单纯疱疹1型病毒_HSV1_IgM抗体ELISA试剂盒的研制_邓文
单纯疱疹病毒Ⅰ型IgM抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)
单纯疱疹病毒Ⅰ型IgM抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）【产品名称】单纯疱疹病毒Ⅰ型IgM抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）。
【用途】利用酶联免疫吸附法（ELISA）定性检测人血清或血浆中的风疹病毒（RV）IgM抗体，适用于人类风疹病毒感染的辅助诊断。
【预期用途】利用酶联免疫吸附法（ELISA）定性检测人血清或血浆中的单纯疱疹病毒Ⅰ型IgM抗体，使用于单纯疱疹病毒Ⅰ型感染的辅助诊断。
【试验原理】本试剂盒采用捕获法原理检测人血清或血浆样品中风疹病毒IgM抗体（RV-IgM），微孔中预包被鼠抗人-IgM（U-链），首先加入待测标本的血清或血浆样品后，样品中的IgM抗体都可被捕获，为结合的其他成分（包括特异的IgG 抗体）请被洗涤除去，第二步，加入RV抗原酶标记物，被捕获的IgM中的RV-IgM 会与来更过氧化物酶标记的RV重组抗原特异性的结合，洗去其它未结合物，做好用TMB底物显色。
通过酶标仪检测吸光度（A值）从而判定样品中的RV-IgM 抗体的存在与否。
【主要组成成分】可以拆开使用。
包被板由板条和板架组成，与含有干燥剂的铝箔袋密封。
未使用完的微孔条与干燥剂一起放在塑料袋中放置于2-8℃保存，包被板放置与自封袋保存后，减少开封次数，不良的保存条件将缩短稳定期。
2 RV-IgM阳性对照 1支（0.5ml），主要成分为蛋白缓冲稀释液稀释的RV-IgM抗体，含稳定剂、防腐剂。
3 RV-IgM阳性对照 1支（0.5ml），主要成分为蛋白缓冲稀释液稀释的正常人血清，检测无RV-IgM抗体反应，含稳定剂、防腐剂。
4酶标工作液1瓶（3ml/6ml），主要成分为辣根过氧化物酶标记的RV重组抗原，含稳定剂。
5 浓缩洗涤液（20×）1瓶（20ml/50ml），为无色液体，成分为磷酸缓冲液和吐温20。
用前用蒸馏水或去离子水按照1:20的比例稀释。
6 底物液A 1瓶（3ml/6ml），为无色液体，主要成分为过氧化物。
7 底物液B 1瓶（3ml/6ml），为无色液体，主要成分为TMB。
抗单纯疱疹病毒1型的IgY制备及其生物学活性检测
抗单纯疱疹病毒1型的IgY制备及其生物学活性检测苏海涛;翟玥;宋秀玲;徐坤【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2024(50)2【摘要】目的目的:制备抗单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的卵黄抗体(IgY),探讨该抗体的生物学活性,阐明其抗HSV-1的能力。
方法方法:制备HSV-1灭活疫苗,采用鸡胸多点注射法免疫高产蛋鸡,采用聚乙二醇-6000(PEG-6000)法提纯IgY,采用间接ELISA法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术和蛋白浓度定量试剂盒测定IgY效价、纯度及蛋白水平,采用间接ELISA法检测IgY中和病毒的能力,测定病毒阻断率,以Vero细胞为病毒感染靶细胞,测定不同抗体浓度(0.01560、0.03125、0.06250、0.12500、0.50000、和1.00000 g·L^(-1))作用后细胞病变效应(CPE),根据CPE程度测定IgY体外抗HSV-1能力。
结果结果:制备的IgY效价随免疫时间逐渐升高,达到1/1024000后保持稳定;IgY轻链重链条带清晰;IgY平均蛋白水平为11.544 g·L^(-1);IgY对HSV-1的阻断率可高达77.90%;HSV-1致CPE程度随抗体浓度升高而逐渐降低,当IgY浓度达到0.50000g·L^(-1)及以上时,25%以下细胞(甚至无细胞)发生病变。
结论结论:成功制备出抗HSV-1的IgY,该抗体对HSV-1具有明显的中和阻断能力和体外抑制活性,可用于药物及诊断方法的开发。
