝基四氮唑 兰ｏ．２０∥Ｌ，腺膘吟二磷酸单钠盐Ｏ．２０异／Ｌ。 １．５．３ 试剂Ⅱ 用Ｏ．１５Ｎ ＤＨ８．５的Ｔｒｉｓ—ＨｃＬ 缓冲液配制，其各物质的含量为：门冬氨酸
第八章-血清酶类测定
ALT速率法测定中酶偶联反应式为：
ALT
L-丙氨酸+α-酮戊二酸 L-谷氨酸 + L-丙酮酸
LD
丙酮酸 + NADH + H+
L-乳酸 + NAD+
上述偶联反应中，NADH的氧化速率与标本中酶活性呈正比，可在340nm检测 吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率(-△A／min)，计算出ALT的活 性浓度。
肝硬化
ALT增高程度与肝硬化的活动度和肝组织炎症改变及肝细胞损害 程度相一致。对ALT进行监测有助于对肝硬化病情的判断。若是 静止性肝硬化，则ALT维持正常 ；肝硬化病人的转氨酶出现较大 幅度的升高，提示病情可能发展成活动性，须引起警惕。
肝癌
80%—90%肝细胞都是在肝硬化基础上发生的，因此，在早期，ALT是否 增高主要决定于肝硬化的活动程度。若是静止性肝硬化，则ALT维持正常， 因为肝细胞发生癌变时，细胞并没有坏死破坏，ALT没有释放出来，因此， ALT没有升高，或ALT有轻度或中度增高。
[参考区间]
速率法： 男性：5～40 U/L 女性：5～35 U/L
[临床意义]
ALT广泛分布于全身各组织器官，尤以肝细胞中含量最 多，其次是肾脏、心脏及骨骼肌，通常只有极少量释放入 血液，所以血清中此酶的活力很低，当这些组织病变时， 细胞坏死或通透性增加，细胞内酶大量释放入血，使血清 中该酶活力显著增高。
标本（血清或血浆）
临床酶学测定酶之前，标本还要经过采集、分离和储存等一系列处理过程。 而酶在血中处于一个动态变化过程，血液离开机体后还会有一定变化。 因此在其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测定值的变化。
标本应避免溶血：
大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多 ，少量 血细胞的破坏就可能引起血浆中酶明显升高。如红细胞 内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高150、15和7 倍左右，故测定这些酶时，样品应避免溶血。
酶催化法制备新型结构脂质研究进展
酶催化法制备新型结构脂质研究进展李亚; 时杰; 黄凤洪【期刊名称】《《生物产业技术》》【年(卷),期】2019(000)004【总页数】6页(P42-47)【关键词】生物催化剂; 固定化酶; 结构脂质; LML型中长链结构脂质; 长链多不饱和脂肪酸; 共轭亚油酸【作者】李亚; 时杰; 黄凤洪【作者单位】产品加工与营养学研究室中国农业科学院油料作物研究所武汉430062【正文语种】中文【中图分类】Q814.2结构脂质（structural lipids，SLs）是甘油三酯（triacylglycerols，TAGs）经过化学或生物催化的方式使甘油骨架上的脂肪酸组成、位置分布发生重组而具有特定分子结构的酯类化合物[1]。
作为食品或食品组成部分，它不仅能改善产品的性质，还具有营养保健的作用；作为疗效食品，它具有潜在的预防、治疗特定疾病的作用。
脂肪酸碳链长短和种类差异决定了结构脂质的生理功能。
长链甘油三酯（long-chain TAGs，LCTs）能为人体提供必需脂肪酸（FAs），但会增加脂肪的堆积进而导致高血压、高血脂、糖尿病等疾病。
中链甘油三酯（medium-chain TAGs，MCTs）则是一种低热量油脂，可有效抑制人体脂肪的积累，但长期摄入会引起胃肠道疾病，且无法为人类提供必需脂肪酸。
中长链甘油三酯（medium- and long-chain TAGs，MLCTs）兼备中链和长链甘油三酯的优点，不仅可以抑制人体内脂肪过度堆积，还可以提供人体所必需的脂肪酸[2-4]。
因此，针对MLCTs庞大的市场需求量，实现高效批量生产MLCTs显得尤为重要。
结构脂质的制备方式需根据所用底物类型和功能需求进行选择，常用的制备方法有化学合成法和生物酶催化法。
