单纯疱疹1型病毒_HSV1_IgM抗体ELISA试剂盒的研制_邓文

单纯疱疹1型病毒(HSV1)IgM抗体

ELISA试剂盒的研制

邓　文1,江　敏2

(1.泰山医学院基础部,山东泰安　271000;2.济南市儿童医院,山东济南　250052)

摘要:目的　建立快速、敏感、特异性好的抗单纯疱疹1型病毒(HSV1)IgM的检测方法。方法　制备纯化抗原及单抗,对间接EL ISA法检测人单纯疱疹1型病毒(HSV1)IgM抗体方法进行了优化改良,并对随机选择的331份临床孕妇血清标本进行了检测,用德国DIM A HSV1-I gM ELISA试剂与本试剂同时比较。结果　本试剂盒的敏感性、特异性和诊断指数分别为82.1%,93.5%和175.6%,与德国试剂的符合率为92.1%。结论　本试剂的质量与国外商品试剂相似,具有较好的特异性和敏感性,可广泛应用于临床优生优育检测。

关键词:HSV1;IgM;ELISA

中图分类号:R392-33　文献标识码:A　文章编号:1004-7115(2005)02-0123-03

An indirect ELISA method for HSV1-IgM

DENG Wen1,J IAN G Min2

(1.Taishan M edical College,Taian271000,China;2.Jinan Children Hospital,Jinan250052,China)

A bstract:Objective:To improve the efficiency of the HSV1-IgM indirect EL ISA kit.Methods:T he HSV1-Ig M test kit w as developed by using material of our lab by indirect EL ISA.T he serum of331preg nant wo men w ere assayed in g ood condition with this new kit.The results were analy zed and compared w ith those of the D IM A HSV1-IgM ELISA kit produced by Germany.Results:T he sensitivity,specificity and diag nostic indexes were82.1%,93.5%and175.6%re-spectively.T he consistent results of tw o kits were at the rate of92.1%.Co nclusion:The quality of the new kit is as good as that of G enmany and this new kit can be used in clinical test of prepo tency for its hig h quality in specificity and sensitiv-ity.

Key words:HSV1;I gM;EL ISA

单纯疱疹病毒(HSV)是To RCH中的一种,有两个血清型,单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(HSV-2)。HSV-1主要引起腰部以上部位的病变,如水疱性口腔炎、疱疹性角膜炎、疱疹性脑炎等,由此病毒感染所致发生率约占所有脑炎的5%～20%,且病死率高达70%[1～3];妊娠期感染不仅危害母体,往往可引起宫内感染而导致流产、早产、死胎[4]。因此ToRCH感染的早期快速诊断对防止先天畸形、提高出生人口素质、优生优育有极其重要意义。目前关于ToRCH系列体外诊断试剂国内外虽上市,但国外产品价格昂贵,国内厂商大都是引进国外主要原料组装,其质量尚不尽人意。我们全部用自己生产的原材料、采用间接ELISA方法研制了HSV1-IgM检测试剂,并对其产品质量进行了全面鉴定,取得了令人满意的结果。

1　材料与方法

1.1　试剂

1.1.1　酶标抗体　HRP标记羊抗人IgM(μ链),自制,使用前均经方阵滴定选择合适浓度。

1.1.2　甘氨酸为美国Sigm a产品,RPM L1640培养干粉为美国Gibco产品,按说明配制。

1.1.3　胰蛋白酶为美国Difco产品,用1640液配制成0.05%～0.1%,除菌后-30℃保存备用。

1.1.4　TMB显色液:TM B购自瑞典Biosynthesis,采用TMB和过氧化氢显色系统。

1.1.5　预包被板条:已包被单纯疱疹I型病毒纯化抗原,铝箔袋真空封口。深圳立基塑料制品厂产品。

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泰　山　医　学　院　学　报

JOURNAL OF TAIS HAN M EDICAL COLLEGE　Vol.26　No.2　2005

作者简介:邓文(1966—),女,山东泰安人,实验师,本科,主要从事免疫学实验教学与科研工作。

1.1.6　浓缩洗液、封闭液、终止液由本室配制。

1.2　病毒和细胞　HSV1SM40毒种、BHK-21传代细胞均购自中国药品生物制品检定所。

1.3　血清标本　351例血清标本采集自珠海市妇幼保健院和中山市中心血站。阳性和阴性对照血清,应用德国DIMA公司及海泰公司HSV1-IgM试剂盒自献血员中筛选,其中阴性对照血清在450 nmOD值应<0.1;阳性对照血清OD值应>0.25。