【总页数】7页(P303-309)【作者】苏海涛;翟玥;宋秀玲;徐坤【作者单位】吉林省疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所;吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室;湖南师范大学医学院食品与营养卫生教研室【正文语种】中文【中图分类】S852.43【相关文献】1.抗变链球菌鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的制备及活性检测2.抗副溶血弧菌IgY的制备及活性检测3.抗幽门螺杆菌蛋黄免疫球蛋白IgY的制备及生物活性的研究4.抗HPV16L1 IgY抗体的制备及活性检测5.抗I型幽门螺杆菌IgY和黄连及太子参联合抗活性空泡细胞毒素A^+和细胞毒素相关蛋白A^+幽门螺杆菌的实验因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
单纯疱疹病毒Ⅰ型IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)
【储存条件及有效期】
本试剂盒储存于 2-8 ℃，有效期 15 个月。
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单纯疱疹病毒Ⅰ型 IgG 抗体检测试剂盒（酶联免疫法）
【适用仪器】
A. 适用于各种酶标仪及洗板机。
B. 与试剂盒联合使用的设备与工具
1. 必须用标有刻度的微量移液器移取实验所要求的 确切体积，微量移液器应进行校准以确保移液的准 确性。而且必须对可能与样品接触的部分进行常规 消毒（家用酒精、10％漂白剂溶液，医用消毒剂）， 并对微量移液器进行常规维护，以确保 1％的精密度 与+/-2％的准确度。对试剂盒成分的残留液或流出液 进行常规消毒。 2. 必须将 ELISA 用孵育箱设为+37℃（耐受误差为 +/-0.5℃）。并作常规检查以确保培养箱维持在正确 温度。经确认干燥培养箱与水浴可用于 ELISA 试验 后，这两种设备才可适合于孵育。若经确认，干燥 培养箱与水浴孵育箱均可用于 ELISA 试验的孵育。 3. ELISA 洗板机对整个试验操作非常重要。在采用 试剂盒进行实验室常规实验之前，必须采用试剂盒 对照品与参考仪表认真验证洗板机，使其最优化。 4-5 次清洗（吸取并加入 350 微升/孔清洗液为一次 清洗）足以确保实验按预期进行。建议两次清洗之 间的浸泡时间为 20-30 秒。为了确切设定清洗次数， 建议采用试剂盒对照品、已明确的阴性及阳性参考 样品进行一次实验，检查与“实验验证”部分及“实验 性能”部分所报道值的匹配程度。按照生产商说明 书，定期校准加液体积并维护洗板机（消毒并清洗 针头）。 4. 孵育时间允许误差为±5％。 5. 必须配备 450 纳米波长的 ELISA 酶标仪，更为理 想的是，配备双波长（620-630 纳米）以供空白校准 之用。读数仪的标准性能应为：（a）带宽≤10 纳米； （b）吸光度范围为：从 0～≥2.0； （c）线性≥2.0； 重复性≥1％。对“实验操作”中空白的设置将在“实验 程序”中详述。必须对读数仪中的光学系统进行常规 校准，以确保所测量光密度值的正确性。应按生产 商说明书对读数仪进行常规维护。 6. 当采用 ELISA 自动化设备时，为了与“确认实验” 与“性能测试”中所描述的值相匹配，必须对所有关 键性步骤（移液、孵育、洗涤、读数、数据处理） 进行认真设定、校准、控制并进行常规维护。实验 程序应该安装于每个操作单元系统中，如洗板机和
一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒[发明专利]
![一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/c01e7b164a35eefdc8d376eeaeaad1f347931152.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010053051.6(22)申请日 2020.01.17(71)申请人 郑州安图生物工程股份有限公司地址 450000 河南省郑州市经济技术开发区经北一路87号(72)发明人 胡明明 张学增 王义聪 王玮 李振红 付光宇 杨增利 苗拥军 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限公司 11227代理人 潘颖(51)Int.Cl.C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6848(2018.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒(57)摘要本发明提供了一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒，该试剂盒包括PCR反应液1、PCR反应液2、阴性对照和阳性对照；PCR反应液1包括：HSV -1型上游引物、下游引物、荧光探针；HSV -2型上游引物、下游引物、荧光探针；DNA聚合酶，尿嘧啶DNA糖基化酶，dNTP，PCR缓冲物，PCR扩增增强剂，防腐剂，水；PCR反应液2包括醋酸锰、防腐剂、水。