化学合成法的反应随机性强，不具有区域选择性。
脂肪酶参与的生物催化法一般具有反应条件温和、反应过程高效、反应过程可控、环境友好以及良好区域选择性等优点，能将所需要的脂肪酸结合到甘油骨架的特定位置，是一种高效制备结构脂质的方法[5-6]。
胰腺外分泌功能检验方法及应用
胰腺外分泌功能检验方法及应用一、血清淀粉酶淀粉酶（amylase，AMY）是一类能将碳水化合物分子水解成小片段的酶。
胰外分泌腺及唾液所分泌的淀粉酶，有助于淀粉的消化。
而肝脏与输卵管内壁也分泌淀粉酶。
人类淀粉酶是α-淀粉酶（或称内切淀粉酶），因为它可水解α-1，4糖苷键，而对支链上的α-1，6键无作用。
α-1，4淀粉酶作用于多糖产生葡聚糖、麦芽糖及一些葡萄糖分子。
测定方法有对-硝基苯麦芽庚糖苷法和碘-淀粉比色法，美国临床化学学会（AACC）推荐碘-淀粉比色法作为淀粉酶过筛法。
（一）碘-淀粉比色法1.原理血清或血浆中α-淀粉酶催化淀粉分子中α-1，4葡萄糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖及含有α-1，6糖苷键支链的糊精。
在底物充分的条件下反应后，加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，比较其与未经酶促反应的空白管的吸光度，可推算出淀粉酶的活力单位。
2.试剂（1）0.4g/L淀粉溶液：于约500ml蒸馏水中，溶解9g氯化钠、22.6g无水磷酸氢二钠（或Na2HPO4•12H2O 56.94g）及12.5g无水磷酸二氢钾，加热至沸腾。
另取一小烧杯，精确称取0.4g可溶性淀粉，加入约10ml蒸馏水，使溶液成糊状后，加入上述沸腾之溶液中，多次洗烧杯水一并倒入，冷至室温后，加入37%甲醛溶液5ml，用蒸馏水稀释至1L，该溶液pH 为7.0±0.1，应置于冰箱保存。
（2）0.1mol/L碘储存液：3.567碘酸钾（KIO3）与45g碘化钾（KI）溶解于800ml蒸馏水中，缓慢加入9ml浓盐酸，混匀后用蒸馏水定容到1L。
放棕色瓶中。
4℃下可稳定1年。
（3）0.01mol/L碘工作液：取碘储存液50ml稀释至500ml，4℃下保存于棕色瓶中，可稳定1个月。
3.操作步骤以半自动分析仪为例，操作如下：（1）血清先用生理盐水作10倍稀释。
每一测定管和空白管中分别加1ml淀粉底物缓冲液，于37℃水浴中预热5分钟。
（2）测定管中加稀释血清0.2ml、混匀，每管加样时间间隔应保持相同。
微生物脂肪酶的研究与应用 (1)
DOI：CNKI:11-1759/TS.20120210.1743.006 网络出版时间：2012-02-10 17:43网络出版地址：/kcms/detail/11.1759.TS.20120210.1743.006.html微生物脂肪酶的研究与应用刘虹蕾，缪铭，江波 ，张涛(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122)摘要：脂肪酶是一类能够催化酯的水解反应以及在非水相体系中催化脂肪酸和醇类发生酯化反应的酶类。
随着酶学技术的快速发展，微生物脂肪酶也受到了越来越多的关注。
作为生物催化剂，脂肪酶一直以来都是生物技术领域中最重要的一类酶。
本文探讨了脂肪酶的来源、理化性质、脂肪酶活力测定，同时对脂肪酶的非水相催化特性以及脂肪酶在食品工业，医药、洗涤剂、皮革、造纸和生物柴油工业领域中的应用进行了讨论。
关键词：脂肪酶；酶活测定；非水相；食品工业应用Research and applications of microbial lipasesLiu Hong-lei, Miao Ming, Jiang Bo, Zhang Tao(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China) Abstract: lipases are a class of enzymes which catalyse the hydrolysis of esters and esterification of fatty acid andalcohol. Lipases