1.4　RV抗原制备和鉴定方法　将HSV1SM40毒种接种在BHK-21原代细胞内,常规增殖培养,当观察细胞病变效应达++++以上即收集含病毒的培养液,差速离心制备抗原。取纯化的HSV-1病毒抗原用HPLC检测,得出病毒蛋白峰和总蛋白峰,按下列公式计算病毒抗原的纯度(要求纯度≥90%):病毒纯度=病毒蛋白峰/总蛋白峰×100%。

1.5　单抗人IgM抗体的制备和鉴定　单抗人Ig M 杂交瘤株由本实验室引进保存。按文献[5]介绍的方法制备,然后通过免疫双向扩散试验[5]鉴定特异性,免疫电泳试验[5]鉴定纯度,EIA试验[5]测定效价:用5μg/ml人IgM包被板(包被液为0.05mol/ L pH9.6的CB,封闭液为含10%小牛血清、0.05% T-20的PBS)检测,兔抗鼠IgG抗体-H RP作为酶标记物。

1.6　HSV1-Ig M间接ELISA测定法　利用HSV1可溶性抗原包板(5～10μg/m l),再加入待检血清,通过与酶标二抗结合,显色测定结果。抗原用包被液稀释至100μg/ml,每孔加100μl,4℃过夜。加封闭液200μl/孔4℃过夜,洗2次。37℃过夜干板。将待检血清1∶100稀释加至反应板孔中,100μl/孔,37℃30min,洗3次。酶标二抗工作液每孔加入50μl,37℃作用30min,洗3次。加显色液A、B各50μl/孔,37℃作用10min。每孔加1滴(50μ1)2mol/L H2SO4终止反应。以空白调零孔校正零点,测定450nm下各孔吸光度(OD)值。计算临界值(cut off value,COV):临界值(COV)=3×(2个阴性对照OD值的平均值)。

结果判断标准:用考马斯亮蓝G-250法测定抗原蛋白含量为7.1mg/ml,总蛋白含量为37.5mg,加等体积甘油-20℃冻存备用。纯化的单抗人IgM抗体效价为1∶40000,抗体效价高,可作标酶用。HSV-1病毒抗原纯度=病毒蛋白峰7.7cm2/总蛋白峰8.3cm2×100%=92.7%,纯度合格。阳性判断:标本孔平均OD值>COV为阳性;阴性判断:标本孔平均OD值

2.1　试剂的特异性鉴定

2.1.1　特异性试验　20份阴性参比品及10份阳性参比品进行检测,按使用说明书进行操作,没有出现一份假阳性和假阴性。20份阴性参比品OD值均小于CUT OFF值(0.21)。10份阳性参比品OD 值均大于C UT OFF值(0.21)。

2.1.2　阻断试验　用HSV1阳性病人血清,与HSV1-Ag等量混合,再做ELISA,结果A值与对照相比至少减少50%以上,见表1,HSV1-Ag与HSV1-IgM的结合是特异的。

表1　阻断试验结果

标本号4111411241134114对照组A值0.6090.5780.4690.524

试验组A值0.1450.1320.1120.094

阻断率(%)76777682

2.1.3　干扰实验结果　①HSV1阳性血清为阳性(P/N=13);阴性血清为阴性(P/N=1.2);HCMV-IgM和RV IgM阳性血清均为阴性(P/N<

3.0),证明反应系统中HSV1-Ag和RV IgM和HCM V-IgM 阳性血清无交叉反应现象。②HSV1阳性血清与抗原作用结果是,HSV1-Ag孔A值均大于0.21,P/N 值从3.2～15;而RV和HCMV-Ag孔A值均小于0.21,P/N都小于3.0,说明该系统中检测的HSV1-IgM与上述2种抗原无交叉反应。

2.1.4　类风湿因子(RF)试验结果　用RF阳性血清重复2次检测,RF对该系统无影响(P/N≤1.2)。

2.2　精密性试验结果

采用3个批号的试剂,对同1份阳性标本各进行10次重复测定,并设阳性对照和阴性对照,结果CV值均小于15%,符合要求。

2.3　灵敏度试验结果

以灵敏度参比品做系列稀释,用三个批号的试剂进行检测,结果Cut off值为0.21,灵敏度为>1∶160。

2.4　稳定性试验结果

将试剂37℃放置6天,考核试剂的稳定性。

(1)精密性:3批试剂37℃考核6天后做精密性试验,并设阳性对照和阴性对照,结果CV值均小于15%,符合要求。(2)特异性:对20份阴性参比品和10份阳性参比品用三个批号的试剂进行检测,结果20份阴性参比品OD值均小于C UT OFF值(0.21),无假阳性;10份阳性参比品OD值均大于CUT OFF值(0.21),无假阴性。(3)灵敏度:以灵

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