本发明操作方便，试剂2-8℃保存，检测灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速。
采用本发明试剂盒可以实现单管对单纯疱疹病毒1型和2型特异性DNA核酸片段同时进行分型荧光PCR定性检测，为诊断单纯疱疹病毒感染提供可靠的分子诊断依据。
权利要求书2页 说明书13页序列表2页 附图5页CN 111172323 A 2020.05.19C N 111172323A1.一种单纯疱疹病毒1型和2型分型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR 反应液1、PCR反应液2、阳性对照和阴性对照；所述PCR反应液1包括：如SEQ ID NO：1所示的HSV-1型上游引物，如SEQ ID NO：2所示的HSV-1型下游引物，如SEQ ID NO：3所示的HSV-1型荧光探针；如SEQ ID NO：4所示的HSV-2型上游引物，如SEQ ID NO：5所示的HSV-2型下游引物，如SEQ ID NO：6所示的HSV-2型荧光探针；DNA聚合酶，尿嘧啶DNA糖基化酶，dNTP，PCR缓冲物，PCR扩增增强剂，防腐剂，水；所述PCR反应液2包括：醋酸锰、防腐剂和水。
一种检测单纯疱疹病毒1+2型IgM抗体的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法[发明专利]
![一种检测单纯疱疹病毒1+2型IgM抗体的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/7ddb45d818e8b8f67c1cfad6195f312b3169ebc0.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010985647.X(22)申请日 2020.09.18(71)申请人 迪瑞医疗科技股份有限公司地址 130103 吉林省长春市高新区宜居路3333号(72)发明人 高智玲 翟涛 张旭东 李冬梅 孙成艳 高威 何浩会 (74)专利代理机构 长春众邦菁华知识产权代理有限公司 22214代理人 周蕾(51)Int.Cl.G01N 33/569(2006.01)G01N 33/543(2006.01)G01N 33/532(2006.01)G01N 21/76(2006.01)(54)发明名称一种检测单纯疱疹病毒1+2型IgM抗体的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法(57)摘要本发明涉及一种检测单纯疱疹病毒1+2型IgM抗体的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法，属于免疫分析技术领域。
本发明化学发光免疫分析试剂盒，包括R1试剂含有单纯疱疹病毒1型抗原包被的磁珠和人单纯疱疹病毒2型抗原包被的磁珠的缓冲液；R2试剂含有化学发光标记物标记的抗人IgM抗体的缓冲液；R3试剂含有阻断剂和人IgG吸附剂的缓冲液。
本发明的试剂盒为化学发光免疫分析法，该方法具有种操作简单，检测范围宽及其检测时间短，无需酶参与，精准定量，并且可以对抗原、抗体类目标物质进行检测；另一方面，单纯疱疹病毒1+2型IgM化学发光免疫测试剂盒与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度与准确度。
权利要求书2页 说明书10页 附图1页CN 112213483 A 2021.01.12C N 112213483A1.一种检测单纯疱疹病毒1+2型IgM抗体的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，包括：R1试剂、R2试剂和R3试剂；所述R1试剂为含有单纯疱疹病毒1型抗原包被的磁珠和人单纯疱疹病毒2型抗原包被的磁珠的缓冲液；所述R2试剂为含有化学发光标记物标记的抗人IgM抗体的缓冲液；所述R3试剂为含有阻断剂和人IgG吸附剂的缓冲液。