constitute the most important group of biocatalysts for biotechnological applications. This reviewdescribes physicochemical origin and properties of lipases, lipase activity determination, catalytic properties oflipases in nonaqueous phase and various industrial applications of microbial lipases in the food, pharmaceuticals,detergent, leather, papermaking and biodiesel.Key words: lipases; lipase actiity determination; Nonaqueous phase; food industrial applications脂肪酶（三酰甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3），是一类广泛存在于多种微生物中的生物催化剂。
脂肪酶_酶比色法_概述说明以及解释
脂肪酶酶比色法概述说明以及解释1. 引言1.1 概述脂肪酶是一类具有催化作用的酶，在生物体内起着关键的功能。
它们能够加速脂肪分子（甘油三酯和脂肪酸）的降解，从而促进脂肪代谢和能量释放。
随着对脂肪酶及其应用领域的研究不断深入，人们发现了许多检测和分析脂肪酶活性的方法，其中酶比色法是一种被广泛应用的方法。
1.2 文章结构本文将对脂肪酶和酶比色法进行详细描述和解释。
首先，在“引言”部分，我们将给出本文的背景和目标，并简要概述脂肪酶以及酶比色法的重要性。
接下来，将在“脂肪酶”部分介绍其定义、分类、生物学功能以及应用领域。
紧接着，在“酶比色法”部分将详细讲解该方法的定义、原理、应用和优势，同时还会列举实验流程和步骤。
然后，在“概述说明脂肪酶的工作机制”部分，将探讨脂肪酶的作用方式、反应条件和影响因素，并通过实例及实验结果解读进一步阐述。
最后，在“结论”部分，将对本文的主要观点和发现进行总结，并展望和建议未来关于脂肪酶研究的方向。
1.3 目的本文的主要目的是深入介绍脂肪酶和酶比色法，以提供关于脂肪酶工作机制及其检测方法方面的详尽信息。
通过对脂肪酶概念、分类、生物学功能以及应用领域进行说明，读者能够全面了解脂肪酶在生物体内的重要性。
此外，详细介绍酶比色法的定义、原理、应用、优势以及实验流程和步骤，有助于读者更好地理解该方法在测定脂肪酶活性方面的价值。
最后，通过概述脂肪酶的工作机制并解读相关实验结果，读者将深入了解脂肪酶催化过程中的关键步骤和条件。
希望本文能为研究人员提供有价值的信息，并对脂肪酶的研究和应用提供启示和指导。
2. 脂肪酶:2.1 定义和分类:脂肪酶，也称为脂肪水解酶，是一类能够催化脂肪分子水解反应的酶。
它们能够将复杂的脂肪分子分解成较小的脂肪酸和甘油。
根据其作用方式和底物特点，脂肪酶可以被分为三大类：lipase、esterase和phospholipase。
- lipase（脂肪解酶）：主要催化三酰甘油水解反应，将三酰甘油分解成甘油和游离脂肪酸。
临床生物化学检验-第8章 连续监测法测定酶活性
(amylase, AMY)
1. 以天然淀粉为底物的测定方法：可测定淀粉水解前后粘度或浊度的改变；也可测产物葡 萄糖；还可测定淀粉与某些活性染料的呈色反应（如碘淀粉比色法 ，但准确性和重复性都 较差）。
2. 以人工合成的麦芽寡糖苷为底物的测定方法：底物的结构和相对分子量确定。
IFCC推荐法： EPS法：以4,6-亚乙基-4-硝基酚-“-D-麦芽七糖苷 (EPS) 做底物偶联多功能“-葡萄糖糖苷酶
9
“-
(alpha-L-fucosidase,AFU)
1. 以4-甲基伞形酮-“-L-岩藻糖苷为底物的荧光法： 灵敏度高 ，但需先用凝胶去除干扰物质。 2. PNPF法：以4-硝基苯-“-L-岩藻吡喃糖苷为底物经AFU水解释放4-硝基苯酚后 ，用碱性缓 冲液终止反应 ，使4-NP呈黄色的方法：需设样本空白并延长反应时间。
12
N-
(β-N-acetyl-D-glucosaminidase, NAG)
1. CNP-NAG法： 色原CNP解离常数 (PKa) 为 5.5 ，摩尔吸光系数大 ，可实现NAG的速 率法分析 ，无需设置样品空白 ，但底物的溶解性和稳定性较差。
2. PNP-NAG法：底物易得 ，反应速度快且稳定 ，是目前常用的方法。 3. MTP-NAG法：可用于尿液NAG测定 ，底物稳定 ，反应灵敏度高。
3. 连续监测法： CNP-NAG法、 PNP-NAG法、 MTP-NAG法。
测定原理： CNP-NAG NAG CNP + 氨基葡萄糖苷
PNP-NAG NAG PNP + 氨基葡萄糖苷
产物CNP、 MPT在405nm/ 340nm处的吸光度与NAG 的活性成正比。
MTP-NAG + H2O NAG N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖+ MPT (6- 甲基-2-巯基吡啶
脂肪酶活力测定方法及其比较
脂肪酶活力测定方法及其比较一、本文概述脂肪酶是一类能够催化脂肪酸酯水解的酶类，广泛存在于动物、植物和微生物中，其在生物体内起着重要的代谢作用。
脂肪酶活力测定方法的研究对于了解脂肪酶的催化性质、生物合成、调控机制以及在工业、医药和农业等领域的应用具有重要意义。
本文旨在介绍常见的脂肪酶活力测定方法，包括滴定法、比色法、荧光法、高效液相色谱法等，并比较它们的优缺点，以期为读者提供一个全面、系统的脂肪酶活力测定方法参考。
通过本文的阐述，读者可以了解各种测定方法的基本原理、操作步骤、适用范围以及注意事项，从而根据自身研究需求选择最合适的测定方法。
本文还将探讨脂肪酶活力测定方法的未来发展趋势，以期为相关领域的研究提供有益的参考和启示。
二、脂肪酶活力测定的基本原理脂肪酶活力测定主要基于脂肪酶水解脂肪酸的特性，通过测量水解产物的生成速率来评估酶的活性。
脂肪酶是一种能够催化脂肪酸酯水解的酶，其催化反应可以表述为：脂肪酶 + 脂肪酸酯→脂肪酸 + 醇。
在测定脂肪酶活力时，通常使用特定的底物，如三乙酸甘油酯（p-nitrophenyl butyrate）或橄榄油等，这些底物在脂肪酶的作用下会水解生成相应的脂肪酸和醇。
在测定过程中，通常使用比色法、滴定法或高效液相色谱法等方法来检测水解产物的生成量。
例如，当使用p-nitrophenyl butyrate 作为底物时，水解产生的p-nitrophenol在碱性条件下会呈现黄色，其颜色深浅与浓度成正比，因此可以通过比色法来测定其浓度，从而推算出脂肪酶的活力。
不同的测定方法具有各自的优缺点，比如比色法操作简便，但可能受到颜色干扰和pH值变化的影响；滴定法则需要精确的化学计量和反应条件控制；高效液相色谱法则具有更高的灵敏度和准确性，但设备成本较高，操作相对复杂。
因此，在选择脂肪酶活力测定方法时，需要根据实验条件和目的来综合考虑各种因素。
脂肪酶活力测定的结果还受到多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、反应温度、pH值等。
酶活力测定的原理和方法
柱法测定：
• 将一定量的固定化酶装进具有恒温装置 的反应柱中，让条件适宜的底物溶液， 以一定的速率流过酶柱，收集流出的反 应液。按常规方法测定底物的消耗量或 产物的生成量。测定方法与游离酶反应 液的测定方法相同。
连续测定
• 利用连续分光光度法等方法可对固定化酶反应 液进行连续测定，从而连续测定酶活力。测定 时，可将振荡反应器中的反应液用泵连续引到 连续测定仪（例如，双束紫外分光光度计等） 的流动比色杯中进行连续分光测定。或者使固 定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进 行连续分光测定。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应
一级反应
Km
[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