用于诊断和治疗单纯疱疹病毒1和2型的蛋白质抗原的方法和组合物[发明专利]
![用于诊断和治疗单纯疱疹病毒1和2型的蛋白质抗原的方法和组合物[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b27cfa0c5627a5e9856a561252d380eb62942335.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.10.01C N 104080477A (21)申请号 201280042725.6(22)申请日 2012.06.2961/503,790 2011.07.01 USA61K 39/395(2006.01)A61P 31/12(2006.01)A61P 31/00(2006.01)(71)申请人因波特医疗股份有限公司地址美国加利福尼亚州(72)发明人 D.H.戴维斯 X.梁 P.菲尔格纳(74)专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人张文辉(54)发明名称用于诊断和治疗单纯疱疹病毒1和2型的蛋白质抗原的方法和组合物(57)摘要涵盖的组合物、装置和方法涉及来自单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的多种抗原及其在疫苗、治疗剂和各种诊断测试中的用途。
在特别优选的方面，抗原是免疫显性的，并且就病原体感染的群体的血清而言具有量化且已知的相对反应性，和/或具有已知的与疾病参数的关联。
(30)优先权数据(85)PCT国际申请进入国家阶段日2014.03.03(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2012/044814 2012.06.29(87)PCT国际申请的公布数据WO2013/006401 EN 2013.01.10(51)Int.Cl.权利要求书2页 说明书17页 附图5页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书17页 附图5页(10)申请公布号CN 104080477 A1.一种抗原组合物，其包含：多种与载体结合的抗体反应性抗原，其中至少两种所述抗原就受HSV-1感染的群体的血清而言具有量化且已知的相对抗体反应性；其中所述至少两种抗原具有已知的与疾病参数的关联；且其中所述多种抗原选自下组：US3,US6,US8,US9,UL7,UL20,UL22,UL36和UL44，或其片段。
一种单纯疱疹病毒1型实时定量PCR检测试剂盒[发明专利]
![一种单纯疱疹病毒1型实时定量PCR检测试剂盒[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/3abf542c11a6f524ccbff121dd36a32d7375c7d8.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010842867.7(22)申请日 2020.08.20(71)申请人 浙江大学地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号(72)发明人 姚玉峰 许叶圣 郑利斌 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公司 33200代理人 万尾甜 韩介梅(51)Int.Cl.C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01)(54)发明名称一种单纯疱疹病毒1型实时定量PCR检测试剂盒(57)摘要本发明公开了一种单纯疱疹病毒1型实时定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒是针对以HSV1的UL40基因为靶目标，包括HSV1的特异性引物和特异性探针、阳性对照、阴性对照、2×PCRMix、无RNase水；通过从病人眼部采集泪液、角膜感染部位刮取得组织、房水或玻璃体液等标本，能够快速，准确的形成病原学检测，同时对病毒载量实时监控，从而实现对患者的精准诊治，具有高灵敏性、高特异性、经济、简便、快速的特点。