生化第一题
【临床意义】
1.酸性磷酸酶（ACP）是作用类似ALP的磷酸酶（最适 pH在7.0以下），存在于人体不同组织，如前列腺、红细 胞、血小板、肾脏、肝脏、脾脏、胃、肌肉及骨髓等，主 要存在于细胞的溶酶体中，以前列腺含量最多。正常男性 血清中ACP有1/3～1/2来自前列腺，其余部分及女子血清 中的ACP可能来自血小板、红细胞、白细胞及破骨细胞等。 2.ACP测定主要用于诊断前列腺癌。前列腺癌时血清 ACP活力显著升高，转移性患者升高更加显著。 3．急性尿潴留、变形性骨炎、癌肿骨转移及甲亢时 ACP可轻度升高。此外，慢性粒细胞性白血病时，ACP同工 酶中的前列腺ACP(PAP）增高，而戈谢病、尼曼匹克病、 网状内皮细胞白血病或毛细胞白血病均为非PAP增高。是 否为抗酒石酸盐的非PAP增高为毛细胞性白血病的重要鉴 别要点。
NADH在340nm处有特征吸收峰，连续监测NADH消耗引起的 340nm吸光度变化,根据340nm处吸光度下降速率（－△A/min） 计算ALT活性
（二）定时比色法（两点法）
国内采用的比色测定法有三种： 赖氏法（30min） 金氏法（60min） 改良穆氏法（30min） 三种方法的原理、试剂、操作步骤和酶作用温度 都相似，单位定义和标准曲线绘制方法有差异。
以苄胺为底物，在O2和H2O参与下，MAO催化生成苄醛、NH3和 H2O2，产生的NH3再在谷氨酸脱氢酶催化下，与α-酮戊二酸 和NADH反应，生成谷氨酸和NAD+。在340nm波长下监测NADH吸 光度的下降速率，即可计算出MAO活力。
醛苯腙法
底物苄胺在MAO作用下氧化生成苄醛，苄醛与2，4-二硝基苯肼 反应生成醛苯腙，在碱性溶液中呈红棕色，在470nm比色测定。
Badson改良法
• ACP催化α-萘基磷酸盐，在pH4.5~6.0的条件 下释放无机磷酸盐。产物α-萘酚则偶联有色 的偶氮试剂，通过在450nm处监测偶氮化合 物生成的速率来测定ACP的活性。 • 反应式： ACP（pH5.3）
胰脂肪酶
〈一〉概念1.脂肪酶简介脂肪酶(1ipase EC 3．1．1．3)全称为甘油三酯基水解酶，是一类特殊的酯基水解酶。
其相对分子量在20-100KD变化。
脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。
脂肪酶催化水解反应的特征在于，酶是溶于水的，而底物却不溶于水，因此催化反应只能在油水接触的界面上，是一种专门在异相系统(油—水)界面上水解特殊酯(脂肪酸甘油酯)类的酶。
2.脂肪酶的催化机理脂肪酶的活性催化部位主要由一个催化三联体(Triad)构成：即组氦酸(His)、色氨酸(ser)和天冬氨酸(Asp)。
通常情况下，脂肪酶的活性中心丝氨酸残基的侧链构象空间结构方面与丝氨酸蛋白酶的非常相似．所不同的是脂肪酶的活性中心隐藏在蛋白质内部，而被不同的“盖子”所覆盖。
脂肪酶的特殊的结构特点导致其特有的应用价值。
脂肪酶区别于其他酯酶主要在于脂肪酶作用于油—水界面，而且表现出特有的界而活性(interracial activation)3．脂肪酶的几点说明（1）.脂肪酶是由生物细胞产生的具有催化活性的蛋白质，对环境十分敏感，物理因素、化学因素和生物因素的变化均有可能导致酶活力的丧失。
因此人们普遍采用固定化酶的方法对酶进行修饰，以提高生物酶的经济价值。
(2).在酶蛋白的高级结构中，为了保持氢键、疏水键、离子键等比较弱的键，在固定化时，应避免高温、强酸、强碱处理。
此外，有机溶液、浓的盐类有时也会使酶失活，所以应在极其缓和的条件下进行固定化4.胰脂肪酶胰脂肪酶是水解膳食脂肪的最重要的酶, 等电点为5.0的酸性蛋白分子。
可水解50% ~70%的食物脂肪。
通过抑制胰脂肪酶活性可以控制高血脂。
猪胰脂肪酶(PPL)分子粒径为4.6×2.6×1.1 nm3 ，固本实验需要合成的介孔材料孔径大小可在7-8nm之间。
〈二〉实验1..猪胰脂肪酶的固定化方法吸附法、交联法、包埋法和共价偶联法四种吸附法：在50 ml带塞锥形瓶中，称取40 mg棒状介孔材料SBA-15，加入2 mg.ml-1的酶液20ml(用缓冲溶液配置)，盖上瓶口以防止挥发。