权利要求书1页 说明书9页序列表1页 附图4页CN 112063751 A 2020.12.11C N 112063751A1.一种单纯疱疹病毒1型实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒是针对以HSV1的UL40基因为靶目标的，包括HSV1的特异性引物和特异性探针、阳性对照、阴性对照、2×PCR Mix、无RNase水；所述的HSV1的特异性引物和特异性探针为：上游引物：5’-CCCCTGCTGCCATGGATTC -3’下游引物：5’-GGGCACTTTGGAATCTGGA -3’探针：5’-TGGCAACGCGGCCCAAC -3’所述探针的5’端有用荧光染料标记的荧光报告基团，3’端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团。
两种ELISA试剂检测单纯疱疹病毒的结果分析
两种ELISA试剂检测单纯疱疹病毒的结果分析方有兵;王恩兰;肖春红【期刊名称】《临床输血与检验》【年(卷),期】2012(014)003【摘要】目的比较两种试剂检测HSV抗体的差异.方法两种ELISA试剂分别检测45份标本中的HSV1-IgG、HSV1-IgM、HSV2-IgG和HSV2-IgM,比较其检出率.结果 HSV1-IgG、HSV2-IgG的检出率在两试剂间的差异无统计学意义；HSV1-IgM、HSV2-IgM的检出率两试剂的差异有统计学意义；Trinity试剂检测HSV1-IgM和HSV2-IgM阳性结果有重叠.结论此两种ELISA试剂检测HSV-IgG可稳定地应用于流行病学调查,而临床检出HSV-IgM抗体阳性需结合其他检测方法或临床症状综合应用.【总页数】2页(P262-263)【作者】方有兵;王恩兰;肖春红【作者单位】230022 安徽医科大学第一附属医院检验科;230022 安徽医科大学第一附属医院检验科;230022 安徽医科大学第一附属医院检验科【正文语种】中文【中图分类】R373;R446.6【相关文献】1.使用两种ELISA试剂检测无偿献血者抗——HCV的结果分析 [J], 沈萍;黄林莎2.沧州市中心血站使用两种国产 ELISA 试剂对血液筛查的结果分析 [J], 薛文颖;刘宁;魏超;鞠坤3.ELISA法检测性病门诊生殖器糜烂、溃疡患者单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSVⅡ)感染情况及其结果分析 [J], 李粉莲4.两种ELISA试剂检测献血者HBsAg结果分析 [J], 王佳维5.两种ELISA试剂检测献血者抗人类嗜T淋巴细胞白血病病毒-Ⅰ/Ⅱ抗体结果分析[J], 周晓真; 林洪铿; 涂东晋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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单纯疱疹1型病毒(HSV1)IgM抗体ELISA试剂盒的研制邓 文1,江 敏2(1.泰山医学院基础部,山东泰安 271000;2.济南市儿童医院,山东济南 250052)摘要:目的 建立快速、敏感、特异性好的抗单纯疱疹1型病毒(HSV1)IgM的检测方法。
方法 制备纯化抗原及单抗,对间接EL ISA法检测人单纯疱疹1型病毒(HSV1)IgM抗体方法进行了优化改良,并对随机选择的331份临床孕妇血清标本进行了检测,用德国DIM A HSV1-I gM ELISA试剂与本试剂同时比较。
结果 本试剂盒的敏感性、特异性和诊断指数分别为82.1%,93.5%和175.6%,与德国试剂的符合率为92.1%。
结论 本试剂的质量与国外商品试剂相似,具有较好的特异性和敏感性,可广泛应用于临床优生优育检测。
关键词:HSV1;IgM;ELISA中图分类号:R392-33 文献标识码:A 文章编号:1004-7115(2005)02-0123-03An indirect ELISA method for HSV1-IgMDENG Wen1,J IAN G Min2(1.Taishan M edical College,Taian271000,China;2.Jinan Children Hospital,Jinan250052,China)A bstract:Objective:To improve the efficiency of the HSV1-IgM indirect EL ISA kit.Methods:T he HSV1-Ig M test kit w as developed by using material of our lab by indirect EL ISA.T he serum of331preg nant wo men w ere assayed in g ood condition with this new kit.The results were analy zed and compared w ith those of the D IM A HSV1-IgM ELISA kit produced by Germany.Results:T he sensitivity,specificity and diag nostic indexes were82.1%,93.5%and175.6%re-spectively.T he consistent results of tw o kits were at the rate of92.1%.Co nclusion:The quality of the new kit is as good as that of G enmany and this new kit can be used in clinical test of prepo tency for its hig h quality in specificity and sensitiv-ity.Key words:HSV1;I gM;EL ISA 单纯疱疹病毒(HSV)是To RCH中的一种,有两个血清型,单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(HSV-2)。
HSV-1主要引起腰部以上部位的病变,如水疱性口腔炎、疱疹性角膜炎、疱疹性脑炎等,由此病毒感染所致发生率约占所有脑炎的5%～20%,且病死率高达70%[1～3];妊娠期感染不仅危害母体,往往可引起宫内感染而导致流产、早产、死胎[4]。
因此ToRCH感染的早期快速诊断对防止先天畸形、提高出生人口素质、优生优育有极其重要意义。
目前关于ToRCH系列体外诊断试剂国内外虽上市,但国外产品价格昂贵,国内厂商大都是引进国外主要原料组装,其质量尚不尽人意。
我们全部用自己生产的原材料、采用间接ELISA方法研制了HSV1-IgM检测试剂,并对其产品质量进行了全面鉴定,取得了令人满意的结果。
1 材料与方法1.1 试剂1.1.1 酶标抗体 HRP标记羊抗人IgM(μ链),自制,使用前均经方阵滴定选择合适浓度。
1.1.2 甘氨酸为美国Sigm a产品,RPM L1640培养干粉为美国Gibco产品,按说明配制。
1.1.3 胰蛋白酶为美国Difco产品,用1640液配制成0.05%～0.1%,除菌后-30℃保存备用。
1.1.4 TMB显色液:TM B购自瑞典Biosynthesis,采用TMB和过氧化氢显色系统。
1.1.5 预包被板条:已包被单纯疱疹I型病毒纯化抗原,铝箔袋真空封口。
深圳立基塑料制品厂产品。
123泰 山 医 学 院 学 报JOURNAL OF TAIS HAN M EDICAL COLLEGE Vol.26 No.2 2005作者简介:邓文(1966—),女,山东泰安人,实验师,本科,主要从事免疫学实验教学与科研工作。
1.1.6 浓缩洗液、封闭液、终止液由本室配制。
1.2 病毒和细胞 HSV1SM40毒种、BHK-21传代细胞均购自中国药品生物制品检定所。
1.3 血清标本 351例血清标本采集自珠海市妇幼保健院和中山市中心血站。
阳性和阴性对照血清,应用德国DIMA公司及海泰公司HSV1-IgM试剂盒自献血员中筛选,其中阴性对照血清在450 nmOD值应<0.1;阳性对照血清OD值应>0.25。
1.4 RV抗原制备和鉴定方法 将HSV1SM40毒种接种在BHK-21原代细胞内,常规增殖培养,当观察细胞病变效应达++++以上即收集含病毒的培养液,差速离心制备抗原。
取纯化的HSV-1病毒抗原用HPLC检测,得出病毒蛋白峰和总蛋白峰,按下列公式计算病毒抗原的纯度(要求纯度≥90%):病毒纯度=病毒蛋白峰/总蛋白峰×100%。
1.5 单抗人IgM抗体的制备和鉴定 单抗人Ig M 杂交瘤株由本实验室引进保存。
按文献[5]介绍的方法制备,然后通过免疫双向扩散试验[5]鉴定特异性,免疫电泳试验[5]鉴定纯度,EIA试验[5]测定效价:用5μg/ml人IgM包被板(包被液为0.05mol/ L pH9.6的CB,封闭液为含10%小牛血清、0.05% T-20的PBS)检测,兔抗鼠IgG抗体-H RP作为酶标记物。
1.6 HSV1-Ig M间接ELISA测定法 利用HSV1可溶性抗原包板(5～10μg/m l),再加入待检血清,通过与酶标二抗结合,显色测定结果。
抗原用包被液稀释至100μg/ml,每孔加100μl,4℃过夜。
加封闭液200μl/孔4℃过夜,洗2次。
37℃过夜干板。
将待检血清1∶100稀释加至反应板孔中,100μl/孔,37℃30min,洗3次。
酶标二抗工作液每孔加入50μl,37℃作用30min,洗3次。
加显色液A、B各50μl/孔,37℃作用10min。
每孔加1滴(50μ1)2mol/L H2SO4终止反应。
以空白调零孔校正零点,测定450nm下各孔吸光度(OD)值。
计算临界值(cut off value,COV):临界值(COV)=3×(2个阴性对照OD值的平均值)。
结果判断标准:用考马斯亮蓝G-250法测定抗原蛋白含量为7.1mg/ml,总蛋白含量为37.5mg,加等体积甘油-20℃冻存备用。
纯化的单抗人IgM抗体效价为1∶40000,抗体效价高,可作标酶用。
HSV-1病毒抗原纯度=病毒蛋白峰7.7cm2/总蛋白峰8.3cm2×100%=92.7%,纯度合格。
阳性判断:标本孔平均OD值>COV为阳性;阴性判断:标本孔平均OD值<COV为阴性。
2 结 果2.1 试剂的特异性鉴定2.1.1 特异性试验 20份阴性参比品及10份阳性参比品进行检测,按使用说明书进行操作,没有出现一份假阳性和假阴性。
20份阴性参比品OD值均小于CUT OFF值(0.21)。
10份阳性参比品OD 值均大于C UT OFF值(0.21)。
2.1.2 阻断试验 用HSV1阳性病人血清,与HSV1-Ag等量混合,再做ELISA,结果A值与对照相比至少减少50%以上,见表1,HSV1-Ag与HSV1-IgM的结合是特异的。
表1 阻断试验结果标本号4111411241134114对照组A值0.6090.5780.4690.524试验组A值0.1450.1320.1120.094阻断率(%)767776822.1.3 干扰实验结果 ①HSV1阳性血清为阳性(P/N=13);阴性血清为阴性(P/N=1.2);HCMV-IgM和RV IgM阳性血清均为阴性(P/N<3.0),证明反应系统中HSV1-Ag和RV IgM和HCM V-IgM 阳性血清无交叉反应现象。
②HSV1阳性血清与抗原作用结果是,HSV1-Ag孔A值均大于0.21,P/N 值从3.2～15;而RV和HCMV-Ag孔A值均小于0.21,P/N都小于3.0,说明该系统中检测的HSV1-IgM与上述2种抗原无交叉反应。
2.1.4 类风湿因子(RF)试验结果 用RF阳性血清重复2次检测,RF对该系统无影响(P/N≤1.2)。
2.2 精密性试验结果采用3个批号的试剂,对同1份阳性标本各进行10次重复测定,并设阳性对照和阴性对照,结果CV值均小于15%,符合要求。
2.3 灵敏度试验结果以灵敏度参比品做系列稀释,用三个批号的试剂进行检测,结果Cut off值为0.21,灵敏度为>1∶160。
2.4 稳定性试验结果将试剂37℃放置6天,考核试剂的稳定性。
(1)精密性:3批试剂37℃考核6天后做精密性试验,并设阳性对照和阴性对照,结果CV值均小于15%,符合要求。
(2)特异性:对20份阴性参比品和10份阳性参比品用三个批号的试剂进行检测,结果20份阴性参比品OD值均小于C UT OFF值(0.21),无假阳性;10份阳性参比品OD值均大于CUT OFF值(0.21),无假阴性。
(3)灵敏度:以灵124泰 山 医 学 院 学 报JOURNAL OF TAISHAN M EDICAL COLLEGE Vol.26 No.2 2005敏度参比品做系列稀释,用三个批号的试剂进行检测,结果Cut off值为0.21,因此灵敏度为1∶160。
由上可知,经37℃放置6天,考核试剂盒特异性、灵敏度、精密性均能达到要求,因此稳定性合格。
2.5 与国外同类产品比较结果 对随机选择的331份临床孕妇血清标本进行了检测,用德国DI-MA HSV1-IgM ELISA试剂与本试剂进行比较,诊断结果敏感性、特异性和诊断指数分别为82.1%、93.5%和175.6%,两者符合率为92.1%,说明本试剂的质量与国外商品试剂相似,都有较好的特异性和敏感性,可广泛应用于临床优生优育检测。